蒿本內(nèi)酯對急性肺損傷大鼠的肺泡灌洗液中TNF-α IL-1β的影響

朱詩乒 蔡宛如★

蒿本內(nèi)酯對急性肺損傷大鼠的肺泡灌洗液中TNF-α IL-1β的影響

朱詩乒 蔡宛如★

目的 通過動物實(shí)驗(yàn)評價(jià)當(dāng)歸有效成分蒿本內(nèi)酯對急性肺損傷（ALI）的保護(hù)作用，探討其防治ALI的作用機(jī)制。方法 SD大鼠40只隨機(jī)分為四組：空白對照組、模型組、溶劑組、蒿本內(nèi)酯組，每組各10只。采用氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素法制備ALI大鼠模型，溶劑組腹腔注射脂肪乳，單體組腹腔注射劑量為10mg/kg，在造模前24h，造模，造模后24h內(nèi)行腹腔注射給藥，空白對照組不作任何處理。在造模后48h采集標(biāo)本，并且行肺組織HE染色，進(jìn)行肺泡灌洗液（BALF）中總細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測其總蛋白含量及乳酸脫氫酶（LDH），采用酶聯(lián)免疫法檢測大鼠支氣管BALF中TNF-α、IL-1β的含量。結(jié)果 與模型組和溶劑組比較，蒿本內(nèi)酯顯著減輕肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、肺間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚、肺泡腔破壞程度，并且可以降低BALF中的總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比值、總蛋白含量及TNF-α和IL-1β水平（P＜0.05）。其對BALF中的LDH影響不明顯（P＞0.05）。結(jié)論 蒿本內(nèi)酯對ALI的治療作用可能和其降低肺組織中TNF-α、IL-1β等重要促炎因子水平從而達(dá)到降低BALF中的總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比值以及總蛋白含量有關(guān)。

急性肺損傷 大鼠 蒿本內(nèi)酯 腫瘤壞死因子-α 白介素-1β

急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性呼吸衰竭。ALI/ARDS是呼吸科較為常見的危重癥，病死率極高，達(dá)30%～70%［1，2］。前期的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)中藥當(dāng)歸或其復(fù)方中藥制劑可以顯著減輕肺損傷大鼠肺泡結(jié)構(gòu)的破壞、炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕肺泡間隔水腫出血［3，4］。但是，復(fù)方湯劑的不穩(wěn)定性及單體的多樣性限制其對ALI具體的藥物靶點(diǎn)及更深層次的保護(hù)機(jī)制。蒿本內(nèi)酯是中藥當(dāng)歸的主要活性成分，蒿本內(nèi)酯可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NF-kB的激活，從而抑制炎癥因子的釋放從而發(fā)揮抗炎的作用，但是其在ALI方面的研究尚未見報(bào)道。本研究擬通過動物實(shí)驗(yàn)來評價(jià)蒿本內(nèi)酯對ALI的保護(hù)作用，探討其防治ALI的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體重（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物和試劑 脂多糖（sigma公司進(jìn)口分裝）；異氟烷（魯南貝特制藥有限公司）；炎癥因子ELISA試劑盒（美國RND公司進(jìn)口分裝）；98%分析純蒿本內(nèi)酯（上海金穗生物科技有限公司）；脂肪乳（250ml：50g大豆油，3g卵磷脂）；TNF-α、IL-1βELISA試劑盒進(jìn)口分裝（聯(lián)科生物有限公司）；Bradford 法蛋白濃度定量試劑盒（聯(lián)科生物有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（聯(lián)科生物有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠灌胃器、燒杯、電子天平；液態(tài)霧化吸入裝置；高速低溫離心機(jī)；酶標(biāo)儀；37℃孵育箱；-20℃冰箱；-70℃冰箱；電爐、切片機(jī)：Leica2135、自動脫水機(jī)：Tissue-Tek Vip、自動包埋機(jī)：Tissue-Tek Tec、顯微鏡：Olympus Bx50 40。

1.4 動物分組及模型建立 40只大鼠隨機(jī)分為四組：空白對照組、模型組、溶劑組、蒿本內(nèi)酯組，每組各10只。除了空白對照組外，其余各組均進(jìn)行ALI造模。造模方法：通過液態(tài)霧化吸入裝置將異氟烷霧化，霧化麻醉SD大鼠，將老鼠頸部除毛，用碘酒擦拭消毒。在距大鼠環(huán)狀軟骨約0.5cm處作約0.3cm切口，分離氣管；將脂多糖（LPS）配置成3mg/ml溶液，用1ml針筒吸取LPS溶液，按照1.5mg/kg劑量，緩慢注射入老鼠氣管中。然后，迅速將切口縫合，再次用碘酒將切口消毒。并將老鼠左右上下?lián)u晃，讓LPS溶液均勻分布于SD大鼠肺組織中，約1～2min后，老鼠復(fù)蘇?？瞻讓φ战M不作任何處理。

1.5 給藥方法 將蒿本內(nèi)酯溶解于脂肪乳劑中，配置成1mg/ml溶液，在造模前24h，造模，造模后24h內(nèi)行腹腔注射給藥，給藥劑量為10mg/kg。

1.6 標(biāo)本采集 在造模后48h后，腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠（劑量為3ml/kg），采集標(biāo)本。（1）支氣管肺泡灌洗液（BALF）：打開雙側(cè)胸腔，分離氣管及肺組織，于氣管隆突上方約1cm處作一小切口后插入22號套管針，用無菌手術(shù)縫合線進(jìn)行固定，結(jié)扎左肺上主支氣管，行右側(cè)及左下側(cè)支氣管肺泡灌洗。注入生理鹽水3ml，反復(fù)抽吸3次，回收BALF約2ml左右，回收率65%～70%，將灌洗后的肺泡液搖勻，抽取10μl后稀釋3倍，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行BALF總細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)；將剩余的BALF加入離心管中，低速離心機(jī)3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存；將細(xì)胞沉淀涂片，進(jìn)行瑞氏染色，進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。（2）組織：取左肺上葉分剪三段，用于HE染色。

1.7 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測及方法 （1）組織病理檢查：肺組織經(jīng)10%福爾馬林溶液固定24h后加入全自動脫水機(jī)脫水、透明、浸蠟。經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后進(jìn)行HE染色，最終經(jīng)中性樹膠封固并在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。（2）BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)：①細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)：將搖勻后的肺泡細(xì)胞灌洗液吸出10μl并稀釋3倍，用計(jì)數(shù)板四大格計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，通過公式計(jì)算BALF液中的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=四大格細(xì)胞總數(shù)×4×3÷104。②細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：將離心后的細(xì)胞沉渣用移液槍吸出約1ml，平鋪于載玻片上，待其風(fēng)干后，進(jìn)行瑞氏染色，計(jì)算其中性粒細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞數(shù)及單核細(xì)胞比例。（3）大鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機(jī)3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經(jīng)解凍后，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測大鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量。（4）BALF中總蛋白含量的測定：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機(jī)3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經(jīng)解凍后，采用Bradford 法蛋白濃度定量試劑盒檢測大鼠BALF中總蛋白含量。（5）BALF中乳酸脫氫酶（LDH）的測定：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機(jī)3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經(jīng)解凍后，按LDH測定試劑盒說明書，取樣本10pl，加入各試劑，混勻后在37℃水浴中保溫30min，在340nm處讀取初始吸光度，同時(shí)開始記時(shí)，在精確1、2、3min時(shí)，分別讀取吸光度，確定每分鐘平均吸光度變化（△A/min），計(jì)算樣本中LDH的活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，予以方差齊性檢驗(yàn)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素組間方差分析t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色鏡下觀察結(jié)果 （1）空白組：未見明顯改變，肺泡結(jié)構(gòu)多數(shù)保持完整，肺泡壁無水腫，肺間質(zhì)少見炎性細(xì)胞浸潤。（2）模型組：肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)少量炎性細(xì)胞，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔結(jié)構(gòu)破壞、融合，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)炎性出血。（3）溶劑組：肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)少量炎性細(xì)胞，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔結(jié)構(gòu)破壞、融合，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)炎性出血。（4）蒿本內(nèi)酯干預(yù)組：肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，肺泡腔破壞程度均比模型組有所減輕，各組間比較不明顯。見圖1。

圖1 各組HE染色結(jié)果

2.2 各組大鼠BALF總細(xì)胞數(shù)比較 見表1。

表1 各組大鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)比較［個(gè)/ml，（±s）］

表1 各組大鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)比較［個(gè)/ml，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與溶劑組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組溶劑組蒿本內(nèi)酯組總細(xì)胞數(shù)3.6346±1.6329527.4808±8.5289*28.5385±7.5981720.5513±5.76878#

2.3 各組大鼠BALF中性粒細(xì)胞比值比較 見表2。

表2 各組大鼠BALF中性粒細(xì)胞比值的比較（±s）

表2 各組大鼠BALF中性粒細(xì)胞比值的比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與溶劑組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組溶劑組蒿本內(nèi)酯組N%6.5±3.9390.3±1.03*87.0±4.0380.6±21.17#

2.4 各組大鼠BALF中總蛋白含量的比較 見表3。

表3 各組大鼠BALF中總蛋白含量的比較［mg/L，（±s）］

表3 各組大鼠BALF中總蛋白含量的比較［mg/L，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與溶劑組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組溶劑組蒿本內(nèi)酯組總蛋白含量58.5±16.69189.25±30.46*185.26±14.33134.98±49.60#

2.5 各組大鼠BALF中IL-1β的比較 見表4。

表4 各組大鼠BALF中IL-1β含量的比較［pg/ml，（±s）］

表4 各組大鼠BALF中IL-1β含量的比較［pg/ml，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與溶劑組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組溶劑組蒿本內(nèi)酯組IL-1β57.76±14.65320.64±13.67*295.07±48.28224.94±60.25#

2.6 各組大鼠BALF中TNF-α的比較 見表5。

表5 各組大鼠BALF中TNF-α含量的比較［ng/L，（±s）］

表5 各組大鼠BALF中TNF-α含量的比較［ng/L，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與溶劑組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組溶劑組蒿本內(nèi)酯組TNF-α42.31±15.30112.73±12.00*106.65±4.6072.15±28.08#

2.7 各組大鼠BALF中LDH的比較 見表6。

表6 各組大鼠BALF中LHD含量的比較［iu/ml，（±s）］

表6 各組大鼠BALF中LHD含量的比較［iu/ml，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01

組別空白組模型組溶劑組蒿本內(nèi)酯組LDH11.7±2.5023.57±8.06*19.30±10.8215.60±6.55

3 討論

ALI是以大量彌漫性炎癥細(xì)胞肺內(nèi)浸潤、肺微血管通透性增加、肺泡和肺實(shí)質(zhì)內(nèi)高度水腫及低氧血癥為特征的常見臨床綜合征。ALI的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，隨著失控的炎癥反應(yīng)引起多臟器功能障礙綜合征理論的出現(xiàn)，使人們對ALI的發(fā)病機(jī)制轉(zhuǎn)向?qū)ρ装Y損傷的認(rèn)識。細(xì)胞因子是有機(jī)體產(chǎn)生的小分子可溶性的蛋白質(zhì)，能夠影響機(jī)體細(xì)胞的行為和特征。可分為促炎因子和抗炎因子、可溶性腫瘤壞死因子受體（sTNF-R）、IL-4、IL-10、TGF、IL-11等。

ALI/ARDS中，復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和其他促炎化合物發(fā)動并增強(qiáng)了炎癥反應(yīng)，過激的炎癥反應(yīng)造成機(jī)體不可避免的損傷［5］。其中以TNF-α和IL-1β最為明顯。TNF-α在創(chuàng)傷后炎癥中是一種具有始動和關(guān)鍵性作用的促炎免疫分子，其能聚集激活中性粒細(xì)胞（PMN），導(dǎo)致呼吸爆發(fā)加劇肺損傷，主要通過肺泡細(xì)胞的溶解，炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)遷移以及血管內(nèi)皮損傷等多種途徑引起肺損傷［6～8］。而IL-1β與其具有協(xié)同作用，在炎癥早期即能引起肺泡細(xì)胞的破壞，炎癥細(xì)胞在肺泡內(nèi)的募集，從而加重肺泡蛋白滲出，肺實(shí)質(zhì)的水腫，引起呼吸膜的增厚，另外引起肺血管內(nèi)皮的破壞，肺泡出血，引起通氣血流失調(diào)，從而導(dǎo)致低氧血癥。

前期的研究已證實(shí)當(dāng)歸及其中藥復(fù)方（如芪冬活血飲）可以顯著減輕肺損傷大鼠肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕肺泡間隔水腫出血。其保護(hù)機(jī)制與減少前炎癥因子TNF-α的分泌，增加抗炎因子IL-10分泌，調(diào)節(jié)抗炎和促炎因子之間的平衡；減少M(fèi)DA含量、增加SOD含量，具有抗氧化作用有關(guān)［3，4］。但是其具體中藥單體的結(jié)果作用尚不明確，蒿本內(nèi)酯是當(dāng)歸有效成分中最重要的單體，藁本內(nèi)酯對心腦血管、循環(huán)系統(tǒng)及免疫功能等均有較強(qiáng)的藥理作用。但是其在ALI中的作用仍未引起重視。

在本研究中，作者證實(shí)了蒿本內(nèi)酯可以有效降低BALF中總細(xì)胞數(shù)的含量，另外，其對BALF中性粒細(xì)胞比值及肺泡總蛋白量均有降低作用，說明其可以有效減少炎癥細(xì)胞的募集和肺泡滲出，主要體現(xiàn)在組織病理學(xué)上，蒿本內(nèi)酯組大鼠的肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，肺泡腔破壞程度得到改善。作者認(rèn)為，這與其能有效降低BALF的促炎因子（TNF-α和IL-1β）有關(guān)。但是，在本實(shí)驗(yàn)中，蒿本內(nèi)酯對BALF中LDH的影響差異不明顯，這與肺泡蛋白滲出降低不符合，或者存在其他因子的調(diào)節(jié)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

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2 Gordon D Rubenfe1d，Margaret S Herridge.Epidemio1ogy and Outcomes of Acute Lung Injury .Chest， 2007，131（2）： 554～562.

3 蔡宛如，洪輝華，駱仙芳，等.芪冬活血飲對油酸致大鼠急性肺損傷干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（9）：830～832.

4 董雷，蔡宛如.芪冬活血飲對油酸致急性肺損傷大鼠氧化/抗氧化失衡的調(diào)節(jié)作用.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17（16）：2443～2445.

5 Matt11ay MA.Conference summary：acute 1ung injury.Chest，1999，116（1 Supp1）：119S～126S.

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8 Pittet JF， Machersie RC， Martin TR，et a1.Bio1ogica1 markers of acute 1ung injury，prognostic and pathogeneti significance. Am J Respir Crit Care Med.1997，155（4）：1187～1205.

Objective To explore the effects of Ligustilide as the primary elements of Angelica monomer， on the level of TNF-αand IL-1βin bronchoalveolar lavage fluid in acute lung injury rat model. Methods 40 SD rats were randomly divided into four groups：control group，model group，solvent group，and Ligustilide groups.Each group had 10 rats.ALI rat models were prepared by using intratracheal instillation of LPS，the solvent group by intraperitoneal injection of fat emulsion，the monomer groups by intraperitoneal injection of dose 10mg/kg in 24 hours before modeling，modeling，and 24 hours after modeling. Nothing was given in blank control group.Samples were collected 48 hours after modeling，then they had lung tissue H & E staining， the total number of cells was counted and the ratio of neutrophil was measured in the bronchoalveolar lavage fluid. The total protein content and lactate dehydrogenase，the enzyme-linked immunosorbent assay in BALF were detected and various tissues of TNF-α，IL-1βcontent in BALF are also assayed by ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）. Results Compared with the model group and the solvent group，Ligustilide significantly reduce the infiltration of pulmonary interstitial inflammatory cell，edema of interstitial pulmonary，also the thickening of alveolar wall，which decreased alveolar damage. reduced the total number of cells，neutrophils ratio，total protein and TNF-α，IL-1β in bronchoalveolar lavage fluid（P＜0.05）. It had little influence in BALF LDH（P＞0.05）. Conclusion The therapeutic effect of Ligustilide in acute lung injury may be related to its decreasing important pro-inflammatory cytokines in lung tissue like TNF-α and IL-1βwhich reduce the total number of cells，neutrophils ratio，the total protein content in BALF.

Acute lung injury Rats Ligustilide Tumor necrosis factor -α Interleukin -1β

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012ZGG002）

310007 杭州市中醫(yī)院呼吸科（朱詩乒）

310005浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（蔡宛如）