響應(yīng)面法優(yōu)化雞胸肉肌原纖維蛋白酶法水解工藝條件

白騰輝,馬亞萍,康壯麗,潘潤(rùn)淑,馬漢軍

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

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響應(yīng)面法優(yōu)化雞胸肉肌原纖維蛋白酶法水解工藝條件

白騰輝,馬亞萍,康壯麗,潘潤(rùn)淑,馬漢軍*

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

以雞胸肉為原料,提取肌原纖維蛋白,測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度及氨基酸組成;以水解度為測(cè)定指標(biāo),利用響應(yīng)面法優(yōu)化該肌原纖維蛋白酶解工藝條件,并考察其產(chǎn)物肽分子量分布。結(jié)果表明:提取的肌原纖維蛋白濃度為59.27%;該蛋白氨基酸種類(lèi)齊全,組成比例均衡,必需氨基酸含量高達(dá)40.90%;堿性蛋白酶是肌原纖維蛋白酶解的最佳用酶;在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,經(jīng)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白最佳工藝條件為:加酶量3500 U/g、pH7.8、溫度44 ℃,此條件下經(jīng)6 h酶解,水解度達(dá)33.17%;肽分子量分布分析知,最佳水解條件下酶解液中<1000 Da的小肽含量高達(dá)61.5%,說(shuō)明堿性蛋白酶能較高程度的水解肌原纖維蛋白。

肌原纖維蛋白,酶解,響應(yīng)面法,蛋白質(zhì)提取率,水解度

雞肉是增長(zhǎng)速度快、供應(yīng)足、物美價(jià)廉的優(yōu)質(zhì)肉類(lèi),以肉質(zhì)柔軟、高蛋白、低脂肪、低膽固醇和低熱量等著稱(chēng),且肉性偏溫,有補(bǔ)氣、調(diào)髓補(bǔ)精等功效,是理想的動(dòng)物性蛋白來(lái)源[1]。據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì),2013年中國(guó)雞肉產(chǎn)量約1400萬(wàn)t,已成為世界第二大雞肉生產(chǎn)、消費(fèi)和貿(mào)易國(guó)家[2]。然而,中國(guó)用于深加工的雞肉量還不足總量的6%,且存在著產(chǎn)品種類(lèi)較少、科技含量低、附加值低等不足,缺乏行業(yè)抗風(fēng)險(xiǎn)能力及在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力[3],因此發(fā)展雞肉的精深加工迫在眉睫。最新研究表明,雞肉蛋白經(jīng)酶法水解,是改善雞肉消化吸收率和綜合利用效率的有效途徑之一。如Rojas等研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后的消化吸收率顯著提高[4],Saiga等從雞胸肉酶解產(chǎn)物中分離出降血壓肽[5],Seth等報(bào)道了雞肉酶解物促鐵吸收功效和機(jī)理研究[6],國(guó)內(nèi)劉改英等采用響應(yīng)面法優(yōu)化了復(fù)合蛋白酶水解雞肉蛋白的工藝[7],趙謀明等系統(tǒng)研究了以雞肉蛋白酶解物通過(guò)Maillard反應(yīng)制備風(fēng)味香精的方法[8-10]。

有研究表明,從肌肉中提取出蛋白質(zhì)再水解,可更好的獲取酶解產(chǎn)物中的功能性成分[11-12];而Mohr等也發(fā)現(xiàn)魚(yú)肉中大部分水溶性蛋白熱變性后不利于被酶作用轉(zhuǎn)化成可溶性氮[13]。所以,從雞肉中提取出肌原纖維蛋白,再經(jīng)蛋白酶解水解是提高酶解效率的有效途徑。然而,目前國(guó)內(nèi)外在蛋白酶解方面研究多采用單一酶對(duì)雞肉或雞肉蛋白進(jìn)行水解。有鑒于此,本實(shí)驗(yàn)以雞胸肉為原料提取肌原纖維蛋白,分析了該蛋白的氨基酸組成,篩選了其水解最佳用酶,通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)最優(yōu)酶酶解肌原纖維蛋白酶解的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并以酶解液肽分子量分布評(píng)估其酶解效果,以期為雞肉蛋白酶解的機(jī)理研究及酶解產(chǎn)物生物活性肽的制備提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雞胸肉當(dāng)?shù)爻?胰蛋白酶酶活力250 U/mg,aladdin,上海晶純生化科技股份有限公司;胃蛋白酶酶活力15000 U/mg,aladdin,上海晶純生化科技股份有限公司;木瓜蛋白酶酶活力≥3 U/mg,aladdin,上海晶純生化科技股份有限公司;堿性蛋白酶酶活力≥200 U/mg,Solarbio,北京索萊寶科技有限公司;中性蛋白酶酶活力≥60 U/mg Solarbio,北京索萊寶科技有限公司;甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸鹽等,實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為分析純。

FA224型電子天平上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器江蘇正基儀器有限公司;SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器江蘇省金壇市華峰儀器有限公司;電子萬(wàn)用爐北京光明醫(yī)療儀器廠(chǎng);PHS-3C型精密pH計(jì)上海雷磁儀器廠(chǎng);Waters 600高效液相色譜儀 USA;KjeltecTM8400全自動(dòng)凱氏定氮儀,FOSS Denmark;MULTIFUGE XIR型冷凍離心機(jī),Thermo German等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肌原纖維蛋白的提取參照Wonnop Visessanguan等[14]的方法:取雞胸肉20 g,加入10倍體積磷酸酸鹽緩沖液A(15.6 mmol/L Na2HPO4,3.5 mmol/L KH2PO4,pH7.5),組織搗碎機(jī)10000 r/min下均質(zhì)1 min,勻漿在冷凍離心機(jī)中離心(5000 r/min,15 min),此提取過(guò)程重復(fù)操作二次。取上清液部分,加入50% TCA使上清液最終TCA濃度達(dá)到10%,離心機(jī)中5000 r/min離心15 min,上清液部分為非蛋白氮,沉淀部分為肌漿蛋白。在沉淀部分加入10倍體積磷酸酸鹽緩沖液B(0.45 mol/L KCl,15.6 mmol/L Na2HPO4,3.5 mmol/L KH2PO4,pH7.5)于組織搗碎機(jī)中10000 r/min下均質(zhì)1 min,勻漿在離心機(jī)中離心(5000 r/min,15 min),此提取過(guò)程重復(fù)操作二次,合并上清液得鹽溶部分,即肌原纖維蛋白。并用微量凱氏定氮法[15]測(cè)定提取出的肌原纖維蛋白濃度。

1.2.2肌原纖維蛋白氨基酸組成分析將樣品置于水解管中,加入6 mol/L 的HCl溶液,真空封口,在110 ℃下水解24 h,冷卻后定容、過(guò)濾、蒸干,再加入0.02 mol/L的HCl溶液在空氣中放置30 min,采用HPLC測(cè)定除色氨酸以外的氨基酸含量,檢測(cè)條件:美國(guó)Waters高效液相色譜,PICO.TAG氨基酸分析柱,柱溫38 ℃,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.2.3酶解工藝流程稱(chēng)取肌原纖維蛋白1 g→溶于50 mL磷酸鹽緩沖液B(詳見(jiàn)1.2.1)→調(diào)pH→加定量酶→恒溫水浴震蕩酶解→沸水浴滅酶10 min→冷卻至室溫→6000 r/min 4 ℃離心20 min→取上清液→測(cè)定各指標(biāo)。

操作要點(diǎn):

定量酶的加入:依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以“酶量/底物蛋白”,即“U/g”的形式,并參考生產(chǎn)商推薦的各酶酶活力來(lái)加入定量的水解酶。

恒溫水浴震蕩酶解:酶解開(kāi)始前將加入的酶均勻混入酶解反應(yīng)體系。

1.2.4水解酶的選擇分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶對(duì)提取的肌原纖維蛋白按照1.2.3的步驟進(jìn)行水解,各酶作用條件根據(jù)廠(chǎng)家推薦參數(shù)(見(jiàn)表1)。通過(guò)水解度、蛋白質(zhì)提取率、水解液風(fēng)味及外觀(guān)來(lái)確定肌原纖維蛋白酶解的較佳用酶。

表1　各酶較適宜的水解條件[16]

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1加酶量對(duì)酶解效率的影響取1.2.4中肌原纖維蛋白酶解的較佳用酶,在2%的肌原纖維蛋白液中加入1000、2000、3000、4000、5000 U/g的蛋白酶,對(duì)酶解液的水解度和蛋白質(zhì)提取率進(jìn)行分析,酶解體系的pH8.5、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間4 h。

1.2.5.2pH對(duì)酶解效率的影響以1.2.5.1中優(yōu)化的最佳酶濃度,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,分析各組酶解液的水解度和蛋白質(zhì)提取率,酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間4 h。

1.2.5.3酶解溫度對(duì)酶解效率的影響以1.2.5.1中優(yōu)化的最佳酶濃度,并按1.2.5.2優(yōu)化的最佳pH調(diào)節(jié)反應(yīng)體的pH,分別在35、40、45、50、55 ℃的環(huán)境下對(duì)各反應(yīng)組進(jìn)行4 h的水解,分析不同酶解溫度對(duì)各組酶解液的水解度和蛋白質(zhì)提取率。

1.2.5.4酶解時(shí)間對(duì)酶解效率的影響在1.2.5.1、1.2.5.2與1.2.5.3優(yōu)化的最佳酶解條件下,對(duì)酶解體系進(jìn)行2、4、6、8、10 h水解,以酶解液的水解度和蛋白質(zhì)提取率為測(cè)定指標(biāo),確定較佳酶解時(shí)間。

1.2.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,以肌原纖維蛋白酶解過(guò)程中的水解度為響應(yīng)值,選取加酶量、pH及溫度為影響因子,進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),確定肌原纖維蛋白酶解的最佳工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.2.7肌原纖維蛋白的水解度測(cè)定采用甲醛滴定法[17],取離心后的肌原纖維蛋白酶解液5 mL于100 mL容量瓶中,定容、混勻后取20 mL于200 mL燒杯中,加入60 mL去CO2水,用0.05 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至pH 8.2。加入10 mL甲醛溶液,混勻后再用0.05 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液繼續(xù)滴定至pH9.2,同時(shí)用蒸餾水代替酶解液做空白對(duì)照。記錄所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積,計(jì)算肌原纖維蛋白的水解度(DH)。

式中,c為標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度,mol/L;V1為樣品消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,mL;V2為試劑空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,mL;V3為試劑稀釋液取用量,為1mL(5mL酶解液定容100mL后取用20mL);S為底物蛋白濃度,2%;W為提取的肌原纖維蛋白的純度,凱氏定氮法測(cè)得59.27%;htot為蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù),由2.1肌原纖維蛋白氨基酸組成測(cè)得,為7.54mmol/g。

1.2.8蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定以上清液中總蛋白質(zhì)量和底物蛋白質(zhì)量的百分比表示,即:

蛋白質(zhì)提取率F(%)=(W1×6.25)/W2×100

式中:W1為酶解物上清液中的總氮含量;6.25為肉類(lèi)蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù);W2為酶解前肌原纖維蛋白含量,總氮含量及蛋白質(zhì)含量均采用微量凱氏定氮法測(cè)定。

1.2.9酶解液肽分子量分布的測(cè)定采用Waters600 高效液相色譜儀(配2487紫外檢測(cè)器和Empower工作站GPC軟件)分析,標(biāo)準(zhǔn)肽樣品:CytochromeC(MW12384)、Bacitracin(MW1450)、Gly-Gly-Tyr-Arg(MW451)、Gly-Gly-Gly(MW189)。為T(mén)SKgel2000SWXL300mm×7.8mm的分離柱,柱溫:30 ℃。吸取樣品2mL于10mL容量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,用微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后供進(jìn)樣。檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm,最大壓力為2.0MPa。流動(dòng)相:乙腈/水/三氟乙酸,45/55/0.1(V/V),流速為 0.5mL/min。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,采用Spss17.0和DesignExpert7.0對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并用Origin7.0對(duì)各單因素?cái)?shù)據(jù)作圖。

2　結(jié)果與討論

2.1肌原纖維蛋白氨基酸組成分析

蛋白質(zhì)的氨基酸組成及比例在評(píng)價(jià)其酶解產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味、加工特性和生理活性等方面起著決定性作用[10,18]。從雞胸肉中提取肌原纖維蛋白的氨基酸分析結(jié)果見(jiàn)表3,從表中可知肌原纖維蛋白的氨基酸種類(lèi)齊全,組成比例均衡,必需氨基酸(色氨酸在酸水解過(guò)程中不穩(wěn)定而分解,未測(cè)定)含量占總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的40.90%,高于FAO/WHO推薦的成人理想氨基酸模式(36%),表明雞肉蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物性蛋白源。

表3　肌原纖維蛋白中的各種氨基酸含量

2.2肌原纖維蛋白水解酶的確定

分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶在各自最適條件下水解定量肌原纖維蛋白,水解結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4中可以看出,5種酶對(duì)肌原纖維蛋白的水解效果因酶切方式的不同而各有差異。從蛋白質(zhì)提取率方面來(lái)看,胃蛋白酶與堿性蛋白酶處理效果顯著(p<0.05),優(yōu)于中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶;五種蛋白酶在水解度方面差異不顯著,其原因可能是該蛋白水解產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮含量相近;而從酶解液風(fēng)味外觀(guān)來(lái)看,各蛋白酶水解肌原纖維蛋白后產(chǎn)物均出現(xiàn)味腥味現(xiàn)象,且出現(xiàn)不同程度渾濁,僅胃蛋白酶與堿性蛋白酶感觀(guān)稍佳;但由于胃蛋白酶屬于酸性蛋白酶,對(duì)蛋白質(zhì)溶解度影響較大,加之胃蛋白酶僅作用于肽鍵兩端是芳香族氨基酸的的肽鍵[19]。綜合上述因素,選定堿性蛋白酶為肌原纖維蛋白水解最佳用酶。此與周雪松報(bào)道的堿性蛋白酶最適合雞肉蛋白深度酶解相符[9]。

表4　各酶較適宜條件下水解肌原纖維蛋白的結(jié)果

注:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,下同。

2.3堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)2.2確定的堿性蛋白酶較適宜水解條件進(jìn)行酶解單因素實(shí)驗(yàn),以水解度和蛋白質(zhì)提取率為測(cè)定指標(biāo),確定各個(gè)因素較佳的酶解反應(yīng)范圍。

由圖1可知,堿性蛋白酶酶解肌原纖維蛋白的水解度與蛋白質(zhì)提取率變化趨勢(shì)相似,二者在1000～5000 U/g的加酶量范圍內(nèi)呈先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì),而水解度因酶阻遏效應(yīng)在酶量過(guò)剩時(shí)會(huì)略降低,二者均在3000 U/g時(shí)有較佳效果;酶解液的pH及酶解溫度都呈現(xiàn)出先升后降的典型趨勢(shì),且分別在pH8.0、45 ℃時(shí)較好;在優(yōu)化好的各條件下,堿性蛋白酶酶解肌原纖維蛋白的水解度和蛋白質(zhì)提取率均隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在6 h以后變化不顯著。因此,單因素實(shí)驗(yàn)所得堿性蛋白酶酶解肌原纖維蛋白的較佳工藝條件為:加酶量3000 U/g、pH 8.0、溫度45 ℃、酶解時(shí)間6 h;因酶解效率、經(jīng)濟(jì)利益等原因,最佳酶解時(shí)間確定為6 h,該因子不參與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。且因蛋白質(zhì)提取率是從蛋白質(zhì)層面考慮該蛋白水解效果,而水解度則是從肽鍵斷裂數(shù)目層面探討該蛋白的水解程度,前者受酶解產(chǎn)物中非蛋白氮影響較大,故在后續(xù)Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選擇水解度為響應(yīng)值。

圖1　不同加酶量(a)、pH(b)、酶解溫度(c)及時(shí)間(d)對(duì)肌原纖維蛋白水解度及蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1　The effects of enzyme concentration(a)、pH(b)、hydrolysis temperature(c)and time(d) on degree of hydrolysis(DH)and protein extraction rate(PER)of myofibrillar protein

2.4堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)2.3的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從中選出對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較大的加酶量、pH及溫度三個(gè)因素為響應(yīng)因子,并以水解度為響應(yīng)值,按表1進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。由Design Expert 7.0分析軟件對(duì)表5結(jié)果進(jìn)行回歸分析,所得的方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可以看出,模型的p值<0.0001,回歸模型極顯著;失擬項(xiàng)p=0.1065>0.05不顯著,說(shuō)明該模型擬合度較好,故用該模型對(duì)堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白的水解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化是合適的。根據(jù)回歸系數(shù),得出肌原纖維蛋白水解度的二次多項(xiàng)回歸方程為:DH=0.023152X1+224.506X2+7.0719X3-1.885E-003X1X2+2.245E-004X1X3+0.419X2X3-2.89025E-006X12-14.901X22-0.12421X32-1054.746?；貧w系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明,X12、X22、X32為極顯著項(xiàng),X1、X3、X1X2和X1X3項(xiàng)顯著,其他項(xiàng)均不顯著,說(shuō)明加酶量及溫度對(duì)水解度的影響較大。由方差分析結(jié)果可知,研究范圍內(nèi)的3個(gè)因素對(duì)水解度影響的主次順序?yàn)?X1>X3>X2,即加酶量>溫度>pH。

通過(guò)響應(yīng)面的數(shù)字最優(yōu)組合分析得到堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白的最佳工藝條件為:加酶量3463.4 U/g、pH7.72、溫度43.57 ℃,該條件下經(jīng)6 h酶解,水解度為32.63%。

表5　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6　回歸模型方差分析表

注:*-顯著性(0.01

2.4.1加酶量和pH之間的交互作用的分析圖2為加酶量和pH之間的交互作用,加酶量不變時(shí),隨著pH的升高,肌原纖維蛋白的水解度先上升后又下降,升高和下降的幅度都很顯著(p<0.05);當(dāng)pH處于較高或較低水平時(shí),加酶量的變化對(duì)水解度的影響不大,當(dāng)pH處于中等水平時(shí),隨著加酶量的增大,肌原纖維蛋白的水解度平穩(wěn)升高后趨于穩(wěn)定,而在酶量過(guò)于充足時(shí)水解度因酶阻遏效應(yīng)而略降低。橢圓形的等高線(xiàn)圖說(shuō)明加酶量與pH間的交互作用顯著。等高線(xiàn)沿加酶量軸向方向比pH軸向密集,說(shuō)明加酶量對(duì)肌原纖維蛋白水解程度的影響度比pH的影響大。

圖2　酶量和pH對(duì)肌原纖維蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.2　Response surface graph of enzyme concentrationand pH on the degree of myofibrillar protein hydrolysis

2.4.2加酶量和溫度之間的交互作用的分析加酶量和溫度之間的交互作用見(jiàn)圖3,由圖3可以看出,加酶量與溫度之間的交互作用顯著。溫度一定時(shí),肌原纖維蛋白的水解度隨著加酶量的增加呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì);在較適宜的酶添加量下,水解度隨溫度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)。由橢圓形等高線(xiàn)圖可知,加酶量與溫度間的交互作用顯著;且等高線(xiàn)沿加酶量軸向方向較溫度的密集,說(shuō)明加酶量對(duì)肌原纖維蛋白水解程度的影響度比溫度的影響大。

2.4.3pH和溫度之間的交互作用的分析從圖4可以看出,當(dāng)pH不變時(shí),肌原纖維蛋白的水解度隨溫度的升高而先上升后又下降,且在pH在8.0左右變化最顯著(p<0.05);當(dāng)溫度不變時(shí),隨pH7.5～8.5之間的增加,肌原纖維蛋白的水解度平穩(wěn)升高后迅速下降。pH和溫度的等高線(xiàn)圖接近圓形,說(shuō)明二者之間的交互作用不顯著;等高線(xiàn)沿溫度軸向方向比pH軸向稍密集,pH和溫度對(duì)肌原纖維蛋白水解度的影響度程度相近。

表7　酶解液不同肽分子量分布及含量

圖3　酶量和溫度對(duì)肌原纖維蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.3　Response surface graph of enzyme concentrationand temperature on the degree of myofibrillar protein hydrolysis

圖4　pH和溫度對(duì)肌原纖維蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface graph of pH and temperature on the degree of myofibrillar protein hydrolysis

2.5酶解最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證結(jié)果

為驗(yàn)證響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的可靠性,采用由Design Expert軟件及二次多項(xiàng)回歸方程得到的堿性蛋白酶水解肌原纖維蛋白最佳工藝條件(加酶量3463.4 U/g、pH7.72、溫度43.57 ℃)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證?？紤]到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際可操作性,將工藝參數(shù)中的酶量修正為3500 U/g,pH修正為7.8,水解溫度修正為44 ℃。在此條件下水解6 h,三次平行實(shí)驗(yàn)所得肌原纖維蛋白水解度為(33.1±0.7697)%,與預(yù)測(cè)值32.63%差異不顯著,說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化肌原纖維蛋白酶解工藝條件行之有效,具有實(shí)用價(jià)值。

2.6酶解液肽分子量分布分析

雞胸肉提取的肌原纖維蛋白以大分子為主,分子量13.8～200 kDa[20-21]。在響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝條件下,經(jīng)堿性蛋白酶水解6 h后,肌原纖維蛋白酶解液肽分子量分布及含量見(jiàn)表7。由表可得,酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大于3000 Da的組分僅占8.3%,而<1000 Da的小肽含量高達(dá)61.5%,說(shuō)明堿性蛋白酶較高程度的水解了肌原纖維蛋白。

然而,蛋白質(zhì)酶解是一動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程,酶解液分子量分布比例僅反映體系中宏觀(guān)整體的分子量情況,酶解液中寡肽的具體組成需進(jìn)一步分離鑒定[22-23]。QI M[24]和NAQASH S Y[25]等研究發(fā)現(xiàn)小于3 kDa的寡肽組分有較好的生物功能活性,而B(niǎo)amdad等[26]發(fā)現(xiàn)不是分子量越小肽的抗氧化能力越強(qiáng),只有肽的分子量超過(guò)一定臨界值時(shí)才表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。對(duì)酶解產(chǎn)物生物活性的分析將是本研究進(jìn)一步探討的內(nèi)容。

3　結(jié)論

雞胸肉中提取的肌原纖維蛋白濃度為59.27%,該蛋白氨基酸種類(lèi)齊全,組成比例均衡,必需氨基酸含量達(dá)40.90%,是一種優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物性蛋白源。水解酶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明肌原纖維蛋白稅額的較佳用酶是堿性蛋白酶。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,經(jīng)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化并經(jīng)修正得到肌原纖維蛋白酶法水解的最佳工藝條件為:加酶量3500 U/g、pH7.8、溫度44 ℃;此條件下經(jīng)6 h酶解,水解度為(33.1±0.7697)%,與預(yù)測(cè)值32.63%差異不顯著,說(shuō)明響應(yīng)面法能較好的用于肌原纖維蛋白酶解工藝條件的優(yōu)化,可為雞肉蛋白酶解的進(jìn)一步研究以及生物活性肽類(lèi)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。肽分子量分布分析發(fā)現(xiàn)酶解液中<1000 Da的小肽含量高達(dá)60.5%,說(shuō)明堿性蛋白酶較高程度的水解了肌原纖維蛋白。

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Optimization of enzymatic hydrolysis conditions for myofibrillar protein of chicken breast by response surface methodology

BAI Teng-hui,Ma Ya-ping,KANG Zhuang-li,PAN Run-shu,MA Han-jun*

(College of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Based on the degree of hydrolysis,enzymatic hydrolysis conditions of the myofibrillar protein extracted from chicken breast was optimized by response surface methodology in this article,the protein content and amino acid composition of the myofibrillar protein and the molecular weight distribution of the hydrolysates were also measured. Results showed that protein content of the extracted myofibrillar was 59.27%,the types and composition ratio of amino acids in this protein was every inch and balanced,the content of essential amino acid reached 40.90%. The best enzyme for hydrolyzing myofibrillar protein was alcalase. On the foundation of single factors experiment,the optimal hydrolysis conditions for myofibrillar protein hydrolyzed by alcalase was obtained as:enzyme concentration 3500 U/g,pH7.8 and temperature 44 ℃ through the Box-Behnken methodology. After hydrolysis for 6 h under the above conditions,the DH reached 33.17%. The content of peptide<1000 Da reached 61.5% by peptide molecular weight distribution,illustrated that myofibrillar proteins hydrolyzed in a high degree by alcalase.

myofibrillar protein;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;protein extraction rate;degree of hydrolysis

2015-04-07

白騰輝(1988-),男,碩士,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程,E-mail:th2012ky@163.com。

馬漢軍(1965-),男,博士,教授,主要從事農(nóng)產(chǎn)品深加工研究,E-mail:xxhjma@126.com。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201303083);河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助(13IRTSTHN006)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000