啶蟲(chóng)脒和海島素(φ=5%氨基寡糖素)對(duì)棉蚜應(yīng)激防御酶活性的影響

陳麗慧，帕提瑪·烏木爾汗，崔燕華，李　勇，馮宏祖

(1.塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，塔里木大學(xué) 南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾　843300；2.阿克蘇地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆 阿克蘇　833000)

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啶蟲(chóng)脒和海島素(φ=5%氨基寡糖素)對(duì)棉蚜應(yīng)激防御酶活性的影響

陳麗慧1，帕提瑪·烏木爾汗1，崔燕華2，李勇1，馮宏祖1

(1.塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，塔里木大學(xué) 南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300；2.阿克蘇地區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆 阿克蘇833000)

為探討棉蚜取食噴施啶蟲(chóng)脒和海島素的棉花后對(duì)體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性的影響，以溫室內(nèi)飼養(yǎng)的1～2齡棉蚜為研究對(duì)象，測(cè)定用啶蟲(chóng)脒和海島素噴施棉花后棉蚜體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性。結(jié)果表明，棉蚜取食棉花后，啶蟲(chóng)脒和海島素處理對(duì)初期棉蚜體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)活性均表現(xiàn)為抑制作用；96 h內(nèi)，啶蟲(chóng)脒和海島素處理對(duì)棉蚜體內(nèi)的羧酸酯酶(CarE)活性表現(xiàn)為先抑制再激活后抑制，對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和乙酰膽堿酯酶(AchE)均有激活作用。說(shuō)明：用啶蟲(chóng)脒和海島素噴施棉花后，可擾亂棉蚜的保護(hù)和解毒系統(tǒng)，起到較好的防治效果。

棉蚜；棉花；保護(hù)酶活性；解毒酶活性

棉蚜(AphisgossypiiGlover)屬同翅目蚜科，是一種重要的多食性刺吸式口器害蟲(chóng)，為害棉花、南瓜、西瓜和豇豆等多種植物，廣泛分布于世界各地。棉蚜的發(fā)生和為害嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]，化學(xué)防治是目前控制棉蚜的重要手段?；瘜W(xué)農(nóng)藥施于田間可殺死大部分害蟲(chóng)，但由于寄主植物不同部位受藥量、溫度、濕度、光照、風(fēng)等多因素的影響，害蟲(chóng)不同個(gè)體間接觸的藥量有較大差異，可能對(duì)害蟲(chóng)產(chǎn)生一定的亞致死效應(yīng)，從而對(duì)其生物學(xué)、生殖力和生理代謝等多方面產(chǎn)生影響。有研究顯示，亞致死效應(yīng)對(duì)害蟲(chóng)的抗藥性發(fā)展有促進(jìn)作用[3]。也有研究表明，在正常環(huán)境條件下，生物細(xì)胞內(nèi)自由基在超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的協(xié)調(diào)下處于動(dòng)態(tài)平衡，昆蟲(chóng)攝入化學(xué)農(nóng)藥后可能會(huì)破壞其平衡，使昆蟲(chóng)受到傷害[4-5]。昆蟲(chóng)體內(nèi)應(yīng)激防御酶除保護(hù)酶系外還有解毒酶系，如羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和乙酰膽堿酶(AchE)等，這些酶對(duì)分解外源毒素和維持昆蟲(chóng)自身正常生理代謝有重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，棉蚜的吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒抗性品系和敏感品系的CarE、GSTs活性有顯著差異，在棉蚜對(duì)啶蟲(chóng)脒的抗性中CarE、AchE起很大作用，GSTs作用較小[7-8]。研究棉蚜體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性對(duì)探討棉蚜抗藥性發(fā)展機(jī)制及其有效治理具有重要意義。

啶蟲(chóng)脒屬于氯化煙酰亞胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑，高效低毒，對(duì)昆蟲(chóng)天敵和生態(tài)環(huán)境均較安全，應(yīng)用較為廣泛，目前多用于防治蚜蟲(chóng)類(lèi)害蟲(chóng)。但由于啶蟲(chóng)脒使用頻率和使用量的增加，棉蚜對(duì)啶蟲(chóng)脒的抗藥性不斷增強(qiáng)[9]，有研究表明，棉蚜對(duì)新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑存在較大的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)[10]。海島素(φ=5%氨基寡糖素)是新型植物免疫誘抗劑，能誘導(dǎo)激活植物的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)，提高植物抗病性。近年來(lái)，在棉花等多種作物上進(jìn)行大量的田間試驗(yàn)顯示，海島素對(duì)多種作物病害具有誘導(dǎo)抗病和防控作用，對(duì)葉螨和蚜蟲(chóng)也表現(xiàn)出一定的抑制作用[11]。因此，本研究在生化水平上對(duì)啶蟲(chóng)脒亞致死濃度處理和海島素田間推薦濃度處理后的棉蚜應(yīng)激防御酶的活性變化進(jìn)行研究，分析酶活性的變化動(dòng)態(tài)，為深入研究棉蚜的抗藥性發(fā)展機(jī)制及其有效治理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試棉花：‘新陸中37’。

供試蟲(chóng)源：采自塔里木大學(xué)試驗(yàn)站棉田，于植保站溫室內(nèi)用新鮮棉花苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)70代左右。選擇發(fā)育至1～2齡的棉蚜用于試驗(yàn)。

供試藥劑：啶蟲(chóng)脒(w=20%啶蟲(chóng)脒可溶粉劑，南京盟興化學(xué)有限公司)，海島素(φ=5%氨基寡糖素，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：棉花植株達(dá)5～6葉期時(shí)接蟲(chóng)，接蟲(chóng)前先將棉蚜饑餓處理4～6 h。設(shè)置3種處理：A.籠噴施海島素(φ=5%氨基寡糖素)800倍液；B.籠噴施0.1 mg/L啶蟲(chóng)脒(w=20%啶蟲(chóng)脒可溶粉劑)，試驗(yàn)前配制啶蟲(chóng)脒的系列質(zhì)量濃度，對(duì)棉蚜進(jìn)行毒力測(cè)定，以清水為對(duì)照，分別計(jì)算2 d內(nèi)的亞致死劑量LC25；C.籠噴清水對(duì)照，每處理重復(fù)3次。將1～2齡棉蚜分散于真葉，任其為害，并在子葉下方涂抹凡士林，防止棉蚜逃逸。分別于接蟲(chóng)后24、48、72、96 h取樣測(cè)定棉蚜體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性。取樣時(shí)用毛筆挑取棉葉上的棉蚜，迅速放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-70 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.2保護(hù)酶液的制備

分別取不同處理的棉蚜成蟲(chóng)40頭，加少量聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，1.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)及少許石英砂，冰浴條件下充分研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，備用。

1.2.1SOD活性測(cè)定參考劉素琪等[12]的方法。3 mL NBT反應(yīng)液：1.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)，0.3 mL 75 μmol/L氮藍(lán)四唑(NBT)，0.3 mL 13 mmol/L蛋氨酸，0.3 mL 0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和50 μL酶液，最后加4 μmol/L核黃素0.55 mL。置于3 000 lx日光燈下進(jìn)行光反應(yīng)， 25 ℃照光15 min后關(guān)燈，黑暗終止反應(yīng)，于560 nm測(cè)定吸光值，以?xún)?nèi)裝NBT反應(yīng)液但不加酶液進(jìn)行光照的試管為對(duì)照，以?xún)?nèi)裝NBT反應(yīng)液不加酶液但置于暗處的試管為參比。1個(gè)酶活單位為相當(dāng)于引起3 mL反應(yīng)液達(dá)到50%抑制所需的酶量。

1.2.2CAT活性測(cè)定參考劉素琪等[12]的方法。取粗酶液0.1 mL，加入φ=0.2% H2O21 mL，蒸餾水1.9 mL，混勻反應(yīng)3 min，測(cè)定反應(yīng)液在240 nm的吸光值，1 min讀1次，讀3次，以不加酶液的反應(yīng)液為空白對(duì)照。酶活性單位為U/(mg·min)。

1.2.3POD活性測(cè)定參考Simon等[13]的方法。反應(yīng)體系中含2 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液、0.5 mL 0.05mol/L愈創(chuàng)木酚、φ=2% H2O21.0 mL和0.15 mL酶液，作用5 min，于470 nm測(cè)定吸光值，1 min讀1次，讀3次，以不加酶液的反應(yīng)液為空白對(duì)照。酶活性單位為U/(mg·min)。

1.3解毒酶液的制備

取棉蚜成蟲(chóng)40頭，加入1.5 mL預(yù)冷的相應(yīng)的酶緩沖液，羧酸酯酶通過(guò)0.04 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)提??；乙酰膽堿酯酶通過(guò)0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)提取。棉蚜成蟲(chóng)在冰浴中勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液作為酶液。

1.3.1CarE活性測(cè)定參考 Van Asperen[14]的方法。取3.6 mLα-乙酸萘酯(α-NA)和0.1 mL酶液，混勻，30 ℃水浴15 min，再加1 mL DBLS試劑(w=1%固藍(lán)B與w=5%十二烷基硫酸鈉以體積比2∶5混合)，反應(yīng)15 min后，以不加酶液的反應(yīng)液為空白對(duì)照，于600 nm測(cè)定吸光值。酶活性單位為μmol/(mg·min)。

α-乙酸萘酯貯液配制方法：取5.58 mgα-乙酸萘酯、8.25 mg毒扁豆堿和1 mL丙酮溶于適量0.04 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)，并將其轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，再取適量0.04 mol/L磷酸緩沖液定容，即獲得α-乙酸萘酯貯液。

1.3.2GSTs活力測(cè)定參考Booth等[15]的方法。反應(yīng)混合液含0.1 mL酶液，2.9 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 8.0)，50 μL 0.1 mol/LCDNB液，0.7 mL 0.03 mol/L谷胱甘肽溶液，30 ℃水浴30 min，加熱使其失活，以不加酶液的反應(yīng)液為空白對(duì)照，在350 nm測(cè)定吸光值，酶活性單位為μmol/(mg·min)。

1.3.3AchE活力測(cè)定參考Ellman等[16]的方法。反應(yīng)混合液含0.1 mL酶液，2.8 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 8.0)，0.1 mL 0.01 mol/L DNTB液，50 μL 0.075 mol/L碘化乙酰膽堿，30 ℃水浴15 min，加入0.1 mL 10-5mol/L毒扁豆堿，以不加酶液的反應(yīng)液為對(duì)照，410 nm測(cè)定吸光值，酶活單位為μmol/(mg·min)。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003 軟件和DPS 7.05軟件處理分析數(shù)據(jù)；采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)棉蚜體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

由表1可知，同一時(shí)間下，3種處理的SOD活性存在極顯著差異(P<0.01)。隨棉蚜取食時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組的SOD活性呈波浪式變化，變化幅度不大，且取食72 h時(shí)活性達(dá)到最大值。海島素和啶蟲(chóng)脒處理組棉蚜的SOD活性均呈下降的趨勢(shì)，取食24 h時(shí)活性達(dá)到最大值。從棉蚜取食經(jīng)不同藥劑處理棉花的SOD活性變化趨勢(shì)可以看出，藥劑處理前期能夠刺激棉蚜作出相應(yīng)的氧化排毒反應(yīng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性變化趨緩。

表1　棉蚜取食不同藥劑處理的棉花后其SOD、CAT和POD的活性

注：數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，第1組不同小寫(xiě)字母表示同行數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著，大字字母表示在P<0.01水平差異顯著；第2組不同小寫(xiě)字母表示同列數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著，大字字母表示在P<0.01水平差異顯著。下同。

Note: Data in table is the “mean value ± the standard deviation”.Different lowercase letters of first group showing in the same row data indicate significant difference at the level ofP<0.05 by the Duncan’s new multiple range method,uppercase letters indicate significant difference at the level ofP<0.01.Different lowercase letters of second group showing in the same column data indicate significant difference at the level ofP<0.05 by the Duncan’s new multiple range method,uppercase letters indicate significant difference at the level ofP<0.01,same as below table.

隨棉蚜取食時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組的CAT活性呈波浪式變化，72 h時(shí)活性達(dá)到最大值；海島素處理組的CAT活性呈先降低后升高的趨勢(shì)，啶蟲(chóng)脒處理組的CAT活性呈降低的趨勢(shì)，均在24 h時(shí)CAT活性達(dá)到最大值。2個(gè)藥劑處理組的CAT酶活性變化趨勢(shì)表明，藥劑處理后棉蚜的CAT活性受到抑制。

3種處理棉蚜的POD活性均在取食24 h時(shí)達(dá)到最大，且處理間存在極顯著差異(P<0.01)。隨棉蚜取食時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組的POD活性呈波浪式變化；海島素處理和啶蟲(chóng)脒處理的POD活性均呈下降趨勢(shì)，且不同時(shí)間段海島素處理組的POD活性存在極顯著性差異(P<0.01)。2個(gè)藥劑處理組的POD活性變化趨勢(shì)表現(xiàn)，藥劑處理可能會(huì)促使氧自由基在蚜蟲(chóng)體內(nèi)積聚，從而阻礙POD的合成。

2.2對(duì)棉蚜體內(nèi)解毒酶活性的影響

由表2可知，同一時(shí)間下，3種處理的CarE活性均存在極顯著性差異(P<0.01)。隨棉蚜取食時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組的CarE活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且取食72 h時(shí)活性達(dá)到最大值；海島素處理的CarE活性呈升高的變化趨勢(shì)，在取食96 h時(shí)活性達(dá)到最大值；啶蟲(chóng)脒處理的CarE活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在取食72 h時(shí)活性達(dá)到最大值。2個(gè)藥劑處理的CarE酶活性變化趨勢(shì)表明，藥劑處理可促進(jìn)棉蚜體內(nèi)CarE活性升高。

棉蚜取食棉花后，處理組的GSTs活性均高于對(duì)照組，取食后24 h時(shí)不同處理間的GSTs活性存在極顯著差異(P<0.01)，其他時(shí)間段差異均不顯著(P>0.05)。3種處理的GSTs活性均在取食96 h后達(dá)到最大值。隨棉蚜取食時(shí)間的延長(zhǎng)，3種處理的GSTs活性均呈升高的趨勢(shì)，且GSTs活性峰值變化表現(xiàn)為海島素處理組>啶蟲(chóng)脒處理組>對(duì)照組。

棉蚜取食棉花72、96 h后，海島素處理和啶蟲(chóng)脒處理的AchE活性均存在極顯著差異(P<0.01)，且在96 h時(shí)達(dá)到最大值。隨棉蚜取食時(shí)間的延長(zhǎng)，3種處理的AchE活性均呈升高的趨勢(shì)，AchE活性峰值變化表現(xiàn)為啶蟲(chóng)脒處理組>海島素處理組>對(duì)照組。

表2　取食不同藥劑處理的棉花后棉蚜體內(nèi)CarE、GSTs、AchE的活性

3　討論與結(jié)論

藥劑進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)，可激發(fā)其體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶在逆境下的應(yīng)激反應(yīng)[3]。SOD、CAT、POD是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的保護(hù)酶，可清除昆蟲(chóng)體內(nèi)的氧自由基，從而保護(hù)昆蟲(chóng)的正常生理活動(dòng)[17-18]。已有研究證實(shí)，當(dāng)蟲(chóng)體受到刺激或脅迫后，能激活體內(nèi)的氧自由基清除機(jī)制，保護(hù)酶活性上升，使蟲(chóng)體不受危害[19-20]。也有研究顯示，昆蟲(chóng)受到外界刺激后，體內(nèi)CAT和POD活性在前期均受到抑制[21]。本研究表明，棉蚜取食經(jīng)海島素和啶蟲(chóng)脒處理的棉葉，并隨取食時(shí)間的延長(zhǎng)，其體內(nèi)SOD、CAT、POD活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但均高于對(duì)照組，表明，在海島素和啶蟲(chóng)脒的脅迫下，棉蚜體內(nèi)的氧自由基開(kāi)始積累，阻礙保護(hù)酶的合成，擾亂棉蚜體內(nèi)保護(hù)酶的平衡，使機(jī)體防御力下降，引起棉蚜死亡。

CarE、GSTs、AchE是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的解毒酶，可分解外源毒物，從而維持昆蟲(chóng)的正常生理代謝[22]。已有研究證實(shí)，不同植物的次生物質(zhì)和不同寄主植物均可誘導(dǎo)昆蟲(chóng)體內(nèi)CarE、GSTs、AchE活性增加[1,23]。鄧小霞[24]、孟麗峰[25]研究結(jié)果表明，不同藥劑處理可使昆蟲(chóng)體內(nèi)AchE活性降低；鄢杰明等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，甲氧蟲(chóng)酰肼能抑制舞毒蛾5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)CarE和GSTs活性。本研究表明，取食海島素和啶蟲(chóng)脒處理的棉葉后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，棉蚜體內(nèi)CarE、GSTs、AchE活性均有所升高，推測(cè)CarE、GSTs、AchE可能參與棉蚜對(duì)海島素和啶蟲(chóng)脒的解毒代謝，在棉蚜的抗藥性進(jìn)化過(guò)程中起重要作用。

綜上所述，啶蟲(chóng)脒主要作用于棉蚜，使棉蚜體內(nèi)系統(tǒng)失衡而死亡；而海島素主要作用于棉花，誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生抗性，起到抑制棉蚜的作用。在防治棉蚜過(guò)程中，啶蟲(chóng)脒和海島素可交替使用，從而減少農(nóng)藥的使用，保持棉田生態(tài)平衡，也對(duì)棉田合理用藥提供一定指導(dǎo)意義。

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Corresponding authorFENG Hongzu,male,professor.Research area: integrated pest management.E-mail: fhzzky@163.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Effect of Acetamiprid andφ=5% Amino Oligosaccharin onAphisgossypiiActivity of Stress Defence Enzyme

CHEN Lihui1,Patima Wumuerhan1,CUI Yanhua2,LI Yong1and FENG Hongzu1

(1.College of Plant Science,Tarim University; Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar,Ministry of Agriculture,P.R.China; Southern Xinjiang Key Laboratory of IPM of Tarim University,Alar Xinjiang843300,China;2.Aksu Agriculture-Technical Extension Center,Aksu Xinjiang833000,China)

Study the effect of aphid gossypii fed with acetamiprid and cotton treated byφ=5% amino oligosaccharin on protective enzyme activity and detoxifying enzyme activity in internalAphisgossypii,it provided theoretical basis for the resistance mechanism and effective prevention ofAphisgossypii.1-2 ageAphisgossypiiin greenhouse as objects,we determined the activities of three kinds of protective enzymes(superoxide dismutase,catalase and peroxidase) and three kinds of detoxifying enzymes(carboxylesterase,acetylcholinesterase and glutathione-s-transferase) in internalAphisgossypiiafter different medicament spraying.The results showed that SOD,CAT,POD,CarE,GSTs and AchE activities in internalAphisgossypiihad a trend to inhibition at initial stage of treatments of acetamiprid andφ=5% amino oligosaccharin afterAphisgossypiifed with the cotton；CarE activity behaved inhibition effect as first then activation and inhibition at last within 96h，it had activation effect on GSTs and AchE activity.This proved that acetamiprid andφ=5% amino oligosaccharin disturbed the protection and detoxification system ofAphisgossypii，and had better control efficiency.

Aphisgossypii; Cotton; Protective enzymes activity; Detoxifying enzymes activity

2015-12-11Returned2016-03-05

Corps Project for Technology Transfer(2014BD031); Research Innovation Program for Graduate Students of Tarim University(TDGRI201507).

CHEN Lihui,female,master student.Research area: integrated pest management.E-mail: clh030201@163.com

2015-12-11

2016-03-05

兵團(tuán)技術(shù)轉(zhuǎn)移計(jì)劃(2014BD031)；塔里木大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(TDGRI201507)。

陳麗慧，女，碩士，研究方向：害蟲(chóng)綜合治理。E-mail：clh030201@163.com

馮宏祖，男，教授，研究方向：害蟲(chóng)綜合治理。E-mail：fhzzky@163.com

S435.622+

A

1004-1389(2016)08-1257-06

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-07-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1105.042.html