NS-398對人結(jié)腸癌HCT-8細胞增殖、凋亡的影響及機制

張曉賢，孫劍經(jīng)，劉華，羅強，張林西（河北北方學(xué)院，河北張家口075000；河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院）

NS-398對人結(jié)腸癌HCT-8細胞增殖、凋亡的影響及機制

張曉賢1，孫劍經(jīng)2，劉華1，羅強1，張林西1
（1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院）

目的 觀察Cox-2選擇性抑制劑NS-398對人結(jié)腸癌細胞株HCT-8增殖及凋亡的影響，并探討其機制。方法 取對數(shù)生長期的HCT-8細胞，加入終濃度為0、10、20、40、80、160 μmol/L的NS-398進行干預(yù)，采用CCK-8法測定NS-398對人結(jié)腸癌HCT-8細胞的抑制率；采用流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞凋亡率，Hoechst 33342染色觀察凋亡細胞核形態(tài)；0、40、80、160 μmol/L的NS-398作用癌細胞24 h后，免疫細胞化學(xué)法檢測癌細胞Cox-2、Survivin蛋白表達；ELISA法檢測NS-398作用前后培養(yǎng)液中PGE2含量；酶標儀檢測Caspase-3/7的活性。結(jié)果 NS-398作用后結(jié)腸癌HCT-8細胞增殖受到抑制，抑制作用呈時間、濃度依賴性，40、80、160 μmol/L的NS-398作用后細胞生長抑制率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；FCM結(jié)果顯示，40、80、160 μmol/L的NS-398作用24 h后，細胞凋亡率分別為12%、17%及26%，且呈劑量依賴性；Hoechst 33342染色顯示，隨著NS-398濃度的增加，核呈致密濃染狀，熒光強度增加，細胞凋亡增加。40、80、160 μmol/L的NS-398作用24 h后，癌細胞Cox-2、Survivin蛋白表達較0 μmol/L的NS-398顯著減少，細胞培養(yǎng)上清液中PGE2含量較0 μmol/L的NS-398明顯下降；同時隨NS-398濃度的增加，Caspase-3/7活性上調(diào)，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論 NS-398可抑制人結(jié)腸癌HCT-8細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與抑制Cox-2和Survivin蛋白表達、上調(diào)Caspase-3/7活性及抑制PGE2生成有關(guān)。

結(jié)腸癌；Cox-2選擇性抑制劑；細胞凋亡；Survivin蛋白；Caspase-3/7

環(huán)氧合酶2（Cox-2）是合成前列腺素的重要限速酶，在結(jié)直腸癌中呈高表達［1］。非甾體抗炎藥NS-398是Cox-2選擇性抑制劑［2］，能較強地抑制Cox-2表達。凋亡抑制因子Survivin通過下調(diào)效應(yīng)分子Caspase-3、Caspase-7的活性阻止癌細胞凋亡［3］。2014年10月～2015年9月，我們觀察了Cox-2選擇性抑制劑NS-398對人結(jié)腸癌細胞株HCT-8的作用，并探討其可能機制，為結(jié)直腸癌的新輔助治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞與試劑：人結(jié)腸癌細胞株HCT-8、胰蛋白酶-EDTA消化液及Caspase-3/7活細胞熒光實時法檢測試劑盒均購自凱基生物科技發(fā)展有限公司；NS-398購自美國Cayman公司；RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Hoechst 33342染色液購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；人前列腺素E2（PGE2）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自美國R&D公司。儀器：BB16HF二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo electron corporation；SW-CJ-1FD超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TDL-50B低速臺式離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠；熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司；Spectra Max M2e多功能微孔板檢測系統(tǒng)購自美國Molecular Devices公司；FACS Aria TMllu流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞生長抑制率測算 采用CCK-8法。將HCT-8細胞培養(yǎng)于含胎牛血清10%，青霉素與鏈霉素1×105U/L的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HCT-8細胞，胰酶消化，調(diào)整細胞懸液濃度為1× 105/mL，接種于96孔板，設(shè)實驗組、對照組和空白組?？瞻捉M不進行任何干預(yù)，對照組加生理鹽水，實驗組加藥使NS-398終濃度為0、10、20、40、80、160 μmol/L，分別作用24、48 h后，每孔加入CCK-8試劑20 μL，4 h后采用多功能微孔板檢測系統(tǒng)于450 nm波長處測OD值。根據(jù)OD值計算細胞增殖抑制率（IR），IR=［1-（實驗組平均OD值-空白組平均OD值）/（對照組平均OD值-空白組平均OD值）］×100%。

1.3 細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染FCM法。取1×105/mL細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)瓶。0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，收集細胞，PBS清洗，離心，棄上清，1×Binding Buffer重懸細胞，分別加入Annexin V-FITC和Propidium I-odide染液，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.4 細胞凋亡形態(tài)觀察 采用Hoechst 33342染色法。將1×105/mL細胞懸液接種于6孔板中，每孔3 mL，0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，吸棄培養(yǎng)基，清洗，每孔加入Hoechst 33342染液1 mL，避光孵育25 min，清洗，熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.5 Cox-2和Survivin蛋白表達檢測 采用免疫細胞化學(xué)法。將1×105/mL細胞懸液接種于6孔板中。0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，細胞固定，按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察，隨機計數(shù)高倍視野的細胞。根據(jù)結(jié)腸癌細胞表達產(chǎn)物染色陽性率分級，大于75%為強陽性（+++），25%～75%為中度陽性（++），低于25%為弱陽性（+），無陽性表達為陰性（-）。

1.6 細胞上清液中PGE2含量測定 采用ELISA法檢測。取1×105/mL細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)瓶。0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，無菌管收集，2 000 r/min離心20 min后，按PGE2酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書制作標準曲線及檢測PGE2含量。

1.7 Caspase-3及Caspase-7活性測定 將1×105/ mL細胞懸液接種于96孔板，0、40、80、160 μmol/L NS-398作用24 h后，去除藥物，洗滌細胞，加入Caspase-3及Caspase-7檢測液，37℃，避光孵育30 min，多功能微孔板檢測系統(tǒng)在Ex/Em=511/533 nm波長處檢測熒光強度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度NS-398干預(yù)后HCT-8細胞生長抑制率比較 10、20、40、80、160 μmol/L的NS-398作用HCT-8細胞24 h后，HCT-8細胞的生長抑制率分別為（7.595 ±3.253）%、（9.944±4.543）%、（15.321±2.102）%、（26.232±3.690）%、（43.418±2.185）%，40、80、160 μmol/L的NS-398作用后HCT-8細胞生長抑制率明顯高于10、20 μmol/L的NS-398作用后，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。10、20、40、80、160 μmol/L的NS-398作用HCT-8細胞48 h后，HCT-8細胞的生長抑制率分別為（8.726±2.866）%、（11.867±3.453）%、（21.507±2.626）%、（36.856±2.241）%、（52.219± 2.549）%，40、80、160 μmol/L的NS-398作用后HCT-8細胞生長抑制率明顯高于10、20 μmol/L的NS-398作用后，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.2 不同濃度NS-398干預(yù)后HCT-8細胞凋亡率比較 HCT-8細胞凋亡在一定濃度范圍內(nèi)隨著NS-398藥物濃度的增加而增加，0、40、80、160 μmol/L 的NS-398作用HCT-8細胞24 h后，細胞凋亡率分別為3%、12%、17%及26%，不同濃度間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01），見圖1。

圖1 不同濃度NS-398作用24 h后HCT-8細胞凋亡率

2.3 細胞凋亡形態(tài)變化 0、40、80、160 μmol/L 的NS-398作用24 h后，熒光倒置顯微鏡下顯示一般正常細胞核為均勻的暗藍色；細胞發(fā)生凋亡則核為亮白色，呈碎塊狀或致密濃染，熒光強度增加。隨著NS-398濃度的增加，核呈致密濃染狀，熒光強度增加，細胞凋亡增加而導(dǎo)致細胞數(shù)量減少，見圖2。

圖2 熒光倒置顯微鏡下觀察不同藥物濃度NS-398作用24 h后的細胞凋亡情況（×200）

2.4 NS-398作用后HCT-8細胞中細胞Cox-2蛋白和Survivin蛋白表達比較 80 μmol/L的NS-398作用結(jié)腸癌細胞24 h后，與對照組相比，細胞中Cox-2及Survivin蛋白表達量顯著減少。Cox-2蛋白表達于細胞質(zhì)；Survivin蛋白表達于細胞核/質(zhì)。Cox-2陽性率由82%下降為24%，由強陽性變?yōu)槿蹶栃裕琒urvivin陽性率由79%下降為21%，同樣由強陽性變?yōu)槿蹶栃裕町惥薪y(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01），見圖3。

圖3 NS-398作用24 h后Cox-2和Survivin 在HCT-8細胞中的表達（二步法）

2.5 不同濃度NS-398作用后細胞培養(yǎng)上清液中PGE2的含量比較 PGE2含量隨NS-398濃度的增加而下降，呈劑量依賴性。0、40、80、160 μmol/L的NS-398作用細胞24 h后，細胞培養(yǎng)上清液中PGE2含量分別為（446.82±12.49）、（384.92±39.28）、（292.11±38.83）、（132.41±46.25）ng/L，各濃度間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.6 不同濃度NS-398作用后細胞中Caspase-3/7活性比較 隨著NS-398濃度的增高，Caspase-3/7活性明顯增加，且以高濃度為著，呈劑量依賴性。0、40、80、160 μmol/L的NS-398作用細胞24 h后，Caspase-3/7活性分別為1 260.17±151.13、1 489.99±128.24、1 718.27±159.41、1 967.04± 95.40，各濃度間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

3 討論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其癌譜位置不斷攀升［4］。雖然近年有關(guān)結(jié)直腸癌的研究已取得較大進展，但治療效果仍不十分滿意。本課題從腫瘤的自主增殖和凋亡失調(diào)的角度出發(fā)，研究Cox-2選擇性抑制劑抗腫瘤作用機制。

Survivin作為凋亡抑制蛋白（IAP）家族最強的凋亡抑制因子可抑制細胞凋亡，主要發(fā)揮負調(diào)控作用［5，6］。Caspase-3和Caspase-7是凋亡促進因子Caspase家族成員，具有誘導(dǎo)凋亡作用［7］。近年多篇文獻［8，9］報道了Survivin已廣泛表達于胃癌、食管癌、肺癌、宮頸癌等多種人類惡性腫瘤。國內(nèi)學(xué)者對結(jié)直腸癌的研究［10］發(fā)現(xiàn)，癌組織中的Survivin蛋白表達明顯高于正常對照黏膜，且與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移及Duke′s分期密切相關(guān)。Survivin對細胞有絲分裂具有調(diào)節(jié)作用，并抑制細胞發(fā)生凋亡，與癌細胞的惡性度有關(guān)［11］。因此，如果Cox-2選擇性抑制劑能抑制結(jié)直腸癌中Survivin表達，促進腫瘤細胞凋亡，則有望為結(jié)直腸癌患者的靶向治療提供理論依據(jù)。

Cox是合成前列腺素的重要限速酶。其中Cox-2為誘導(dǎo)型酶，正常情況下一般不表達，癌蛋白、炎癥刺激和細胞因子等可刺激Cox-2表達［12］，促進炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究［13］顯示，Cox-2蛋白在結(jié)腸癌的早期階段如腺瘤中呈高表達狀態(tài)。Cox-2選擇性抑制劑NS-398能較強抑制Cox-2表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，非甾體類抗炎藥具有抗腫瘤作用，主要通過抑制Cox-2表達實現(xiàn)［14］。NS-398是否通過抑制Cox-2表達導(dǎo)致結(jié)腸癌HCT-8細胞凋亡及癌細胞中Cox-2與Survivin蛋白表達是否有關(guān)需進一步探討。Cox-2與Survivin在多種腫瘤細胞中共同表達，且二者在刺激細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成、抑制細胞凋亡及促進腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移等方面有類似作用機制。多項研究表明，在胰腺癌［15］、胃癌［16］、宮頸癌［17］、肺癌［18］等多種腫瘤中Cox-2與Survivin表達呈正相關(guān)，推測Cox-2可能是通過上調(diào)Survivin表達而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。此外，Cox-2能影響Survivin表達，Cox-2選擇性抑制劑能顯著降低Survivin在腫瘤細胞中的水平［19，20］。這提示Cox-2選擇性抑制劑可能通過抑制Cox-2表達從而影響Survivin水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，NS-398對結(jié)腸癌HCT-8細胞生長有抑制作用，且呈時間和濃度依賴性。FCM結(jié)果提示，NS-398在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性增加HCT-8細胞凋亡，這表明NS-398主要通過誘導(dǎo)凋亡作用而抑制結(jié)腸癌細胞增殖。Hoechst 33342染色觀察凋亡細胞核形態(tài)亦證實了這一點。研究［21］表明，Cox-2選擇性抑制劑可能通過下調(diào)Survivin水平，上調(diào)Caspase-3表達，誘導(dǎo)食管癌細胞凋亡。目前關(guān)于NS-398對結(jié)腸癌的作用是否通過Survivin基因的下調(diào)引起細胞凋亡研究報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，80 μmol/L的NS-398作用癌細胞24 h后，Cox-2、Survivin表達量較0 μmol/L的NS-398顯著減少；同時Caspase-3/7活性明顯增加。Cox-2與Survivin表達密切相關(guān)，而Survivin與Caspase-3/7表達呈明顯負相關(guān)。NS-398可能通過抑制Cox-2表達，進而抑制Survivin表達，上調(diào)Caspase-3/7的活性，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞發(fā)生凋亡。

研究［22］發(fā)現(xiàn)，Cox-2選擇性抑制劑可使PGE2生成減少，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制作用。本研究結(jié)果顯示，80 μmol/L的NS-398作用HCT-8細胞24 h后，PGE2含量明顯低于0 μmol/L的NS-398，而Cox-2蛋白表達與PGE2水平呈正相關(guān)。因此可以推測PGE2表達降低可能是Cox-2選擇性抑制劑誘導(dǎo)凋亡的又一證據(jù)，其具體機制有待進一步探討。

綜上所述，NS-398能顯著抑制結(jié)腸癌HCT-8生長，主要通過誘導(dǎo)凋亡作用實現(xiàn)。其誘導(dǎo)凋亡作用機制可能是通過抑制Cox-2、Survivin蛋白表達，上調(diào)Caspase3/7活性及抑制PGE2含量而實現(xiàn)的。本研究有望為結(jié)直腸癌等惡性腫瘤患者的靶向治療提供理論依據(jù)。與此同時，Cox-2選擇性抑制劑誘導(dǎo)凋亡的具體機制尚未闡明，有待更進一步探討。

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Effect and mechanism of NS-398 on proliferation and apoptosis of human colorectal carcinoma HCT-8 cells

ZHANG Xiaoxian1，SUN Jianjing，LIU Hua，LUO Qiang，ZHANG Linxi
（1 Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

Objective To observe the effects of cyclooxygenase-2（Cox-2）selective inhibitor NS-398 on proliferation and apoptosis of colorectal carcinoma HCT-8 cells and to investigate its mechanism.Methods HCT-8 cells in the logarithmic phase were added with 0，10，20，40，80 and 160 μmol/L NS-398 to intervene.The inhibition rate of colorectal carcinoma HCT-8 cells was detected by CCK-8 kit，apoptosis rate was determined by flow cytometry and the cells were stained by Hoechst 33342 and observed under fluorescent inverted microscope further.After HCT-8 cells were treated by 0，40，80 and 160 μmol/L NS-398 for 24 hours，the protein expression of Cox-2 and Survivin were detected by immunocytochemical staining.ELISA analysis were performed to detect PGE2concentration in the culture supernatant of HCT-8，and meanwhile，the activities of Caspase-3/7 were analyzed by automatic fluorescence enzyme-linked immunoassay detector.Results NS-398 inhibited the proliferation of HCT-8 cells in a time-and concentration-dependent manner，and there were significantly differences among the 40，80 and 160 μmol/L NS-398 concentration groups（all P＜0.05）.Flow cytometry revealed，the apoptosis rates were 12%，17%and 26%after treated by 40，80 and 160 μmol/L NS-398 for 24 hours，which was in a dose-dependent manner.Hoechst 33342 staining revealed，the apoptosis increased and cell nucleus showed highdensity fluorescence with the increase of NS-398 concentration.The expression of Cox-2 and Survivin decreased significantly after treated by 40，80 and 160 μmol/L NS-398 for 24 hours，and the level of PGE2 production also significantly decreased as compared with the group of 0 μmol/L NS-398.Meanwhile，the activity of Caspase-3/7 was activated by NS-398 in a dose-dependent manner.Conclusion Cox-2 selective inhibitor NS-398 can inhibit proliferation and induce apoptosisof the colorectal carcinoma HCT-8 cells by down-regulating the expression of Cox-2 and Survivin，PGE2 production and upregulating the activity of Caspase-3/7.

colorectal carcinoma；cyclooxygenase-2 selective inhibitor；apoptosis；Survivin protein；Caspase-3/7

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.003

R979.1；R735.35

A

1002-266X（2016）25-0008-05

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目（ZD20131004）。

張曉賢（1987-），女，碩士，主要研究方向為消化道腫瘤發(fā)病機制及臨床研究。E-mail：15369318106@163.com

簡介：張林西（1968-），男，教授，博士，主要研究方向為消化道腫瘤病理及發(fā)病機制。E-mail：zlxwxl@163.com

2016-03-11）