小兒腹股溝斜疝發(fā)病與腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的關(guān)系

尉遲今新，黃慧潔，劉暢，鄒大軍，徐曉青（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000）

小兒腹股溝斜疝發(fā)病與腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的關(guān)系

尉遲今新，黃慧潔，劉暢，鄒大軍，徐曉青
（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北承德067000）

目的 探討小兒腹股溝斜疝發(fā)病與腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的關(guān)系。方法 采用免疫組化法和Western blotting法檢測35例腹股溝斜疝患兒（病例組）和30例非疝患兒（對照組）腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的分布與含量。結(jié)果 病例組腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白經(jīng)免疫組化染色后的鏡下形態(tài)均呈連續(xù)性分布，排列整劑，無中斷，與對照組相比無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）；病例組腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量分別為203.48 ±16.76、216.82±19.25，對照組分別為196.68±17.26、219.66±18.92，兩組相比無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。病例組與對照組Ⅰ型+Ⅲ型膠原蛋白含量分別為419.30±21.18、416.34±19.63，Ⅰ型/Ⅲ型分別為0.93±0.05、0.90±0.06，兩組相比，P均＞0.05。結(jié)論 小兒腹股溝斜疝的發(fā)病與腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白代謝紊亂無明顯關(guān)系。

小兒腹股溝斜疝；Ⅰ型膠原蛋白；Ⅲ型膠原蛋白

小兒腹股溝斜疝（PIH）是小兒普外科常見病，發(fā)病率1%～4%，右側(cè)與左側(cè)發(fā)病比例約2.5∶1［1］。傳統(tǒng)學說認為腹膜鞘狀突未閉合致本病發(fā)生［2］。但Williams等［3］曾報道，15%～30%無腹股溝疝患者亦有未閉合的鞘狀突存在。近年來有學者發(fā)現(xiàn)成人腹股溝疝患者腹橫筋膜中存在Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白代謝的紊亂，證實膠原蛋白代謝紊亂引起的腹橫筋膜機械穩(wěn)定性降低是成人腹股溝疝發(fā)病的直接原因。2014年10月～2015年2月，我們檢測了腹股溝斜疝患兒腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達，旨在探討小兒腹股溝斜疝發(fā)病與腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 腹股溝斜疝患兒35例（病例組），男32例、女3例，年齡（6.01±1.94）歲。另選取其他非疝手術(shù)患兒30例作為對照組，男28例、女2例，年齡（6.03±2.01）歲。兩組年齡、性別具有可比性。入組患兒均獲得家長同意。排除標準：結(jié)締組織病、貧血、糖尿病、感染性疾病、被動吸煙、惡性腫瘤等。

1.2 腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達檢測 病例組標本切取自腹股溝斜疝患兒腹橫筋膜，面積0.5 ～1 cm2。對照組標本切取自非疝的其他手術(shù)患兒相同部位腹橫筋膜，面積0.5～1 cm2。術(shù)中切取標本后一部分用100 mmol/L的中性甲醛溶液固定24 h，修整組織塊，常規(guī)方法制成蠟塊行免疫組化法檢測；另一部分用液氮保存?zhèn)溆眯蠾estern blotting法檢測。免疫組化法：將蠟塊做成5 μm切片，用電熱恒溫箱80℃烘烤50 min后二甲苯脫蠟。3%過氧化氫室溫孵育10 min。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，放入100℃的0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）中，抗原熱修復15 min，室溫放置40 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加Ⅰ抗50 μL（HGF 1 ∶60工作液；c-met 1∶100工作液），置4℃冰箱過夜。PBS洗3次，每次5 min。滴加Ⅱ抗，室溫孵育15 min。PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色5 min，終止顯色，蒸餾水沖洗。蘇木素復染，透明、封片、鏡檢。Western-blotting法：標本在液氮冷凍狀態(tài)下研磨成粉，酸性條件下以10%胃蛋白酶消化22 h。離心1 h，2 mol/L NaCl加入上清，-4℃19 000 r/min離心1 h。按BCA法測定并調(diào)平蛋白質(zhì)濃度。變性，電泳2 h，將PAGE凝膠中的蛋白通過電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，2 h，電壓40 V。TBS洗膜1次，加入含8%BSA的TBS，4℃過夜。TBS洗膜3次，每次5 min，分別加入兔抗人Ⅰ型膠原單克隆抗體和兔抗人Ⅲ型膠原單克隆抗體（1∶1 000），室溫下2 h。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶200），室溫4 h。用1 mL的ECL混合發(fā)光液，孵育PVDF 膜3 min后顯影。用化學發(fā)光儀采集圖像，應(yīng)用Quantity One生物圖像處理軟件對免疫印跡條帶進行灰度值分析，以灰度值代表實際蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

本研究標本中的膠原蛋白經(jīng)免疫組化染色后呈棕黃色，鏡下可見病例組腹橫筋膜中Ⅰ型和Ⅲ型膠原均呈連續(xù)性分布，排列整齊，無中斷，同對照組相比無明顯差別。病例組與對照組腹橫筋膜膠原蛋白灰度值及比值的均數(shù)比較見表1。病例組腹橫筋膜標本中Ⅰ型膠原蛋白灰度值、Ⅲ型膠原蛋白灰度值、Ⅰ型+Ⅲ型膠原蛋白灰度值、Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白灰度比值與對照組相比均無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）?；叶戎蹬c組織中實際的蛋白含量呈近似反比關(guān)系，因此腹股溝斜疝患兒腹橫筋膜中實際的Ⅰ型膠原蛋白含量、Ⅲ型膠原蛋白含量、Ⅰ+Ⅲ型膠原蛋白總量、Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值與非疝患兒相比均無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。

表1 病例組與對照組腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白灰度值及其比值比較±s）

表1 病例組與對照組腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白灰度值及其比值比較±s）

組別n 膠原蛋白類型Ⅰ型Ⅲ型Ⅰ型+Ⅲ型Ⅰ型/Ⅲ型病例組35203.48±16.76 216.82±19.25 419.30±21.180 1.466 P .93±0.05對照組30196.68±17.26 219.66±18.92 416.34±19.630.90±0.06 t 1.6080.5980.581 0.1480.1130.5520.563

3 討論

早在古埃及時代人類就已發(fā)現(xiàn)并命名疝這一疾病［4］。疝的定義為體內(nèi)某個臟器離開正常解剖部位，通過先天或后天形成的薄弱點、缺損進入另一部位，其病因?qū)W至今尚未能完全明確。近年來研究發(fā)現(xiàn)成人腹股溝疝患者腹橫筋膜中存在膠原蛋白代謝的紊亂，認為膠原蛋白代謝紊亂引起的組織機械穩(wěn)定性降低是成人腹股溝疝發(fā)病的直接原因。

膠原蛋白占人類體內(nèi)蛋白質(zhì)的25%～30%，相當于人體質(zhì)量的6%［5］，人體組織的生物力學強度和基本構(gòu)架的維持主要依賴膠原分子的穩(wěn)定［6］。在人體結(jié)締組織特別是筋膜中最主要的膠原是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原［7］。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原加在一起可占95%［8］。其中有相對成熟特點的Ⅰ型膠原所形成的纖維直徑粗，彈性張力和強度較高，而Ⅲ型膠原是幼稚的、相對不成熟的，所以其形成的纖維直徑較細，這導致Ⅰ型膠原形成的纖維強度和彈性張力比Ⅲ型膠原高。組織的結(jié)構(gòu)和強度由調(diào)節(jié)原纖維直徑的Ⅰ型與Ⅲ型膠原比例決定［9］。組織機械穩(wěn)定性的降低由Ⅰ型與Ⅲ型膠原比例下降導致［9］。

腹橫筋膜是維系腹壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要成分，而腹橫筋膜的穩(wěn)定依賴于其中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白代謝的正常。近年來有學者對成人腹股溝疝患者腹橫筋膜中膠原蛋白代謝進行了深入研究。李劍等［10］認為Ⅰ型與Ⅲ型膠原比例下降與成人腹股溝疝的發(fā)生及術(shù)后復發(fā)有直接關(guān)系，而這一變化的原因是幼稚的Ⅲ型膠原增加。Friedman等［11］發(fā)現(xiàn)腹股溝斜疝患者腹橫筋膜中Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白比例降低，成人腹股溝疝的發(fā)病可能與系統(tǒng)性膠原代謝紊亂有關(guān)。上述研究結(jié)果均證實成人腹股溝疝患者腹橫筋膜Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白比例降低，而組織機械穩(wěn)定性與Ⅰ型/Ⅲ型膠原值呈正比關(guān)系，從而使組織機械穩(wěn)定性降低導致成人腹股溝疝的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，腹股溝斜疝患兒腹橫筋膜中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白免疫組化后的鏡下形態(tài)與非疝患兒相比無明顯差別。Western blotting法測定的腹股溝斜疝患兒腹橫筋膜中Ⅰ型膠原蛋白含量、Ⅲ型膠原蛋白含量、Ⅰ型+Ⅲ型膠原蛋白總量及Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白值與非疝患兒相比無統(tǒng)計學差異。由此推測小兒腹股溝斜疝發(fā)病與患兒腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白代謝紊亂不相關(guān)。與成人腹股溝疝的發(fā)病機制不同。這一結(jié)論為小兒腹股溝斜疝和成人腹股溝疝在治療方面的差異提供了理論依據(jù)。王果等［12］報道，小兒腹股溝斜疝修補術(shù)后復發(fā)率為1.0%～2.5%，而采用自身組織進行修補的成人腹股溝疝術(shù)后復發(fā)率高達10%［13］，這是因為小兒腹股溝斜疝患兒腹橫筋膜中無膠原代謝紊亂，其機械穩(wěn)定性未降低，可作為手術(shù)修補材料，不必采用生物合成補片。

綜上所述，小兒腹股溝斜疝的發(fā)病與腹橫筋膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白代謝紊亂無明顯關(guān)系。本研究受樣本來源的限制，納入患兒的年齡為2～9歲，嚴格意義上不能代表全部兒童，其他年齡段兒童腹橫筋膜中是否存在膠原蛋白代謝紊亂尚需進一步研究。

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