姜黃素對小鼠帕金森病模型行為學的影響

朱悅紅 徐彬 李光璐 胡肖依 吳憂?

姜黃素對小鼠帕金森病模型行為學的影響

朱悅紅 徐彬 李光璐 胡肖依 吳憂?

目的 探討姜黃素對C57BL/6小鼠帕金森病模型行為學的影響及常用行為學測試的比較。方法 取30只C57BL/6雄性小鼠隨機分成3組：MPTP模型組、姜黃素治療組和正常對照組；模型組、姜黃素組采用1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氫吡啶（ MPTP）腹腔注射造模，正常對照組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。姜黃素組予姜黃素腹腔注射，連續(xù)1周。各組小鼠在最后1次MPTP或0.9%氯化鈉注射液注射后7d予行為學指標檢測。結果 姜黃素能改善帕金森病模型小鼠行為學中曠場試驗、懸掛試驗等相關指標（P＜0.05）。對爬桿試驗相關指標無明顯改善作用。結論 姜黃素可改善帕金森病模型小鼠行為學變化。爬桿試驗、懸掛試驗較易受主觀因素影響，曠場試驗是更為客觀的檢測方法。

1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP） 帕金森病 姜黃素 行為學測試

帕金森病 （PD）是中老年人常見神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，已嚴重威脅人類健康［1］。研究認為，路易小體（Lewy bodies）中異常聚集的α-突觸核蛋白（α-Syn）與PD的發(fā)生發(fā)展密切相關［2，3］。α-Syn寡聚體的形成在PD的發(fā)病機制中發(fā)揮著關鍵作用［4～6］。姜黃素（curcumin）是一種多酚類物質(zhì)，近年來其生物學活性受到廣泛關注［7～9］。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可能通過誘導自噬繼而促進α-Syn的自噬性清除而發(fā)揮對PD的神經(jīng)保護作用［10～12］。2015年6月至9月作者通過試驗研究，探討姜黃素治療C57BL/6小鼠帕金森病模型運動障礙的療效及常用行為學測試的比較。

1 材料和方法

1.1 材料 （1） 試驗試劑：姜黃素、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）購自Sigma公司。（2）試驗動物：清潔級健康C57BL/6小鼠，8～10周齡，18～22g，雄性；飼養(yǎng)條件：清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)，正壓屏障系統(tǒng)，動物可自由攝食飲水，以上試驗動物、設施、飼料等均由浙江中醫(yī)藥大學動物試驗中心提供。

1.2 方法 （1）分組：將小鼠隨機分為3組，即MPTP模型組（10只）、姜黃素治療組（10只）和正常對照組（10只）。（2）MPTP小鼠PD模型建立：MPTP和姜黃素治療組予MPTP腹腔注射30mg/（kg·d），1次/d，一共注射7d，建立亞急性PD模型。正常對照組予腹腔注射0.9%氯化鈉注射液20ml/（kg·d），1次/d，連續(xù)7d。（3）姜黃素處理：姜黃素治療組在MPTP腹腔注射的同時予姜黃素（80mg/Kg）腹腔注射，1次/d。（4）行為學檢測：各組小鼠在最后1次MPTP 或0.9%氯化鈉注射液注射后7d進行行為學指標測試。

1.3 行為學測定指標及方法 （1）一般狀態(tài)觀察：觀察小鼠的精神狀態(tài)、姿勢、皮毛色澤、活動度等全身情況。（2）爬桿試驗（Pole test）：按文獻方法［13］制作一長60cm、粗0.8cm光滑不銹鋼桿，桿上纏上紗布以防滑，并將一大小適中的軟木球固定于桿頂端。將小鼠放至小球上，測定并記錄小鼠整個爬桿時間，每只小鼠測定3次，間隔30 min/次，取平均值［14］。試驗開始前對其進行爬桿訓練，無法練習者予以剔除。（3）懸掛試驗 （ Traction test ）：根據(jù)Wang W等［15］的試驗方法將小鼠的前爪懸掛在一條水平電線上。小鼠若兩只后肢均能抓住電線記為3分，一只后肢能抓住電線記為2分，兩只后肢均不能抓住電線記為1分，計算每只小鼠得分情況。試驗開始前對其進行懸掛訓練，無法練習者予以剔除。（4）曠場試驗（OFT ）：將試驗小鼠放在1個長寬均為80cm、高40cm、四壁底面為黑色，底面為白線劃分為面積相等的25塊立方形敞箱的安靜環(huán)境中，頂部中央安置攝像機。沿墻格為外周區(qū)域，其余為中央?yún)^(qū)域。在進行曠場試驗前，先將各組小鼠放置于測試試驗室內(nèi)適應環(huán)境10min，隨后試驗操作者將小鼠輕放入曠場箱的中央?yún)^(qū)內(nèi)，開始同步計時錄像，每只試驗小鼠測定1次，測定時間為15min。記錄小鼠的平均速度及運動總距離。試驗均于上午9～12點進行［16］，試驗前徹底清理上次試驗留下的小鼠糞便、尿液等。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般形態(tài)觀察結果 造模前各組小鼠毛色、進食等方面均無明顯差異。造模結束后模型組小鼠逐步變?yōu)榫氲?、毛發(fā)枯黃散亂、煩躁、易激惹、震顫、運動減少、步態(tài)不穩(wěn)、豎尾豎毛等表現(xiàn)；與模型組比較，姜黃素組毛色有明顯好轉，進食可，活動頻率增加。

2.2 爬桿試驗 C57BL/6小鼠在爬桿試驗中能夠迅速轉向并爬到底端，則耗時越短，表明運動和協(xié)調(diào)能力越強。結果MPTP模型組、姜黃素組爬桿時間與正常對照組比較顯著延長（P＜0.01），模型組及治療組未見差異。見表1。

2.3 懸掛試驗 將C57BL/6小鼠后爪抓住電線的情況，按照評分標準進行評分。分值越高，小鼠抓住電線越牢固，表明小鼠肢體運動協(xié)調(diào)情況越好；反之，則表明小鼠震顫、肌強直等情況嚴重。結果MPTP模型組、姜黃素治療組與正常對照組的分值比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。姜黃素治療組與MPTP模型組分值比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 曠場試驗 正常對照組在曠場試驗15min活動總距離及行動平均速度均明顯大于MPTP模型組和姜黃素治療組（P＜0.01），但姜黃素組與MPTP模型組比較，15min活動總距離及平均速度明顯改善（P＜0.01）。見表1。小鼠曠場試驗活動軌跡：正常對照組活動的范圍和量遠高于模型組及治療組，但姜黃素組相對于MPTP模型組，活動的范圍和量明顯提高，進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)增多。見圖1。

圖1 各組大鼠礦場試驗活動軌跡

表1 各組小鼠行為學試驗結果比較（±s）

表1 各組小鼠行為學試驗結果比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別爬桿時間（s）懸掛試驗分值曠場試驗結果活動總距離（cm）平均速度（cm/s）姜黃素治療組14.36±0.45*2.3±0.67*△15823.8±987.8**△△17.58±1.09**△△MPTP模型組14.86±0.51*1.5±0. 53**13885.2±987.3**15.43±0.34**正常對照組12.09±0.313.0±0.0019964.7±1581.322.18±1.76

3 討論

運動障礙是帕金森病患者的主要臨床表現(xiàn)之一，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動減少、運動困難和運動協(xié)調(diào)能力降低。C57BL/6小鼠在注射MPTP后，可以產(chǎn)生與臨床PD患者十分相似的病理及生化改變，明顯誘導出帕金森病的癥狀［16］。試驗結果顯示，在經(jīng)過1周的造模后，模型組小鼠普遍出現(xiàn)震顫、運動減少、步態(tài)不穩(wěn)、豎尾豎毛等表現(xiàn)，表明MPTP造模小鼠符合帕金森運動障礙表現(xiàn)。姜黃素組一般狀況明顯好轉，表明姜黃素起到干預調(diào)節(jié)的作用。

爬桿試驗是帕金森病模型小鼠運動功能檢測中十分常用的方法之一，具有便捷、易操作的特點而被廣泛使用。本資料顯示，模型組及治療組爬桿時間差異無統(tǒng)計學意義。因MPTP損傷使小鼠四肢震顫、運動不協(xié)調(diào)出現(xiàn)不能抓桿甚至直接落地的現(xiàn)象。部分小鼠在試驗中缺乏爬下桿的趨勢，因而導致爬桿時間非正常延長，影響試驗結果準確性。且爬桿法容易受主觀因素（如試驗人員的不同）影響，不易進行客觀評分［17］。

懸掛試驗主要用于測試小鼠四肢抓力及協(xié)調(diào)能力，操作性強，評分較客觀。本資料顯示，MPTP模型組、姜黃素治療組與正常對照組的分值比較差異有統(tǒng)計學意義，表明姜黃素可改善帕金森小鼠模型運動協(xié)調(diào)能力。但懸掛試驗極易受個體差異影響，需要擴大樣本量才能提高試驗的可靠性。

曠場試驗是評價小鼠在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種常用方法，操作簡便，方法可靠，且高效客觀［18］。特別是計算機技術和相應圖像處理技術的引入，使動物行為分析的檢測指標大為增加［19］。本資料中，MPTP模型組15min運動總長度及平均速度比正常對照組減少，進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)減少，表明小鼠自主活動能力和探究能力明顯下降。但姜黃素組情況較之有明顯好轉，表明姜黃素能改善小鼠上述行為改變。

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Objective To observe the curative effect of Curcumin on C57BL/6 mice behavioral manifestation in PD models，and to compare three behavioral tests which are often used in PD models. Methods 30 C57BL/6 mice were randomly divided into three groups as control group，MPTP+Curcumin group and model group. Mice in MPTP+Curcumin group and model group received intraperitoneal injection with MPTP to establish PD models，and mice in control group received intraperitoneal injection with the same amount of saline solution for 1 week. Mice in MPTP+Curcumin group received intraperitoneal injection with Curcumin the same time. Animal behavior detections were carried out on the 7th day after injection. Results Curcumin could improve the general condition and behavioral manifestation in open fi eld test and traction test （P＜0.05），while the effect on pole test was not signifi cant. Conclusions This study for behaviors of mice in the three groups further confi rmed that Curcumin could treat PD model mice behavior to some degree. Subjective factor was inclined to be involved in pole test and traction test. Open fi eld test is a more objective ethological method for MPTP model mice of Parkinson's disease.

1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP） Parkinson's disease Curcumin Behavioral test

浙江省中醫(yī)藥青年人才基金項目（No. 2015ZQ017）

310053 浙江中醫(yī)藥大學（朱悅紅 李光璐 胡肖依）

310005 浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院 （徐彬 吳憂）