聚肌胞增強(qiáng)肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)甲氨蝶呤化學(xué)敏感性的機(jī)制

王麗（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽471003）

聚肌胞增強(qiáng)肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)甲氨蝶呤化學(xué)敏感性的機(jī)制

王麗
（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽471003）

目的 探討聚肌胞（PolyI：C）增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤（MTX）化學(xué)敏感性的機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2，并隨機(jī)分成對(duì)照組、MTX組、聯(lián)合組，對(duì)照組加入生理鹽水，MTX組加入MTX至20 μg/mL，聯(lián)合組加入MTX至20 μg/mL和PolyI：C至50 μg/mL。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中維甲酸誘導(dǎo)基因1（RIG-1）、干擾素β（IFN-β）和半胱胺酸天冬胺酸轉(zhuǎn)移酶3（Caspase-3）mRNA表達(dá)，蛋白免疫印跡法檢測(cè)RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果 聯(lián)合組與MTX組相比，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均顯著升高，而RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平亦顯著提高兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 PolyI：C通過上調(diào)RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的抑制和凋亡，從而增強(qiáng)MTX對(duì)肝癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性。

肝腫瘤；聚肌胞；甲氨蝶呤；化學(xué)敏感性

肝細(xì)胞肝癌（HCC）是一種起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，僅有小部分可進(jìn)行切除或進(jìn)行肝移植，大部分患者需行藥物治療［1］。甲氨蝶呤（MTX）是肝細(xì)胞癌的化療藥物之一，但長(zhǎng)期大劑量使用MTX，正常肝細(xì)胞會(huì)引起損傷，肝癌細(xì)胞亦可產(chǎn)生耐藥性［2］。聚肌胞（PolyI：C）是一種人工合成雙鏈RNA，可于體內(nèi)誘導(dǎo)不同細(xì)胞產(chǎn)生干擾素α和干擾素β（IFN-β）［3］。研究表明，PolyI：C在誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的同時(shí)，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［4］。2014年3月～2015年4月，我們通過PolyI：C聯(lián)合MTX作用于肝癌細(xì)胞株HepG2，觀察肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)MTX化學(xué)敏感性的變化并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibico公司；胰酶購自Amresco公司；TRIzol試劑和轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamin2000均購于Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自Thermo公司。注射用MTX購自齊魯制藥公司；聚肌胞購自廣東邦民制藥廠。鼠抗人RIG-1單克隆抗體、鼠抗人IFN-β單克隆抗體、鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自Santa Cruz公司；肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 肝癌細(xì)胞HepG2使用含10%FBS的高糖DMEM，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，將HepG2細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104/mL，種入6孔培養(yǎng)板和96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞過夜貼壁后換液，并分成三組，即對(duì)照組、MTX組和聯(lián)合組，對(duì)照組加入生理鹽水，MTX組加入MTX至20 μg/mL，聯(lián)合組加入MTX至20 μg/mL和PolyI：C至50 μg/ mL；6孔板每組設(shè)3個(gè)平行孔，96孔板每組設(shè)12個(gè)平行孔，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 采用MTT法。將分組加藥處理的96孔板細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱，每孔加入5 mg/mL的MTT試劑20 μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL/孔，于振蕩器上振蕩5 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔570 nm波長(zhǎng)處的OD值。根據(jù)公式計(jì)算出HeLa細(xì)胞增殖抑制率：抑制率（IR）=（對(duì)照組OD值均數(shù)-實(shí)驗(yàn)組OD值均數(shù)）/對(duì)照組OD值均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.4 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。將分組處理的6孔板細(xì)胞用0.25%的胰酶將細(xì)胞消化后，分別加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，2 000 r/ min離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞1次，2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞沉淀，重懸細(xì)胞，分別加入PI染色液避光靜置5 min，最后用75%乙醇固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞維甲酸誘導(dǎo)基因1（RIG-1）、IFN-β和半胱胺酸天冬胺酸轉(zhuǎn)移酶3（Caspase-3）mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將分組加藥處理72 h的6孔板細(xì)胞按照一步法提取細(xì)胞中總RNA，準(zhǔn)確定量2 μg RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。各取等量基因使用SYBGreen染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量細(xì)胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表達(dá)檢測(cè)。PCR條件：95℃預(yù)變性5 min進(jìn)入循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s并讀取熒光值，共45個(gè)循環(huán)，獲取Ct值，計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)采用蛋白免疫印跡法。收集6孔板處理的三組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，混勻后置冰上15 min，13 000 r/min，離心5 min，收集上清液用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。分別取等量蛋白電泳，濕式電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再用3%脫脂牛奶室溫封閉2 h。分別加鼠抗RIG-1單克隆抗體、鼠抗IFN-β單克隆抗體和鼠抗Caspase-3單克隆抗體為一抗（1∶1 000），以鼠抗人β-actin單克隆抗體為內(nèi)參抗體（1∶2 000）。4℃孵育過夜，PBST洗膜3次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗（1∶2 000），37℃孵育2 h，PBST洗膜3次。于暗室滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，然后壓片、顯影、定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。應(yīng)用Scion Image軟件分析灰度值，蛋白相對(duì)定量值=目的基因灰度值/內(nèi)參基因灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。以O(shè)ne-Way ANOVA模塊對(duì)各組檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率比較 與對(duì)照組比較，MTX組和聯(lián)合組對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均具有明顯抑制作用（P均＜0.05）；而聯(lián)合組與MTX組比較，HepG2細(xì)胞增殖抑制更明顯（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，MTX組和聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率均升高（P均＜0.05），聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率比MTX組更高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率比較

2.2 各組細(xì)胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表達(dá)比較 聯(lián)合組細(xì)胞RIG-1、IFN-β mRNA水平高于對(duì)照組和MTX組（P均＜0.05），對(duì)照組和MTX組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。MTX組和聯(lián)合組細(xì)胞中Caspase-3 mRNA水平均高于對(duì)照組（P均＜0.05），而聯(lián)合組Caspase-3 mRNA水平比MTX組更高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA表達(dá)比較

2.3 各組細(xì)胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白水平比較 聯(lián)合組細(xì)胞RIG-1、IFN-β蛋白水平高于對(duì)照組和MTX組（P均＜0.05），MTX組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而MTX組和聯(lián)合組細(xì)胞Caspase-3蛋白水平均高于對(duì)照組（P均＜0.05），聯(lián)合組中水平比MTX組更高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞RIG-1、IFN-β和Caspase-3蛋白表達(dá)比較

3 討論

肝癌傳統(tǒng)治療包括手術(shù)、放療和化療等多種方法［5］。手術(shù)和放療僅在腫瘤早期、部位局限時(shí)應(yīng)用，中晚期肝癌患者多數(shù)需藥物化療。但多數(shù)中晚期肝癌對(duì)MTX、氟尿嘧啶、順鉑等化療藥物敏感性不高，尤其是單藥治療有效率更低［6］。

PolyI：C是一種病毒雙鏈RNA的模擬物。有文獻(xiàn)報(bào)道，其不僅對(duì)免疫細(xì)胞（如自然殺傷細(xì)胞）具有激活作用，而且還可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［7］。其一方面可與Toll受體3（TLR3）結(jié)合，激活TLR3通路，發(fā)揮天然免疫和抗腫瘤免疫作用；另一方面，PolyI：C于體內(nèi)誘導(dǎo)不同細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。干擾素是體內(nèi)多種細(xì)胞釋放的一種糖蛋白，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。因此PolyI：C已作為一種有效的抗腫瘤免疫佐劑被廣泛研究，既可單獨(dú)用作免疫治療，亦可結(jié)合其他免疫藥物及細(xì)胞毒藥物而應(yīng)用。

Caspases活性變化是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，Caspases是所有凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路［8］。目前已發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)的Caspases共有14種，其中起核心作用的是Caspase-3［9］。Caspase-3與肝癌亦有密切關(guān)系［10］，Caspase-3是抗腫瘤藥物作用的極好靶點(diǎn)［11］。研究表明，細(xì)胞對(duì)MTX反應(yīng)性很大程度上依賴于細(xì)胞p53和Caspases的功能［12］。本研究顯示，聯(lián)合組、MTX組與對(duì)照組相比，RIG-1、IFN-β 和Caspase-3表達(dá)均顯著上調(diào)；同時(shí)聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率明顯高于MTX組和對(duì)照組。證實(shí)PolyI：C能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)MTX的化學(xué)敏感性，其機(jī)制可能為PolyI：C通過激活TLR3通路，上調(diào)RIG-1，誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)，同時(shí)激活Caspase-3抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)了化療效果。

綜上所述，PolyI：C通過上調(diào)RIG-1、IFN-β和Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的抑制和凋亡，從而增強(qiáng)MTX對(duì)肝癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性。

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