離子阱液質聯(lián)用儀應用于植物葉片游離氨基酸快速分析方法的建立

張戰(zhàn)鳳,李紅霞,樊永亮,宋　月,武麗娟,田宏剛,劉小鳳,劉同先

(1.西北農(nóng)林科技大學 植物保護學院，農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室， 陜西楊凌　712100； 2.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊凌　712100)

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離子阱液質聯(lián)用儀應用于植物葉片游離氨基酸快速分析方法的建立

張戰(zhàn)鳳1,李紅霞2,樊永亮1,宋月1,武麗娟1,田宏剛1,劉小鳳1,劉同先1

(1.西北農(nóng)林科技大學 植物保護學院，農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室， 陜西楊凌712100； 2.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊凌712100)

建立一種液相色譜-離子阱串聯(lián)質譜(LC-MS-MS) 同時分析植物組織中23 種游離氨基酸的方法。植物樣品經(jīng)鹽酸-乙醇法一步提取后直接進樣，無需進行衍生和固相萃取等其他前處理步驟。液相色譜采用Intertsil OSD-4 C18(250 mm ×3.0 mm )色譜柱，采用甲醇-甲酸體系進行洗脫，對23種氨基酸獲得比較理想的分離效果。結果表明，該方法通用性良好、樣品制備簡單(一步提取，無需衍生)、靈敏度高、檢出范圍寬、高效快速，可以在30 min內完成整個分析過程。

氨基酸；液相色譜-質譜聯(lián)用；植物組織

氨基酸是構成蛋白質的基本單位，它參與生物的新陳代謝和生理過程，氨基酸分析在農(nóng)業(yè)、食品科學、醫(yī)學研究中有廣泛而重要的作用。1958 年，Spackman 等[1]首先提出用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結合的方法分析蛋白質中的氨基酸，實現(xiàn)氨基酸分析的自動化。之后，新的氨基酸分析方法不斷涌現(xiàn)，例如柱前衍生反相高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法、毛細管電泳法、超高壓液相色譜法等[2-3]。由于氨基酸不具有分光檢測所需的生色基團， 用上述的色譜方法進行檢測時需對氨基酸進行柱前或柱后衍生，但衍生化操作步驟繁瑣，耗時耗力[4-5]， 而且對衍生化合物的穩(wěn)定性難以進行直觀的評判，某些氨基酸衍生反應的完全程度也難以保證。 同時衍生反應還可能生成非目標衍生物，這些都會影響氨基酸的準確測定。現(xiàn)在廣泛使用的全自動氨基酸分析儀也同樣存在氨基酸的衍生問題。另外，上述液相色譜(LC)等方法主要通過保留時間來識別化合物，必須花費較多時間摸索適當?shù)纳V分離條件以準確判定待測物。但化合物共流出的問題致使不能區(qū)分某些待測化合物和干擾物，從而影響定性和定量的準確性。

近年來，隨著電噴霧離子化(ESI) 和串聯(lián)質譜(MS/MS) 技術的發(fā)展， LC-ESI-MS/MS 聯(lián)用在化合物分析中得到廣泛的應用[6-10]。質譜檢測器具有靈敏度高、選擇性強等特征，常應用于復雜痕量樣品的定性定量。特別是其具有特征離子提取功能，與色譜方法相比，對待測物色譜分離的要求相對較低，即使液相沒有很好分離, 通過選擇離子掃描, 可以對含有多種成分的復雜樣品的母離子及相應的子離子同時進行監(jiān)測,從而實現(xiàn)對每一種成分準確定性及定量。另外，由于質譜可以直接測定物質的準分子離子及特征碎片信息，因而無需對樣品進行衍生化和固相萃取等復雜的前處理，就可以直接上機測定，這大大簡化分析步驟，提高分析效率。

本研究擬將離子阱液質聯(lián)用儀應用于游離氨基酸的分析測試。通過對23種游離氨基酸的質譜行為、色譜行為及樣品的提取方法進行系統(tǒng)的研究，旨在開發(fā)一種樣品制備簡單(一步提取，無需衍生)、靈敏度高、檢出范圍寬、重現(xiàn)性好、高效快速(30 min內完成分析)的游離氨基酸測定方法。

1　材料與方法

1.1試驗材料

選用的5種作物(小麥、甘藍、煙草、菠菜、茄子)，均種植于西北農(nóng)林科技大學應用昆蟲學重點實驗室人工氣候室(16L∶8D，白天23 ℃，晚上18 ℃)。土壤基質為草炭和珍珠巖(體積比為5∶1)，按需澆水。

液相色譜-質譜聯(lián)用儀(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)，配備自動進樣器、四元梯度質譜泵，LTQ 離子阱質譜帶電噴霧電離源, Xcalibur 2.1 系統(tǒng)控制軟件。Millipore純水機，Sartorious MSA 3.6P-000-DM 電子天平(精度為0.001 mg)，島津Shimadzu 0.22 μm尼龍針式濾頭。

1.3試 劑

β-氨基丁酸(BABA，純度>99%)、γ-氨基丁酸 (GABA，純度>99%)、混合氨基酸標準溶液(AAS18-Amino Acid Standard，含17 種氨基酸：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、 L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、 L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸，濃度均為2.5 mmol/L) 購自美國Sigma-Aldrich 公司； L-谷氨酰胺(純度>98.5%，AMRESCO分裝)、天冬酰胺 (純度>99%，AMRESCO分裝) ; L-色氨酸(純度>99%，AMRESCO)、L-半胱氨酸(純度>99%，AMRESCO)，Milli-Q 級水由Millipore Element A10 制備, 若不經(jīng)特別說明，試驗中用水均為Milli-Q 級水。甲醇和甲酸( HPLC級，德國MERCK 公司)，EDTA、乙醇、鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

1.4植物葉片中游離氨基酸提取

分別稱取新鮮植物葉片500 mg，加入1 mLφ=50% 的乙醇水溶液(含0.1 mol/L 的HCl)，使用研磨棒充分勻漿，12 000 r/min 離心10 min，上清用0.22 μm針頭濾器過濾后即可上機檢測。其中小麥為出苗7 d麥苗，樣品取第一片葉；甘藍為生長至6片真葉的甘藍苗，取頂部幼嫩葉片；煙草為生長至6～8片真葉的煙苗，取頂部葉片；菠菜取自具有5 片真葉的幼苗；茄子取自具有4 片真葉的頂部葉片。

1.5色譜條件

島津公司的Intertsil OSD-4 C18色譜柱(250 mm ×3.0 mm，填料粒徑5 μm )，進樣方式為全環(huán)(25 μL)，流速300 μL/min，柱溫箱25 ℃，樣品盤溫度10 ℃，洗針體積800 μL。流動相A: Milli-Q級水；流動相B:甲醇；流動相C:φ=0.5%甲酸溶液。流動相洗脫梯度見表1。

表1　23種氨基酸色譜分離的流動相梯度

1.6質譜條件

在項目水資源論證報告書審查過程中，專家組詳細分析了各項目區(qū)水資源開發(fā)條件、各水源供水基礎設施數(shù)量及供水能力、機電井分布及供水狀況，明確要求水源確定時要優(yōu)先考慮地表水，合理開發(fā)地下水，禁止開采深層承壓水。地表水資源相對豐富、具備供水條件和供水能力的項目區(qū)，應進一步壓縮地下水開采量；項目實施必須開采地下水資源的，要實行地下水總量與水位雙控制，科學論證地下水取水規(guī)模、新建和改造井數(shù)及適宜井深；嚴格控制生態(tài)脆弱區(qū)取用地下水，禁止在地下水超采區(qū)新增地下水開采，確保項目實施后地下水的采補平衡。

電噴霧電離源(ESI)，陽離子模式，噴霧電壓4.5 kV，離子傳輸毛細管溫度設為275 ℃，鞘氣和輔助氣分別為25 L/min及8.0 L/min。采用數(shù)據(jù)依賴性掃描方法對氨基酸進行碎裂和掃描。每種氨基酸的具體測定參數(shù)如表2所示。

表2　23種氨基酸的質譜測定參數(shù)

2　結果與分析

2.123種氨基酸的色譜行為

使用島津公司的Intertsil OSD-4 C18色譜柱，采用甲醇-甲酸體系進行洗脫，可以對23種氨基酸獲得比較理想的分離效果。在此條件下,23種氨基酸在16 min內全部流出色譜柱，值得注意的是異亮氨酸(Ile)/亮氨酸(Leu)及賴氨酸(Lys)/谷氨酰胺(Gln)這2對同分異構體能達到基線分離, 23種氨基酸的色譜分離效果如圖1所示。

RT.保留時間　Retention time； SM.曲線平滑參數(shù)　Smoothing parameter

2.223種氨基酸的質譜行為

分別將23氨基酸標準品直接引入質譜儀，分別研究每一種氨基酸在正、負離子模式下的裂解行為。通過調整噴霧電壓、氣體流速、碰撞能量等參數(shù)，選擇豐度高、重現(xiàn)性好碎片離子用于后續(xù)定量。經(jīng)過對比和優(yōu)化，在陽離子模式下，23種氨基酸均有良好的靈敏度及穩(wěn)定的二級質譜裂解行為，23種氨基酸準分子離子峰均為[M + H ]+峰，其質譜斷裂方式也存在共性，在二級質譜碎片中易產(chǎn)生脫HCOOH (46)、CH3COOH(60) 或NH3(17) 的特征碎片離子，這也是氨基酸特有的中性碎片丟失。每種氨基酸對應的質譜圖如圖2所示。

圖2　23種氨基酸的二級質譜

2.3標準曲線

將23種氨基酸標準溶液稀釋成0、0.04、0.20、1.0、5.0、25.0 μmol/L 6個不同濃度，測定后以氨基酸濃度為橫坐標(x)，峰面積響應值為縱坐標(y)， 繪制標準曲線。 進行線性回歸分析，計算相關系數(shù)。23種氨基酸濃度和質譜響應值呈良好的線性關系，相關系數(shù)分布為0.990 6～1.000 0，如表3所示。

2.4檢出限

通過實際測定系列低濃度的氨基酸標準樣品，得到檢出限，以信噪比(S/N) 為3 進行確定。質譜儀具有極高的靈敏度，23種氨基酸檢出限從從0.20 pmol (Pro)至10.00 pmol(Gly)不等，絕大多數(shù)氨基酸的檢出限為0.20～1.40 pmol，如表3所示。

表3　23種氨基酸的線性回歸方程、相關系數(shù)及檢出限的測定結果

2.5回收率

向提取的氨基酸樣品中加入標準溶液進行回收率試驗, 并進行6次平行試驗計算平均回收率和精密度。23種氨基酸的回收率分布在73%～152%，大部分氨基酸的回收率為90%～110%；相對標準差(RSD)分布在1.3%～14.1%，絕大部分氨基酸的RSD保持在8%以內，如表4所示,Cyss及BABA在選取的植物樣品中未檢測到，所以未進行加標回收試驗。

2.6方法應用

采用該方法分別對植物源材料(小麥、甘藍、煙草、菠菜、茄子)的葉片中總游離氨基進行測定，結果如表5所示。

表4　23種氨基酸的回收率及精密度測定結果

表5　植物葉片中游離氨基酸測定結果

注：NF表示該種氨基酸低于檢出限。

Note: NF means not detectable.

3　討 論

采用傳統(tǒng)方法進行氨基酸分析時，由于氨基酸不具有光學檢測所需的生色基團，所以檢測時需要對氨基酸進行耗時耗力的柱前或柱后衍生反應，以便光學檢測器能夠識別氨基酸，更值得注意的是，有些氨基酸衍生反應的完全程度很難保證，衍生反應有時會生成非目標衍生物，這些都會影響氨基酸的準確測定。所以進行傳統(tǒng)的氨基酸分析時樣品的制備條件比較苛刻[2-5]。相對于傳統(tǒng)的氨基酸分析方法，該方法提取步驟簡單，無需對氨基酸進行柱前或柱后衍生，直接對氨基酸分子原形進行質譜檢測，因而不存在衍生反應是否完全等問題，大大簡化操作步驟，降低試驗誤差。同時質譜儀具有超高的靈敏度，特別是其具有離子提取功能， 通過選擇性離子掃描, 可以對含有多種成分的復雜樣品的母離子及相應的子離子同時進行監(jiān)測,從而實現(xiàn)對每一種成分準確定性及定量。與傳統(tǒng)色譜方法相比，該方法對氨基酸的色譜分離的要求相對較低，即使液相沒有很好分離,也可以實現(xiàn)對氨基酸的準確定性及定量，從而使液相分離時間大幅度降低，傳統(tǒng)的氨基酸分析儀單個樣品分析時間需1 h左右[11-12]，本研究中的方法在保證回收率及精密度的同時，整個分析過程僅需20 min，大大提高分析效率。由于質譜儀具有超高的靈敏度，該方法的靈敏度較氨基酸分析儀提高近10倍，氨基酸分析儀對氨基酸的最低檢出限為3 pmol[11-15], 該方法對有些氨基酸的檢出限低至0.20 pmol。

本研究中分別對來自5種不同種屬的植物源材料，包括小麥、甘藍、煙草、菠菜和茄子苗期葉片中總的游離氨基酸采用鹽酸-乙醇法進行簡單的一步提取，然后直接上機檢測。測定結果顯示，該方法通用性良好、樣品制備簡單(一步提取，無需衍生)、靈敏度高、檢出范圍寬、高效快速，可以在30 min內完成整個分析過程。方法的精密度驗證表明，該方法的靈敏度及穩(wěn)定性可完全滿足相關試驗需要。

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Corresponding authorLIU Tongxian,male,professor.Research area:agricultural insect and pest control.E-mail: txliu@nwsuaf.edu.cn

(責任編輯：成敏Responsible editor:CHENG Min)

Simultaneous Analysis of 23 Amino Acids in Different Plant Tissues by Liquid Chromatography Ion Trap Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Zhanfeng1, LI Hongxia2, FAN Yongliang1, SONG Yue1,WU Lijuan1, TIAN Honggang1, LIU Xiaofeng1and LIU Tongxian1

(1.College of Plant Protection, State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Key Laboratory of Integrated Pest Management on the Loess Plateau of Ministry of Agriculture, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China；2.College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100)

A method for simultaneous analysis of 23 free amino acids in different plant tissues was developed using liquid chromatography ion trap tandem mass spectrometry under positive ionization mode．Plant samples were extracted directly using hydrochloric acid-ethanol solution, and analyzed without derivatization or solid phase extraction. The LC separation was carried on a reversed-phase Intertsil OSD-4 C18(250 mm ×3.0 mm )with the mobile phase of methyl alcohol/formic acid /water solution in gradient mode. The results showed that the developed method is of good efficiency, sensitivity and selectivity, and has been successfully applied to determine the free amino acids in different plant tissues.

Amino acid；Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)；Plant tissue

2015-05-05Returned2015-08-07

New Function Development Project of Large Instrument of Northwest A&F University (No.dysb130103); National Key Basic Research Program of China (No.2013CB127600); the Agricultural Science and Technology Innovation and Research of Shaanxi Province (No.2015NY109).

ZHANG Zhanfeng,male,experimentalist,doctoral student.Research area:instrumental analysis and chemical ecology.E-mail: zhanfengfwjt@nwsuaf.edu.cn

2015-05-05

2015-08-07

西北農(nóng)林科技大學大型儀器設備新功能開發(fā)項目(dysb130103)；國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2013CB127600)；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關項目(2015NY109)。

張戰(zhàn)鳳，男，實驗師，在職博士研究生，從事儀器分析及化學生態(tài)方面的研究。E-mail: zhanfengfwjt@nwsuaf.edu.cn

劉同先，男，教授，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲及害蟲防治方面的研究。E-mail: txliu@nwsuaf.edu.cn

O657.6

A

1004-1389(2016)08-1229-08

網(wǎng)絡出版日期：2016-07-14

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1105.034.html