甲基阿魏酸對TGF-β1刺激人肝星狀細胞增殖及活化的抑制作用

熊美麗，李勇文，李麗，楊成芳，鐘毓娟（桂林醫(yī)學院，廣西桂林541000）

·論著·

甲基阿魏酸對TGF-β1刺激人肝星狀細胞增殖及活化的抑制作用

熊美麗，李勇文，李麗，楊成芳，鐘毓娟
（桂林醫(yī)學院，廣西桂林541000）

目的 探討甲基阿魏酸（MFA）對轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1刺激人肝星狀細胞（HSC）-LX-2增殖及活化的抑制作用。方法 將體外培養(yǎng)的HSC-LX-2細胞作為正常對照組，采用1 μg/L TGF-β1刺激HSC-LX-2進行細胞造模為模型組，藥物組含終質(zhì)量濃度為1 μg/L的TGF-β1和0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mg/L的MFA。根據(jù)MTT法檢測MFA對藥物組HSC-LX-2細胞增殖的影響，選擇MFA作用濃度為1.25、2.5、5 mg/L作為低、中、高劑量組，將細胞孵育72 h后，采用RT-PCR法檢測各組α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA、Ⅰ型前膠原（PCⅠ）mRNA表達；采用Western blotting法檢測各組α-SMA蛋白表達；采用ELISA法檢測各組PCⅠ蛋白表達。結(jié)果 在0.312 5～5 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著MFA質(zhì)量濃度升高，HSC-LX-2細胞生長抑制率逐漸升高，呈濃度依賴性（P均＜0.05）；當MFA質(zhì)量濃度大于10 mg/L時，HSC-LX-2生長抑制率逐漸降低（P均＜0.05）。在1.25～5.0 mg/L范圍內(nèi)隨MFA質(zhì)量濃度逐漸增高，HSC-LX-2細胞中α-SMA及PCⅠ的mRNA及蛋白表達量逐漸降低（P均＜0.05）。結(jié)論 MFA可抑制TGF-β1刺激的人肝星狀細胞-LX-2增殖，減弱α-SMA、PCⅠ表達，抑制HSC-LX-2細胞外基質(zhì)的合成及HSC-LX-2表型的轉(zhuǎn)化。

肝纖維化；人肝星狀細胞；甲基阿魏酸；轉(zhuǎn)化生長因子β1；細胞增殖；α-平滑肌肌動蛋白；Ⅰ型前膠原

肝星狀細胞（HSC）-LX-2是肝纖維化形成過程中的重要細胞來源［1］，當外界刺激因子導致肝臟發(fā)生損傷時，HSC-LX-2被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞并表達大量的α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），最終導致肝纖維化的形成［2］。目前普遍認為α-SMA是HSC-LX-2活化的重要標志。Ⅰ型前膠原（PCⅠ）是肝纖維化形成時細胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分，可用于判斷肝纖維化的嚴重程度及抗肝纖維化治療的效果［3］。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1是肌纖維母細胞激活因子，其中TGF-β1具有強大的促纖維化作用［4］。在纖維化過程中，TGF-β與細胞分化和細胞外基質(zhì)沉積密切相關(guān)，其能增加多種ECM合成，減少基質(zhì)降解酶產(chǎn)生并促進酶活性抑制物的合成，還能調(diào)節(jié)整合素的表達。TGF-β信號通路有兩條，即Smad依賴性通路和p38/MAPK信號通路，其通過TGF-β1/Smad信號傳導通路調(diào)節(jié)ECM表達［5，6］，導致肝纖維化的發(fā)生。甲基阿魏酸（MFA）是從蟬翼藤中提取的單體，蟬翼藤具有較強的抗菌消炎、抗癌、免疫增強等多種活性［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)，MFA對鼠肝星狀細胞（HSC-T6）增殖及膠原合成具有明顯抑制作用［8，9］。2015年1月～2016年3月，我們采用MFA對人HSC-LX-2的活化標志物α-SMA及PCⅠ進行干預(yù)，探討MFA對TGF-β1刺激HSC-LX-2增殖及活化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人源性肝星狀細胞株HSC-LX-2購于博慧斯（無錫）生物醫(yī)藥科技有限公司。MFA（美國Sigma公司，批號101236152）；TGF-β1（Novoprotein公司，批號PO1137）；MTT（美國Sigma公司，批號M2128）；普通ECL Plus發(fā)光液（泛博生化，北京）；RNApure高純總RNA快速提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN）；鼠抗人GAPDH單克隆抗體、鼠抗人α-SMA單克隆抗體（中杉金橋，北京）；人PCⅠ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（南京建成）；高糖DMEM培養(yǎng)基、Hyclone胎牛血清（Thermo）；青、鏈霉素（碧云天生物技術(shù)研究所，南通）。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo，Model 311）；酶標儀（美國Thermo，Model 450）；多通道PCR儀（美國MJ公司，PTC-220）；電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng) HSC-LX-2置于含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。當細胞生長呈單層致密狀態(tài)時，用0.25%EDTA胰蛋白酶消化，每2～3 d按1∶2進行傳代。

1.3 MFA干預(yù)后HSC-LX-2細胞抑制率測算采用MTT法。將HSC-LX-2細胞以4×103/孔接種于96孔板，細胞貼壁生長良好后將細胞分為正常對照組、模型組和藥物組，并設(shè)復(fù)孔，更換含刺激源和成倍比稀釋藥物的培養(yǎng)液各180 μL。正常對照組不進行刺激源及藥物干預(yù)，模型組僅含終質(zhì)量濃度為1 μg/L TGF-β1，各藥物組含終質(zhì)量濃度為1 μg/L TGF-β1和終質(zhì)量濃度分別為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mg/L的MFA。培養(yǎng)72 h后，各孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清液，每孔加入200 mL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，于酶標儀單波長（490 nm）處測定光密度（OD）值，計算細胞抑制率，評價MFA對HSC-LX-2的增殖抑制作用。細胞抑制率（%）=（模型組OD值-藥物組OD值）/模型組OD 值×100%。

1.4 HSC-LX-2中α-SMA及PCⅠmRNA表達測定采用RT-PCR法將細胞以5×107/L接種于10 cm培養(yǎng)皿中，細胞分為正常對照組、模型組、MFA低劑量組、MFA中劑量組、MFA高劑量組，正常對照組僅含細胞培養(yǎng)液，模型組不含TGF-β1，MFA低劑量組給予1 μg/L TGF-β1+1.25 mg/L MFA，MFA中劑量組給予1 μg/L TGF-β1+2.5 mg/L MFA，MFA高劑量組給予1 μg/L TGF-β1+5 mg/L MFA。細胞貼壁生長良好后，更換各組含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集細胞，按照艾德萊總RNA提取說明書，采用TRIzol法抽提細胞中總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量及純度，OD260/OD280均在1.8～2.0。取cDNA 5 μg，采用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank查找基因序列并設(shè)計引物，以β-actin為內(nèi)參。α-SMA引物序列：FP：5′-CTGTTCCAGCCATCCTTCAT-3′；RP：5′-CCGTGATCTCCTTCTGCATT-3′，產(chǎn)物長度175 bp。PCⅠ引物序列：FP5′-CCTCAAGGCTCCAACGAG-3′，RP5′-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3′，產(chǎn)物長度117 bp。βactin引物序列：FP：5′-CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′；RP：5′-CGTACAGGTCTTTGCGGATGTC-3′，產(chǎn)物長度105 bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55 ℃/60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共反應(yīng)35個循環(huán)，最終產(chǎn)物72℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后分別取10 μL RTPCR產(chǎn)物及10 μL DNA marker進行2%瓊脂糖凝膠電泳，Gel Doc XR系統(tǒng)檢測OD值。Quantity One軟件進行分析，將α-SMA及PCⅠ的mRNA與內(nèi)參β-actin mRNA的OD比值進行半定量分析。

1.5 HSC-LX-2中α-SMA蛋白表達測定 采用Western blotting法。細胞分組同1.4，培養(yǎng)72 h后收集細胞，冰上PBS液漂洗3次，加入RIPA裂解緩沖液裂解，收集細胞裂解物。于4℃、12 000 r/min離心15 min。離心后取上清液。BCA法測定上清液總蛋白含量，取100 μg總蛋白的上清液，煮沸5 min后進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（PVDF膜使用前用甲醇浸泡2 min），將質(zhì)量分數(shù)為5%的含TBST脫脂奶粉室溫封閉1 h后，用TBST洗脫4次，每次7 min。然后加入α-SMA一抗（1∶500）孵育，室溫孵育2 h后放置4℃搖床過夜（16～18 h），再用TBST沖洗4次，每次7 min，再與辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）作用1 h，再用TBST沖洗4次，每次7 min，反應(yīng)信號經(jīng)ECL底物化學發(fā)光顯色。GAPDH為內(nèi)參。

1.6 HSC-LX-2中PCⅠ蛋白表達測定 采用ELISA法。細胞分組同RT-PCR法，分別取各組細胞培養(yǎng)液和標準品各50 μL及HRP 50 μL，加入孔內(nèi)，37℃孵育60 min，洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min，加終止液，10 min內(nèi)混勻后隨即在酶標儀450 nm波長處測定OD值，根據(jù)標準曲線及OD值計算PCⅠ蛋白表達。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。作圖軟件為GraphPad Prism 5。計量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度MFA對HSC-LX-2的生長抑制作用 MFA作用HSC-LX-2 72 h后，當MFA質(zhì)量濃度小于5 mg/L時，HSC-LX-2細胞生長抑制率隨MFA質(zhì)量濃度增加而升高，當MFA質(zhì)量濃度大于10 mg/L時細胞生長抑制率隨MFA質(zhì)量濃度增加而降低，見表1。5 mg/L MFA對HSC-LX-2的生長有較高抑制率，因此選用MFA劑量相對較小、抑制率相對較高的1.25、2.5、5 mg/L作為低、中、高劑量藥物組，開展后續(xù)實驗。

2.2 MFA對HSC-LX-2α-SMA及PCⅠmRNA表達的影響 經(jīng)刺激源和藥物處理HSC-LX-2 72 h后，α-SMA mRNA和PCⅠmRNA表達隨MFA質(zhì)量濃度增高而逐漸降低（P均＜0.05），與正常對照組比較，模型組α-SMA mRNA和PCI mRNA表達增高；與模型組比較，MFA低、中、高劑量（1.25、2.5、5 mg/L）組α-SMA mRNA和PCI mRNA表達均降低，且隨MFA濃度的升高α-SMA mRNA和PCI mRNA表達量逐漸降低（P均＜0.05）。見圖1、表2。

表1 MFA作用72 h后各組HSC-LX-2細胞抑制率比較±s）

表1 MFA作用72 h后各組HSC-LX-2細胞抑制率比較±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP ＜0.05，dP＜0.01；與MFA 1.25 mg/L比較，eP＜0.05，fP＜0.01；與MFA 2.5 mg/L比較，gP＜0.05，hP＜0.01。

組別OD值細胞抑制率（%）0.480±0.016-模型組0.556±0.076a-藥物組MFA 0.312 5 mg/L0.453±0.01821.267 MFA 0.625 mg/L0.450±0.02622.043 MFA 1.25 mg/L0.395±0.029c33.857 MFA 2.5 mg/L0.331±0.019ce46.912 MFA 5 mg/L0.222±0.026ceg70.935 MFA 10 mg/L0.315±0.01849.938 MFA 20 mg/L0.379±0.02636.838正常對照組MFA 40 mg/L0.471±0.01718.065

圖1 MFA作用下各組HSC-LX-2的α-SMA 及PCⅠmRNA表達

表2 MFA作用下各組HSC-LX-2的α-SMA 及PCⅠmRNA表達比較±s）

表2 MFA作用下各組HSC-LX-2的α-SMA 及PCⅠmRNA表達比較±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與MFA低劑量組比較，cP＜0.05；與MFA中劑量組比較，dP＜0.05。

組別α-SMA mRNAPCⅠmRNA正常對照組0.784±0.1490.059±0.011模型組1.513±0.173a0.262±0.013aMFA低劑量組1.164±0.139ab0.218±0.027abMFA中劑量組0.651±0.115abc0.155±0.027abcMFA高劑量組0.359±0.102abcd0.084±0.026bcd

2.3 MFA對HSC-LX-2細胞中α-SMA、PCⅠ蛋白表達的影響 經(jīng)刺激源和藥物處理HSC-LX-2 72 h后，α-SMA和PCⅠ蛋白表達水平隨MFA質(zhì)量濃度的增高逐漸降低（P均＜0.05），與正常對照組比較，模型組兩蛋白表達增高；與模型組比較MFA低、中、高劑量組兩蛋白表達均降低，且隨MFA濃度的升高蛋白表達量依次降低（P均＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 MFA作用下各組HSC-LX-2的α-SMA 及PCⅠ蛋白表達

表3 MFA作用下各組HSC-LX-2的α-SMA 及PCⅠ蛋白表達比較±s）

表3 MFA作用下各組HSC-LX-2的α-SMA 及PCⅠ蛋白表達比較±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與MFA中劑量組比較，cP＜0.05；與MFA中劑量組比較，dP＜0.05。

組別α-SMA蛋白PCⅠ蛋白正常對照組0.812±0.0740.421±0.058模型組1.140±0.220a2.045±0.035aMFA低劑量組0.634±0.99ab0.645±0.035abMFA中劑量組0.453±0.154abc0.109±0.013abcMFA高劑量組0.282±0.095abcd0.045±0.025abcd

3 討論

HSC正常生理狀態(tài)下增殖較慢，主要參與維生素A的代謝，并產(chǎn)生少量的ECM。在致病因子的作用下，特別是病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、中毒性肝病時，HSC-LX-2被激活、活化轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，產(chǎn)生大量的ECM導致肝臟內(nèi)膠原纖維不斷沉積，并表達大量的α-SMA和膠原類物質(zhì)（PCⅠ為主）［10］，進一步導致肝臟內(nèi)部結(jié)構(gòu)重建，故肝纖維化發(fā)生的主要原因與ECM生成增多有關(guān)［11，12］。因此，HSC是治療肝纖維化的一個重要靶點，而α-SMA及PCⅠ大量表達是HSC活化的重要標志。MFA是從蟬翼藤屬中提取的活性單體，我們研究發(fā)現(xiàn)MFA對CCl4致急性肝損傷小鼠有一定的保護作用［13］。MFA通過對大鼠肝星狀細胞干預(yù)后，檢測細胞上清液中羥脯氨酸、金屬蛋白酶組織抑制因子和透明質(zhì)酸含量降低，從而使ECM合成減少，肝纖維化減輕［9］。本研究結(jié)果表明MFA對HSC-LX-2的增殖有抑制作用，且在一定濃度范圍內(nèi)（1.25～5 mg/L）呈劑量依賴性。

α-SMA主要分布于血管平滑肌，具有一定的收縮功能并參與維持血管的正常結(jié)構(gòu)與功能。在肝臟受到損傷時，纖維化區(qū)HSC大量表達α-SMA，因此α-SMA常作為HSC活化的重要標志。研究［14］表明α-SMA表達水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)。Ⅰ型前膠原作為肝纖維化組織中一種重要的ECM，主要由激活的HSC產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，模型組α-SMA及PCⅠ的mRNA及蛋白表達均升高，表明活化的HSC-LX-2細胞模型造模成功。α-SMA及PCⅠ在MFA（1.25、2.5、5 mg/L）任一濃度干預(yù)下均有不同程度的抑制作用，其中以5 mg/L效果顯著。MFA各濃度劑量組與模型組比較纖維化程度有所減輕，證實MFA在合適濃度范圍內(nèi)有一定抑制肝纖維化的作用。

綜上所述，MFA可抑制TGF-β1刺激HSC-LX-2細胞增殖及活化，從mRNA及蛋白水平上均減弱了α-SMA、PCⅠ表達，而HSC-LX-2活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主要途徑之一。以此我們推測MFA可抑制肝纖維化的發(fā)展，但MFA是否直接通過減弱α-SMA、PCⅠ的表達來發(fā)揮抗肝纖維化的作用機制還有待進一步證明。

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Inhibitory effect of meth-ferulic acid on proliferation and activation of TGF-β1-induced human hepatic stellate cells

XIONG Meili，LI Yongwen，LI Li，YANG Chengfang，ZHONG Yujuan
（Guilin Medical University，Guilin 541000，China）

Objective To investigate inhibitory effect of meth-ferulic acid（MFA）on proliferation and activation of transforming growth factor-β1（TGF-β1）-induced human hepatic stellate cells（HSC-LX-2）.Methods HSC-LX-2 were cultured in vitro as the contol group and using 1 μg/L TGF-β1to stimulate HSC-LX-2 as the model group.Meanwhile，the drug intervention group contained 1 μg/L TGF-β1and 0.312 5，0.625，1.25，2.5，5，10，20 and 40 mg/L MFA.MTT assay was used to evaluate the effect of MFA on the proliferation of HSC-LX-2 in the model group and the drug intervention group，then the we chose the suitable concentrations of MFA into the low-dose，medium-dose and high-dose groups（1.25，2.5 and 5.0 mg/L）.After 72 h incubation，the mRNA expression of α-SMA and PCⅠin the above five groups was determined by RT-PCR，the protein expression of α-SMA was determined by Western blotting，and the protein expression of PCⅠin each group was determined by ELISA.Results With the increasing MFA concentration in the range of 0.312 5-5 mg/L，the growth inhibition rate of HSC-LX-2 cell accelerated proportionally，which was in a dose-dependent manner（all P＜0.05）.However，when the MFA cell concentration was greater than 10 mg/L，the growth inhibition rate decreased.Similarly，within a certain concentration range（1.25-5.0 mg/L），as MFA concentration increased，we found that the expression of α-SMA and PCⅠin HSC-LX-2 cells declined progressively（all P＜0.05）.Conclusion MFA may inhibit the proliferation，down-regulate the mRNA and protein expression of α-SMA and PCⅠin the TGF-β1-induced HSC-LX-2 and inhibit the extracellular matrix synthesis and phenotype transformation of HSC-LX-2.

liver fibrosis；human hepatic stellate cells；meth-ferulic acid；transforming growth factor β1；cell proliferation；α-smooth muscle actin；procollagenⅠ

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.001

R657.31

A

1002-266X（2016）25-0001-04

國家自然科學基金資助項目（81360497）；廣西高等學校優(yōu)秀中青年骨干教師培養(yǎng)工程項目。

熊美麗（1991-），女，在讀研究生，主要研究方向為肝纖維化基礎(chǔ)與臨床。E-mail：xiongmeili12345@163.com

簡介：李勇文（1969-），男，博士，教授，主要研究方向為肝纖維化基礎(chǔ)與臨床。E-mail：liyongwen99@163.com

2016-01-15）