晚期乳腺癌患者自體自然殺傷細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其殺傷活性分析

高萬軍，黃啟明，祁楠（北大醫(yī)療魯中醫(yī)院，山東淄博55400；怡諾博（北京）生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院）

晚期乳腺癌患者自體自然殺傷細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其殺傷活性分析

高萬軍1，黃啟明2，祁楠3
（1北大醫(yī)療魯中醫(yī)院，山東淄博255400；2怡諾博（北京）生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；3解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院）

目的 分析晚期乳腺癌自體自然殺傷（NK）細(xì)胞體外培養(yǎng)能否激活與免疫監(jiān)視密切相關(guān)的NK細(xì)胞，并產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用。方法 取10例晚期乳腺癌患者和10例正常女性外周血，單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增得到活化NK細(xì)胞，分別檢測(cè)NK細(xì)胞增殖和表型，NK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性及乳腺癌鼠模型體內(nèi)抗腫瘤活性。結(jié)果 兩者來源NK細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，培養(yǎng)到第15天NK細(xì)胞數(shù)均達(dá)到1.0×109以上，均高表達(dá)80%以上的CD3-CD16+CD56+表型，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；體外實(shí)驗(yàn)兩者對(duì)乳腺癌細(xì)胞均有較好的細(xì)胞毒性，晚期乳腺癌患者和正常女性來源NK細(xì)胞殺傷乳腺癌細(xì)胞之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論 晚期乳腺癌患者自體NK細(xì)胞經(jīng)體外活化后具有與正常女性同樣的誘導(dǎo)增殖效果，對(duì)乳腺癌有較好的細(xì)胞殺傷活性。

乳腺腫瘤；自然殺傷細(xì)胞；細(xì)胞表型；細(xì)胞毒性；免疫細(xì)胞治療

乳腺癌是女性惡性腫瘤中最常見的一種，晚期患者5年內(nèi)具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性［1，2］。大多數(shù)研究主要分析由T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫作用，對(duì)自然殺傷（NK）細(xì)胞的免疫功能研究相對(duì)較少，因乳腺癌具有特殊的免疫學(xué)特性，在其發(fā)生、發(fā)展過程中由NK細(xì)胞發(fā)揮主要的免疫監(jiān)視作用［3］。乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)通過抑制受體調(diào)控NK細(xì)胞免疫作用，使得NK細(xì)胞殺傷活性受到抑制，激活NK細(xì)胞活化受體，對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞殺傷活性［4］，而獲取足夠數(shù)量且活化的NK細(xì)胞是治療乳腺癌的核心，亦是目前乳腺癌免疫治療臨床與基礎(chǔ)研究的難點(diǎn)。自然殺傷細(xì)胞抑制性受體（KIR）及活化受體（KAR）的發(fā)現(xiàn)對(duì)NK細(xì)胞在識(shí)別和裂解腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用［5］，但腫瘤患者自體來源NK細(xì)胞的免疫功能尚不明確，其能否被激活，并增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的免疫作用研究較少。本研究擬采用晚期乳腺癌患者和正常人來源的自體NK細(xì)胞，體外激活NK細(xì)胞活性并進(jìn)行體內(nèi)體外殺傷乳腺癌試驗(yàn)，觀察不同來源NK細(xì)胞增殖作用及體內(nèi)抗乳腺癌活性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年11月～2015年6月在北大醫(yī)療魯中醫(yī)院住院的10例晚期乳腺癌患者，年齡27～56（41.6±2.4）歲。根據(jù)WHO及2009年國際抗癌聯(lián)盟確立的乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)ⅢB期7例、Ⅳ期3例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例、無轉(zhuǎn)移4例。入選患者接受過手術(shù)和（或）化療1個(gè)月以上，患者血常規(guī)白細(xì)胞均＞2×109/L，單核細(xì)胞＞0.1×109/L，淋巴細(xì)胞＞0.8×109/L，卡氏評(píng)分在60分以上；排除有嚴(yán)重器官衰竭、自身免疫性疾病和處于孕期的患者。另選擇同期體檢健康的正常女性10例作為對(duì)照，年齡31～55歲。

1.2 自體NK細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采集晚期乳腺癌患者和正常女性者抗凝外周血30 mL，加入等量1 ×PBS稀釋，沿離心管管壁輕輕疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，室溫下2 000 r/min離心20 min，吸取界面層的PBMC，洗滌2次。1×PBS調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞濃度為1×107/mL。用9份Percoll原液加1份8.5%氯化鈉溶液配置成100%Percoll工作液，將Percoll工作液配成37.5%～50%6個(gè)密度梯度，每個(gè)梯度相差2.5%，按密度由高至低緩緩加于15 mL離心管中，將細(xì)胞輕輕疊加于上層，2 000 r/min離心30 min，吸取42.5%～45%梯度的細(xì)胞，計(jì)數(shù)。將NK細(xì)胞按照濃度為（1～5）×106/mL培養(yǎng)于含IL-15 100 ng/mL、IL-18 50 ng/mL、IL-2 50 U/mL和OKT3 50 ng的AIM-V完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含IL-2 50 U/mL的AIM-V完全培養(yǎng)基連續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)到第21天。使用活細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別在第0、6、9、12、15、18和21天進(jìn)行計(jì)數(shù)，分析NK細(xì)胞活率和增殖倍數(shù)。

1.3 NK細(xì)胞表型檢測(cè) 取晚期乳腺癌患者和正常女性者來源第14天培養(yǎng)獲得的1×106NK細(xì)胞，進(jìn)行流式抗體染色檢測(cè)分析。NK細(xì)胞一組分別為鼠抗人CD16-FITC 20 μL、鼠抗人CD56-PE 20 μL和鼠抗人CD8-PerCP 20 μL；另一組分別為鼠抗人CD3-FITC 20 μL、鼠抗人CD25-PE 20 μL和鼠抗人CD4-PerCP 20 μL；同型對(duì)照組為mIgG1-FITC 20 μL、mIgG1-PE 20 μL和mIgG1-PerCP 20 μL；置4℃冰箱染色30 min后用PBS洗滌3次，然后在FACSCalibur儀器（美國BD公司）上檢測(cè)并分析。

1.4 乳腺癌細(xì)胞系培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞，快速置于37℃水浴中，完全溶解后緩慢移入已加入10 mL 1×PBS的離心管中，混勻，1 200 r/min，離心10 min，棄上清，用RPMI1640培養(yǎng)基1 mL重懸細(xì)胞，混勻，加入75 cm2培養(yǎng)瓶，再加入RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）10 mL。培養(yǎng)24 h后，觀察MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞己經(jīng)貼壁，更換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長至90%以上鋪滿時(shí)，吸除培養(yǎng)瓶中的液體。加入0. 25%胰蛋白酶1 mL，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基2 mL，移入離心管中離心10 min。加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基5 mL，按1∶2比例分瓶傳代后，繼續(xù)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞。取穩(wěn)定傳代的第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞，懸浮細(xì)胞稀釋后，經(jīng)苔盼蘭染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.5 NK細(xì)胞體外抗乳腺癌的細(xì)胞毒性測(cè)定 采用乳酸脫氫酶（LDH）法。分別以MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞為靶細(xì)胞，刺激NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，按效靶比40∶1、20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1分別加入96孔培養(yǎng)板中，之后置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用LDH細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)法測(cè)定NK活性：吸取上清液50 μL，置于96孔板中，加入LDH基液50 μL，室溫避光30 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，490 nm波長處測(cè)吸光度（OD）值，計(jì)算MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的殺傷率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析NK細(xì)胞表型及其引發(fā)NK細(xì)胞增殖能力與表型；NK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞株的抑瘤比較采用成組比較t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同來源NK細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖分析 來源于乳腺癌和正常女性者培養(yǎng)的NK細(xì)胞CD16、CD56純度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.53）。隨著體外培養(yǎng)天數(shù)增加，NK細(xì)胞數(shù)不斷提高，到第15、18和21天時(shí)乳腺癌患者NK細(xì)胞數(shù)均值分別為0.89×109、1.28× 109和2.04×109個(gè)，擴(kuò)增倍數(shù)均值分別為477.73倍、686.16倍和1 094.75倍；正常女性NK細(xì)胞數(shù)均值分別為1.05×109、1.32×109和2.46×109個(gè)，擴(kuò)增倍數(shù)均值分別為651.36倍、817.54倍和1 529.59倍；兩者在NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和增殖倍數(shù)上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。

2.2 不同來源NK細(xì)胞表型表達(dá)對(duì)比 乳腺癌患者和正常女性表達(dá)CD分子陽性率平均值見表1，兩者均有NK特征表型CD16CD56陽性，CD3、CD4和CD8表型表達(dá)均很低，CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞很少。體外培養(yǎng)獲得NK細(xì)胞主要為CD16+CD56+細(xì)胞，含CD3+T淋巴細(xì)胞很低，晚期乳腺癌患者與正常女性對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同人群自體NK細(xì)胞表型陽性率比較（%±s）

研究對(duì)象細(xì)胞表型CD16+CD56+CD3+CD3+/CD8+CD3+/CD4+CD4+/CD25+乳腺癌患者87.19±6.783.50±1.223.23±1.163.32±1.342.13±0.67正常女性84.25±5.494.66±1.233.48±0.574.21±1.452.67±1.10

2.3 不同來源NK細(xì)胞引發(fā)的抗腫瘤細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中對(duì)靶細(xì)胞乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231的效靶比從2.5∶1到40∶1，隨著效靶比逐漸增加，NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性逐漸增加（圖1）。晚期乳腺癌患者和正常女性來源NK細(xì)胞對(duì)MCF-7和MDA-MB-231在效靶比為40∶1時(shí)達(dá)到的平均抑瘤率達(dá)到最高，但晚期乳腺癌患者和正常女性來源NK細(xì)胞殺傷乳腺癌細(xì)胞之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P分別為0.49和0.52，晚期乳腺癌患者自體的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤殺傷具有同樣活性。

圖1 晚期乳腺癌患者和正常女性自體NK細(xì)胞對(duì)MDA-MB-231的殺傷活性

3 討論

目前NK細(xì)胞的臨床治療主要通過利用細(xì)胞因子體外擴(kuò)增和激活NK細(xì)胞，但其受KIR和KAR調(diào)節(jié)，與機(jī)體正常細(xì)胞接觸后，KIR能誘導(dǎo)靶細(xì)胞上的HLA-Ⅰ類分子基團(tuán)改變，形成KIR/HLA外環(huán)，其中心為ICAM-1/LFA-1，從而形成抑制性免疫突觸［6］。很多腫瘤細(xì)胞在丟失經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子同時(shí)，另一類非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子表達(dá)增加，包括乳腺癌在內(nèi)均表達(dá)高水平的HLA-G和HLA-E分子［7］，這種高表達(dá)的HLA-G分子可與抑制性受體結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的殺傷［8］，因而對(duì)乳腺癌進(jìn)行免疫治療，必須激活NK細(xì)胞的活性以提高對(duì)患者的免疫應(yīng)答，殺傷腫瘤細(xì)胞及阻止腫瘤轉(zhuǎn)移。

腫瘤免疫監(jiān)視功能包括天然免疫監(jiān)視和獲得性免疫監(jiān)視兩方面，以CD3-、CD16+和CD56+為主要表型特征的NK細(xì)胞，直接殺傷MHC-Ⅰ類分子丟失或變異的靶細(xì)胞，發(fā)揮天然腫瘤免疫監(jiān)視功能。CD8+CTL細(xì)胞殺傷MHC-Ⅰ類分子限制性靶細(xì)胞，具有獲得性腫瘤免疫監(jiān)視功能，正常情況下兩者相互補(bǔ)充和協(xié)調(diào)，共同抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展［9］。NK細(xì)胞無CD8+CTL細(xì)胞殺傷活性復(fù)雜的活化過程，能迅速發(fā)揮殺瘤效應(yīng)，因此在腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮舉足輕重的作用。乳腺癌具有特殊的免疫學(xué)特性，在其發(fā)生、發(fā)展過程中由NK細(xì)胞發(fā)揮主要的免疫監(jiān)視作用［3］。本研究我們采用晚期乳腺癌患者和正常女性自體的NK細(xì)胞研究對(duì)乳腺癌的抗腫瘤免疫作用，分析腫瘤患者來源NK細(xì)胞能否被激活，產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫作用。結(jié)果表明乳腺癌患者和正常女性來源NK細(xì)胞的誘導(dǎo)增殖作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，培養(yǎng)到第21天NK細(xì)胞計(jì)數(shù)均達(dá)到2.0× 109以上，增殖倍數(shù)達(dá)到1 000倍以上；且兩者來源NK細(xì)胞均表達(dá)特有CD16CD56分子，陽性率達(dá)80%以上，患者自體NK細(xì)胞表型與正常女性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

NK細(xì)胞發(fā)揮特有的天然腫瘤免疫作用已在腫瘤免疫治療和臨床研究中得到開展。乳腺癌組織高表達(dá)的HLA-G分子可抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，對(duì)其自身來說，是對(duì)其丟失經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子產(chǎn)生不利影響的一種補(bǔ)救措施，使其能逃逸CTL細(xì)胞的殺傷，又能逃逸NK細(xì)胞的殺傷［10］。同時(shí)乳腺癌患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)受到惡性腫瘤細(xì)胞抑制，腫瘤細(xì)胞營造的免疫微環(huán)境，包括調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子分泌、抑制性免疫細(xì)胞和免疫細(xì)胞功能被抑制，均介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃避［11］。體外實(shí)驗(yàn)我們研究發(fā)現(xiàn)各組對(duì)乳腺癌細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的殺傷作用，晚期患者自體NK細(xì)胞同樣具有良好的殺傷效果，而且乳腺癌患者和正常人來源的自體NK細(xì)胞的殺傷活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本研究晚期乳腺癌患者和正常人來源體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的自體NK細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表型，乳腺癌患者自體NK細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，具有與健康者同樣誘導(dǎo)增殖效果，并表達(dá)高表型的CD16CD56分子，很好地被激活增殖。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)乳腺癌患者自體NK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞能引發(fā)良好的細(xì)胞毒性作用，將有助于采用自體NK細(xì)胞將來臨床治療乳腺癌，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

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