靈芝菌絲體破碎處理方法的比較

秦可欣,石彥國(guó),孫冰沁,陳　浩,何國(guó)慶,*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076;2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

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靈芝菌絲體破碎處理方法的比較

秦可欣1,石彥國(guó)1,孫冰沁2,陳浩2,何國(guó)慶2,*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076;2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

靈芝是一種珍貴的藥用真菌,含有多種生物活性物質(zhì),如靈芝多糖、三萜類(lèi)化合物,同時(shí)具有較高的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性。為了提高靈芝菌絲體中β-葡萄糖苷酶的利用效率,需要對(duì)菌絲進(jìn)行破碎處理而使酶釋放出來(lái)。本文研究了通過(guò)打漿處理、升溫自溶、反復(fù)凍融和超聲破碎的方式來(lái)提取靈芝菌絲體中的β-葡萄糖苷酶,并比較了不同方法的提取效果。結(jié)果表明,以勻漿和超聲破碎結(jié)合的組合方法最佳,先在冰浴中勻漿處理1 min,在200 W下再以每超聲1 min間歇1 min的方式超聲破碎5次,β-葡萄糖苷酶的總活力可以達(dá)到3.116 U/mL,比直接提取提高了112.26%。顯微鏡觀察到勻漿后菌絲球可全部分散開(kāi),同時(shí)菌絲被不同程度的切斷,再經(jīng)超聲破碎處理,菌絲幾乎全部破碎。

靈芝菌絲體,β-葡萄糖苷酶,提取,勻漿,超聲破碎

靈芝(Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst)是一種珍貴的藥用真菌,含有多種生物活性物質(zhì),如靈芝多糖、靈芝三萜以及各種酶類(lèi),具有多種生理功能和寶貴的藥用價(jià)值[1-2]。液體培養(yǎng)的菌絲體可以發(fā)揮與子實(shí)體相同的生物活性,通過(guò)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)可加速菌絲生成,縮短生長(zhǎng)周期[3]。研究表明靈芝、香菇等擔(dān)子菌具有較好的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性[4]。大豆異黃酮(Soybeanisoflavone)是大豆中多酚化合物的總稱(chēng),分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩類(lèi),具有與雌激素相同的生物活性[5]。其中苷元占總量的2%～3%,結(jié)合型糖苷占總量的97%～98%。研究發(fā)現(xiàn),糖苷形式的大豆異黃酮在體內(nèi)不能直接被小腸壁吸收,必須將其轉(zhuǎn)化為游離型的苷元才能被吸收,因而發(fā)揮生物活性的是游離型的苷元。β-葡萄糖苷酶是一種纖維素酶類(lèi),其特性是可水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵,同時(shí)釋放出β-葡萄糖和相應(yīng)的配基,因此可用于大豆異黃酮糖苷的生物轉(zhuǎn)化[6]。利用含有β-葡萄糖苷酶的菌絲體進(jìn)行異黃酮的生物轉(zhuǎn)化,形成黃酮苷元,大幅提高異黃酮的生物活性及其生物利用度,是開(kāi)發(fā)多因子保健功能食品的新途徑。目前在日本、美國(guó)等國(guó)家已有研究者利用靈芝、灰樹(shù)花等食用菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷,并與食用菌多糖相結(jié)合制成了一種有效的抗腫瘤藥物,在日本和美國(guó)被廣泛的用于腫瘤的預(yù)防和治療,取得了很好的療效[7]。浙江大學(xué)的崔美林博士對(duì)靈芝發(fā)酵轉(zhuǎn)化大豆異黃酮的條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終大豆苷和燃料木苷的轉(zhuǎn)化率均可達(dá)到98%以上,經(jīng)過(guò)體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)可以看出轉(zhuǎn)化后產(chǎn)品具有較好的體外抗氧化作用[8]。

為了提高靈芝菌絲體中β-葡萄糖苷酶的利用效率,需要對(duì)靈芝菌絲體進(jìn)行破壁處理,使酶釋放出來(lái),提高其酶活力。目前的研究中一般只是通過(guò)離心直接提取粗酶液或?qū)z體簡(jiǎn)單的勻漿處理[9]。細(xì)胞破碎的方式有很多,例如高壓勻漿、研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎、滲透壓沖擊、酶溶、化學(xué)滲透等[10-12],實(shí)際操作過(guò)程要根據(jù)所需胞內(nèi)物質(zhì)的性質(zhì)而選擇相適應(yīng)的破碎方法。本實(shí)驗(yàn)采用勻漿處理、升溫自溶、反復(fù)凍融和超聲破碎的方式來(lái)對(duì)菌絲進(jìn)行破壁處理,并通過(guò)多種方法組合處理的方式來(lái)增加β-葡萄糖苷酶的釋放。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

赤芝(G.lucidum·karst)河南省科學(xué)院食用菌工程技術(shù)中心;磷酸二氫鉀,無(wú)水硫酸鎂,維生素B1,瓊脂,檸檬酸,十二水磷酸氫二鈉,碳酸鈉,乳酸,分析純國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;對(duì)硝基苯酚(pNP)、對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)阿拉丁試劑(上海)有限公司;斜面培養(yǎng)基:PDA 4.5%、瓊脂 1.7%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、VB10.005%;種子培養(yǎng)基:PDB 3.5%、蛋白胨 0.5%、酵母浸粉 0.3%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、VB10.005%、pH6.0;發(fā)酵培養(yǎng)基:麥芽汁(20o)30%、豆粕粉 6%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、VB10.005%、pH6.0。

MULTISKAN GO新一代全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Thermo,USA;JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;ZKU-L362-40 ℃超低溫冷凍貯存箱中科生命科技股份有限公司;MDF-U53V-80 ℃超低溫冰箱Sanyo,Jpan;V-5000多可必食品加工器青島埠元電子有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種培養(yǎng)方法斜面菌種活化:將靈芝菌種接種至斜面培養(yǎng)基上,放置28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(6～8 d)至斜面長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲為止。

種子制備:250 mL三角瓶中裝100 mL液體種子培養(yǎng)基,用接種鏟刮取法接入經(jīng)活化的斜面靈芝兩試管,置28 ℃搖床中,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,培養(yǎng)7 d,供實(shí)驗(yàn)作種子用。

菌種發(fā)酵:250 mL三角瓶中裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,接種量為10%,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,培養(yǎng)溫度28 ℃,培養(yǎng)時(shí)間8 d。

1.2.2菌絲體分離將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾,分離菌絲體和發(fā)酵液;其中,發(fā)酵液用比色法測(cè)定胞外β-葡萄糖苷酶酶活,菌絲體經(jīng)無(wú)菌水多次洗滌后,進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的提取。

1.2.3菌絲體破碎處理方法

1.2.3.1勻漿處理向菌絲體中加入蒸餾水,在冰水浴中用“多可必”食品加工器以轉(zhuǎn)速22000 r/min進(jìn)行勻漿處理,為了防止持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間處理導(dǎo)致液體升溫較高而引起酶活的損失,此方法采用每勻漿1 min間歇1 min的方式,勻漿次數(shù)設(shè)置為1、3、5、7次,得到粗酶液。

1.2.3.2升溫自溶及與勻漿組合處理升溫自溶:該方法不進(jìn)行菌絲體與發(fā)酵液的分離,當(dāng)菌種發(fā)酵結(jié)束時(shí),將培養(yǎng)溫度分別調(diào)到28、34、40、46 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 d,發(fā)酵上清液即為粗酶液。

升溫自溶+勻漿處理:上述升溫自溶發(fā)酵結(jié)束樣品,將菌絲和發(fā)酵液分離,發(fā)酵液直接測(cè)定胞外酶活,菌絲體用水稀釋后,在冰水浴中用“多可必”食品加工器以轉(zhuǎn)速22000 r/min勻漿處理5次。

1.2.3.3反復(fù)凍融及與勻漿組合處理反復(fù)凍融:向菌絲體中加入蒸餾水,分別置于-20、-40、-80 ℃下冷凍8 h,然后常溫解凍1 h,反復(fù)三次,得粗酶液。

勻漿處理+反復(fù)凍融:向菌絲體中加入蒸餾水,在冰水浴中以轉(zhuǎn)速22000 r/min進(jìn)行勻漿處理1 min,再放置-20、-40和-80 ℃反復(fù)凍融三次處理。

1.2.3.4超聲破碎及與勻漿組合處理超聲破碎:向菌絲體中加入蒸餾水,在冰水浴中進(jìn)行超聲破碎,超聲功率200 W,為了防止持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間超聲導(dǎo)致液體升溫較高而引起酶活的損失,采用每勻漿1 min間歇1 min的方式破碎,超聲次數(shù)為1、5、10、15、20次,得粗酶液。

勻漿處理+超聲破碎:向菌絲體中加入蒸餾水,在冰水浴中以轉(zhuǎn)速22000 r/min進(jìn)行勻漿處理1 min,再進(jìn)行超聲破碎處理,超聲次數(shù)分別設(shè)置為1、5、8、10次,得粗酶液。

1.2.4酶活測(cè)定方法本實(shí)驗(yàn)采用比色法,以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物進(jìn)行酶解,底物水解后釋放出來(lái)的對(duì)硝基苯酚在400～420 nm可見(jiàn)光范圍內(nèi)有特征吸收峰,可直接在400～420 nm之間比色測(cè)定[13]。

酶活定義:β-葡萄糖苷酶酶活力單位(U)定義為,在pH5.0、50 ℃反應(yīng)條件下,一分鐘時(shí)間內(nèi)底物被水解釋放出1 μmol的pNP所需要的酶量。

表1　勻漿處理對(duì)酶活的影響Table 1　The effect of homogenate on enzyme activity

注:同一行,上標(biāo)字母不同表示在p<0.05水平時(shí)差異顯著。

2　結(jié)果與討論

2.1勻漿處理對(duì)β-葡萄糖苷酶提取的影響

表1列出了菌絲體經(jīng)勻漿處理后β-葡萄糖苷酶總活力的變化情況。由表1可以看出,勻漿處理可以有效提取菌絲中的β-葡萄糖苷酶,隨著勻漿次數(shù)的增多,酶活不斷增加,當(dāng)勻漿次數(shù)增加到5次時(shí)提取效果達(dá)到最佳,比直接提取增加了57.36%。

2.2升溫自溶與勻漿組合處理對(duì)β-葡萄糖苷酶提取的影響

在靈芝發(fā)酵過(guò)程中,適當(dāng)?shù)纳甙l(fā)酵溫度會(huì)使靈芝菌絲體發(fā)生自溶,導(dǎo)致胞內(nèi)的某些產(chǎn)物釋放。圖1為采用升溫的方式來(lái)促進(jìn)胞內(nèi)酶的釋放以及升溫后結(jié)合勻漿處理的提取結(jié)果對(duì)比。結(jié)果顯示,單一靠升溫來(lái)增加菌絲中β-葡萄糖苷酶的釋放效果并不理想,當(dāng)溫度升為34 ℃發(fā)酵時(shí),酶活僅比初始的1.468 U/mL增加了6.40%,溫度控制在40 ℃以上時(shí),酶活會(huì)明顯的降低;發(fā)酵過(guò)程中溫度升高的越多,生物量減少越明顯,溫度升高到46 ℃時(shí)生物量由28 ℃時(shí)的20.18 g/L降低到10.02 g/L,減少了50.35%。說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程升高溫度,菌體會(huì)發(fā)生自溶,但胞內(nèi)酶的釋放并不顯著,較高的溫度不利于菌絲的生成,因此酶的形成也受到很大的阻礙。當(dāng)升溫發(fā)酵后與勻漿處理組合處理則表現(xiàn)出較顯著的效果,靈芝在28 ℃發(fā)酵結(jié)束后將溫度升至34 ℃再繼續(xù)發(fā)酵2 d,結(jié)合勻漿處理酶活可達(dá)2.427 U/mL,比直接提取提高了65.33%,比上述單一勻漿處理的方法提高了5.06%。

圖1　升溫自溶及與勻漿組合處理結(jié)果對(duì)比Fig.1　Comparison of heating autolysis extraction and the combination with homogenate processing

2.3反復(fù)凍融與勻漿組合處理對(duì)β-葡萄糖苷酶提取的影響

采用反復(fù)凍融以及與勻漿組合處理的提取結(jié)果如圖2所示,反復(fù)凍融可以有效提取菌絲體中β-葡萄糖苷酶,且勻漿和反復(fù)凍融組合處理的提取效果更加顯著。當(dāng)冷凍溫度選擇在-40 ℃時(shí)對(duì)酶的提取最有效,與勻漿組合提取后酶活可達(dá)3.003 U/mL,比直接提取提高了104.56%。

圖2　反復(fù)凍融及與勻漿組合處理結(jié)果對(duì)比Fig.2　Comparison of repeated freezing-thawing and the combination with homogenate processing

2.4超聲破碎與勻漿組合處理對(duì)β-葡萄糖苷酶提取的影響

超聲破碎處理較其他幾種方法都表現(xiàn)出更好的效果,當(dāng)超聲次數(shù)增加到10次時(shí),酶活達(dá)到最高為3.094 U/mL,比直接提取提高了110.76%,超聲次數(shù)繼續(xù)增加,由于酶的敏感性,會(huì)有更多的酶活損失。對(duì)菌絲先勻漿處理1 min再進(jìn)行超聲破碎,與單獨(dú)進(jìn)行超聲破碎處理的結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)勻漿處理與超聲破碎組合處理時(shí),酶活明顯高于單獨(dú)進(jìn)行超聲破碎處理,且當(dāng)勻漿與超聲組合時(shí),僅需超聲5次就具有顯著的效果,雖然與單獨(dú)超聲10次的酶活無(wú)顯著差異,但節(jié)省了一半的處理時(shí)間。

由此得出靈芝菌絲體中β-葡萄糖苷酶的最佳提取方法是勻漿處理與超聲破碎的組合,即先對(duì)菌絲以22000 r/min勻漿處理1 min,再進(jìn)行超聲破碎,超聲功率200 W,每超聲1 min間歇1 min,超聲次數(shù)為5次,此時(shí)可得β-葡萄糖苷酶的總活力為3.116 U/mL,比直接提取提高了112.26%。

圖3　超聲破碎及與勻漿組合處理結(jié)果對(duì)比Fig.3　Comparison of ultrasonic crushing and the combination with homogenate processing

2.5不同方式處理后菌絲形態(tài)變化

對(duì)不同方式處理后菌絲的形態(tài)進(jìn)行觀察、比較,可以看出菌絲最初是成團(tuán)分布的,大大小小的菌絲互相纏繞形成或大或小的菌絲球,如圖4-a。勻漿處理可使菌絲團(tuán)均勻分散并斷裂;升溫自溶實(shí)驗(yàn)菌絲的狀態(tài)與處理前并無(wú)明顯的區(qū)別,只是通過(guò)生物量的測(cè)定可以判斷菌絲明顯減少;經(jīng)凍融處理后,肉眼所見(jiàn)菌絲狀態(tài)已完全改變,呈蜂窩狀,冷凍過(guò)程中由于水分由液態(tài)迅速變?yōu)楸问蕉咕w破裂,因此有利于酶的釋放;超聲處理可以更進(jìn)一步破碎菌絲。

圖4中b、c為菌絲在勻漿和超聲破碎組合提取后通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡觀察到的形態(tài)。我們可以看到,勻漿處理可以將菌絲球全部打散,并將菌絲切割成段,而使菌絲分散開(kāi)來(lái),但菌絲并沒(méi)有完全的破碎。因此本實(shí)驗(yàn)選擇先通過(guò)簡(jiǎn)單的勻漿處理,分散并切割菌絲,再進(jìn)行超聲破碎,使菌絲斷裂的更徹底,更進(jìn)一步的破碎菌絲,提高酶的提取效果。不過(guò)考慮酶活的損失問(wèn)題,不能無(wú)限量的增加超聲破碎時(shí)間,因此依然還會(huì)有極少量的菌絲不能被徹底破碎掉。

圖4　采用勻漿和超聲破碎組合處理時(shí)菌絲的顯微形態(tài)變化Fig.4　Microscopic morphological changes of mycelium in the combination of homogenate and ultrasonic crushing

3　結(jié)論

通過(guò)以上幾種靈芝菌絲體破碎處理方法來(lái)提取β-葡萄糖苷酶的對(duì)比,得到最佳處理方法是先對(duì)菌絲勻漿1 min,然后進(jìn)行超聲破碎,超聲功率200 W,以每超聲1 min間歇1 min的方式超聲5次,此時(shí)可得β-葡萄糖苷酶的總活力為3.116 U/mL。這種方法操作簡(jiǎn)單,酶活損失少。通過(guò)顯微形態(tài)觀察可知先對(duì)菌絲打漿處理,可將菌球打散、菌絲打斷,再進(jìn)行超聲破碎,進(jìn)一步的破碎菌絲,提高酶的釋放。通過(guò)這種方法來(lái)提高酶的提取效率,不僅有助于食品工業(yè)上β-葡萄糖苷酶的分離純化,提高其產(chǎn)量,更為靈芝發(fā)酵轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷開(kāi)發(fā)多因子保健食品提供了有利基礎(chǔ)。由于酶的不穩(wěn)定性,我們無(wú)法通過(guò)不斷的增加超聲時(shí)間和次數(shù)來(lái)達(dá)到所有菌絲完全徹底破碎的效果,因此,在以后的研究中有必要探尋出一種破碎效果更好,對(duì)酶活影響極小,而對(duì)酶的提取更加有效的方法。

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Comparison crushing methods ofGanodermalucidumMycelium

QIN Ke-xin1,SHI Yan-guo1,SUN Bing-qin2,CHEN Hao2,HE Guo-qing2,*

(1.Food Science and Engineering College,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;2.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Ganodermalucidumis a precious medicinal fungi,which contains a variety of biological active substances,such asganodermalucidumpolysaccharide,triterpene compounds and has highβ-glucosidase activity.In order to improve the utilization efficiency of theβ-glucosidase,it is necessary to break theganodermalucidummycelium and release the enzyme to the full extent.Therefore,four methods of homogenate processing,heating autolysis extraction,repeated freezing-thawing,and ultrasonic crushing were used to extract theβ-glucosidase from theganodermalucidummycelia,and the extraction effect of different methods was compared.The results exhibited the best extraction method forβ-glucosidase extraction was the combination of homogenate processing and ultrasonic crushing.The mycelia form the fermented liquids needed to be treated by homogenate processing for 1 min in the ice bath,and then be treated 1 min intermittent 1 min for 5 times by ultrasonic crushing in 200 W.In this case,the total enzyme activity of theβ-glucosidase reached 3.116 U/mL,which increased by 112.26% than that of non-broken treatment.Through microscope it can be observed that the mycelium ball was dispersed completely,the hyphae were cut off in varying degrees by homogenate and almost all were broken by ultrasonication.

Ganodermalucidummycelia;β-glucosidase;extraction;homogenate;ultrasonic crushing

2015-10-16

秦可欣(1988-)，女，碩士，研究方向：大豆加工技術(shù),E-mail:460040223@qq.com。

何國(guó)慶(1957-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)及發(fā)酵工程，E-mail:gqhe@zju.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271816)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0146-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.020