不同劑量分割模式照射Eca109細(xì)胞死亡方式與毒性的初步研究

蔡紅偉，譚榜憲，李賢富，周進(jìn)偉,蒲宇，馬代遠(yuǎn)

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科；2.醫(yī)學(xué)影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充　637000)

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不同劑量分割模式照射Eca109細(xì)胞死亡方式與毒性的初步研究

蔡紅偉1，譚榜憲1，李賢富1，周進(jìn)偉1,蒲宇2，馬代遠(yuǎn)1

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科；2.醫(yī)學(xué)影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充637000)

目的：通過(guò)模擬不同劑量分割方式照射食管癌細(xì)胞Eca109觀察比較各組別細(xì)胞死亡方式及細(xì)胞毒效應(yīng)的差異，嘗試為臨床食管癌非常規(guī)分割放療提供潛在的理論依據(jù)。方法：設(shè)計(jì)具有相同BED的4種劑量分割模式：超分割組(1)、常規(guī)分割組(2)、大分割組(3)、大分割組(7)，照射處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞后，進(jìn)行Hoechst 33258 免疫熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞存活曲線。結(jié)果：Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：超分割組(1)受照射細(xì)胞中54.9%呈“凋亡樣壞死”狀態(tài)；常規(guī)分割組(2)50.5%的細(xì)胞呈“脹亡樣壞死”狀態(tài)，而30.3%的細(xì)胞呈凋亡樣壞死狀態(tài)；大分割組(3)受照射細(xì)胞中72.1%呈脹亡樣壞死狀態(tài)，19.2%呈凋亡樣壞死狀態(tài)；大分割組(7)受照射細(xì)胞中53.6%呈脹亡樣壞死狀態(tài)，7.1%呈凋亡樣壞死狀態(tài)。CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值(OD值)，繪制存活曲線，常規(guī)分割組(2)、大分割組(3)與大分割組(7)在模擬照射結(jié)束后第1、4、7、10天進(jìn)行比較，吸光度值均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。超分割組(1)在第1、4、10天吸光度值均顯著低于其他模擬照射組(P<0.05)。在第7天時(shí)，各模擬照射組吸光度值均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論：超分割照射Eca109細(xì)胞大部表現(xiàn)為凋亡樣壞死，大分割照射大部分表現(xiàn)為脹亡樣壞死。在食管癌的治療中，超分割放療較其他劑量分割模式有更好的腫瘤控制率可能與這種死亡方式的差異有關(guān)。

劑量分割；Eca109；死亡方式；細(xì)胞存活曲線。

【Abstract】Objective：In hope to provide some theoretical basis for unconventional radiotherapy,we observe and compare cells’ toxicity and death way between groups by simulating different dose fractionation on esophageal cancer cells Eca109.Methods：Design the dose fractionation mode with the same BED:the hyperfractionated group (1),the conventional fractionation (2),the hypofractionated group (3),the hypofractionated group (7).After irradiation in Eca109 cells in the exponential growth phase,the cell morphology was observed by Hoechst 33258 immunofluorescence staining,draw the cell survival curve by CCK-8 experiment.Results：Morphological changes of each group’s cell were observed in Hoechst 33258 staining.The hyperfractionated group (1)54.9% of the irradiated cells were in the state of “apoptoticnecrosis”.The conventional fractionation group(2)50.5% of the irradiated cells were in the state of “oncosticnecrosis”;30.3% of the irradiated cells were in the state of “apoptoticnecrosis”.The hypofractionated group (3)72.1% of the irradiated cells were in the state of “oncosisnecrosis”,19.2% were in the state of “apoptoticnecrosis”.The hypofractionated group (7)53.6% of the irradiated cells were in the state of “oncosisnecrosis”,7.1% were in the state of “apoptoticnecrosis”.Absorbance values (OD)of cells in each group were detected with CCK-8,and the survival curve was drawn.By comparing between conventional fractionation group (2),hypofractionated group (3)and hypofractionated group (7)on the 1th,4th,7th,10th days after the simulation irradiation,the absorbance values of cells were not significantly different (P>0.05).On the 1th,4th,10th day,the hyperfractionated Group (1)’s absorbance values were significantly lower than the other groups of simulation irradiation (P<0.05).At 7th day,there was no significant difference in the absorbance values between the simulated groups (P>0.05).Conclusion：The hyperfractionated irradiation induced most of Eca109 cells to perform apoptoticnecrosis,but the hypofractionated irradiation induced most of them to perform oncosticnecrosis.In the treatment of esophageal cancer,the hyperfractionated radiotherapy is a better tumor control rate than the other dose fractionation models,which may be related to the difference in the way of death.

【Key words】Dose fractionation;Eca109;Death pattern;Cell survival curves

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，占惡性腫瘤死亡率第四位[1]。放射治療作為食管癌治療的三大手段之一，遺憾的是幾十年來(lái)常規(guī)的劑量分割模式(1.8～2.0 Gy/Fx，5 Fx/w)治療療效沒(méi)有得到明顯提高。近年來(lái)隨著以三維適形和調(diào)強(qiáng)放療為代表的新技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床，在不增加正常組織損傷的前提下進(jìn)行食管癌的非常規(guī)劑量分割放療成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。然而目前存在的問(wèn)題是針對(duì)食管癌放療劑量分割的研究，臨床課題多，基礎(chǔ)研究少，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬不同劑量分割方式照射Eca109細(xì)胞，觀察細(xì)胞的死亡方式及射線的細(xì)胞毒效應(yīng)，并分析兩者的關(guān)系，嘗試為臨床選擇非常規(guī)分割放療治療食管癌提供潛在的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞系與主要試劑

人食管癌Eca109細(xì)胞株購(gòu)于上海凱基生物。在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)傳代，當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Hoechst33258染色試劑盒和CCK-8溶液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2模擬照射各組具體方案設(shè)計(jì)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞進(jìn)行模擬不同劑量分割方式照射，模擬照射分為超分割組、常規(guī)照射組、大分割組，大分割組又分兩個(gè)亞組。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(未照射組)。設(shè)計(jì)原則：各照射組之間等效生物劑量基本相同。根據(jù)等效生物劑量的換算公式：EQD2= n1d1[(d1+α/β)∕(2+α/β)],α/β值取腫瘤細(xì)胞常用值10 Gy。EQD2:超分割組(1)=10.175 Gy ；常規(guī)分割組(2)=10.000 Gy；大分割組(3)=9.750 Gy；大分割組(7)= 9.917 Gy。其中超分割組照射時(shí)兩次時(shí)間間隔不小于6 h[2]。具體照射方案設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。

表1　模擬不同劑量分割照射設(shè)計(jì)方案(Gy)

1.3醫(yī)科達(dá)Precise直線加速器

醫(yī)科達(dá)Precise直線加速器由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科提供，在模擬照射過(guò)程中其具體參數(shù)設(shè)置如下：射線能量：6 MV X-ray；機(jī)架角：180°；機(jī)頭角：0°；照射野大?。?0 cm×10 cm；照射源距腫瘤細(xì)胞(培養(yǎng)瓶底壁)距離：100 cm；設(shè)定劑量率：600 MU/min (實(shí)際劑量率：500 MU/min)；劑量建成：培養(yǎng)瓶下墊1 cm厚硅膠。如圖1。

1.4Hoechst 33258 免疫熒光染色

模擬照射結(jié)束后1 d各組進(jìn)行細(xì)胞爬片，次日待每組細(xì)胞80%～90%已貼壁生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行細(xì)胞固定，染色，然后加抗熒光猝滅液封片。在正置熒光顯微鏡下選用340 nm激發(fā)光觀察細(xì)胞，并計(jì)數(shù)及攝像。

1.5CCK-8繪制存活曲線

模擬照射結(jié)束后，分別在第1、4、7、10天將各組培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞用彎頭吸管反復(fù)吹打，使其脫壁，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞濃度。各組取適量細(xì)胞懸液調(diào)配成相同濃度鋪96孔板過(guò)夜培養(yǎng)。次日細(xì)胞貼壁后分別向每個(gè)孔內(nèi)加入適量CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在第1、2、3、4 h將96孔板取出，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度值(OD值)，求其平均值。將第1、4、7、10天的吸光度值連接成線，繪制各組細(xì)胞的吸光度值曲線，即為細(xì)胞存活曲線。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1Hoechst 33258免疫熒光染色

空白對(duì)照(0)處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞未受到6MV-X線照射，97.7%的細(xì)胞形態(tài)呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)被染成淡藍(lán)色，細(xì)胞膜完整。超分割組(1)受照射細(xì)胞中54.9%的細(xì)胞核固縮，濃染，高亮呈白色，包膜皺縮，呈“凋亡樣壞死”狀態(tài)。常規(guī)分割組(2)受照后細(xì)胞大小參差不齊，50.5%的細(xì)胞形態(tài)變大，胞內(nèi)可見(jiàn)數(shù)量不等的核碎片，呈“脹亡樣壞死”狀態(tài)；而30.3%的細(xì)胞呈凋亡樣壞死狀態(tài)。大分割組(3)受照射細(xì)胞中72.1%呈脹亡樣壞死狀態(tài)，19.2%呈凋亡樣壞死狀態(tài)。大分割組(7)受照射細(xì)胞中53.6%呈脹亡樣壞死狀態(tài)，7.1%呈凋亡樣壞死狀態(tài)。各組細(xì)胞狀態(tài)百分比及熒光圖分別見(jiàn)表2和圖2。

2.2CCK-8繪制存活曲線

常規(guī)分割組(2)、大分割組(3)與大分割組(7)在模擬照射結(jié)束后第1、4、7、10天進(jìn)行比較，吸光度值均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。超分割組(1)在第1、4、10天吸光度值均顯著低于其他模擬照射組(P<0.05)。在第7天時(shí)，各模擬照射組吸光度值均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表3及圖3。

表2　細(xì)胞狀態(tài)百分比(%)

組別第1天第4天第7天第10天空白對(duì)照(0)3.02±0.062.66±0.032.13±0.041.78±0.04超分割組(1)0.71±0.03*0.63±0.01*0.36±0.030.31±0.03*常規(guī)分割組(2)2.45±0.011.43±0.060.46±0.030.95±0.02大分割組(3)2.03±0.041.63±0.070.54±0.020.96±0.02大分割組(7)2.70±0.051.30±0.050.53±0.021.01±0.05

*P<0.05，與常規(guī)分割組(2)、大分割組(3)和大分割組(7)比較。

3　討論

射線引起細(xì)胞死亡的方式主要有凋亡和壞死，近年來(lái)也有研究者提出其他的死亡形式：如老化、脹亡、有絲分裂災(zāi)難等。到目前為止,各種細(xì)胞死亡方式的機(jī)理還沒(méi)有徹底弄清楚,特別是細(xì)胞內(nèi)一些分子對(duì)細(xì)胞死亡的作用機(jī)制,細(xì)胞死亡途徑還有爭(zhēng)論。近年來(lái)對(duì)于細(xì)胞的壞死到底屬于最終結(jié)果,還是屬于一種細(xì)胞死亡方式,也引起廣泛的關(guān)注討論。有研究表明細(xì)胞壞死通常也發(fā)生在細(xì)胞凋亡之后，故認(rèn)為細(xì)胞的壞死是細(xì)胞生命的終結(jié)[3]。但此觀點(diǎn)未得到廣泛的認(rèn)可。

另一種觀點(diǎn)認(rèn)為各種細(xì)胞死亡方式機(jī)理之間存在著交叉,同時(shí)還可以互相發(fā)生轉(zhuǎn)變[4-6]。同一種細(xì)胞因不同的環(huán)境刺激可有不同的死亡方式；不同種類(lèi)細(xì)胞受同一環(huán)境刺激死亡方式也可能不同；甚至同一環(huán)境下,同種類(lèi)細(xì)胞,外界作用因子的強(qiáng)度時(shí)間不同,可造成不同的死亡方式；同一環(huán)境,同種類(lèi)細(xì)胞可表現(xiàn)兩種或兩種以上的細(xì)胞死亡方式[7-9]。脹亡是1995年由Majno和Joris首先提出的,以細(xì)胞腫脹和核溶解為主要特征。脹亡細(xì)胞鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹,體積增大；胞漿空泡化,胞漿內(nèi)出現(xiàn)致密顆粒；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹；線粒體早期出現(xiàn)致密化,后期腫脹,崩解或出現(xiàn)高致密顆粒,嵴破壞、消失；高爾基復(fù)合體亦腫脹或形成較多小氣球樣囊體；細(xì)胞腫脹波及核,核內(nèi)染色質(zhì)分散,凝集在核膜、核仁周?chē)?有時(shí)聚集成團(tuán)塊。與凋亡通常出現(xiàn)核碎裂不同的是脹亡細(xì)胞后期往往表現(xiàn)為核溶解、細(xì)胞內(nèi)容物外溢,并引起周?chē)装Y反應(yīng)。有研究認(rèn)為脹亡多為缺血、缺氧、熱休克及毒物刺激等引起的一種被動(dòng)的細(xì)胞死亡方式,類(lèi)似細(xì)胞濁腫、水變性、氣化,繼而發(fā)展為溶解壞死(lyticnecrosis)的形態(tài)學(xué)改變[10-13]。故1997年美國(guó)毒理病理學(xué)家學(xué)會(huì)細(xì)胞死亡命名委員會(huì)建議,在應(yīng)用中將壞死名稱(chēng)作為一種診斷,壞死前細(xì)胞如表現(xiàn)凋亡特征則稱(chēng)之為凋亡樣壞死;若出現(xiàn)的是脹亡特點(diǎn),則稱(chēng)為脹亡樣壞死[4]。

實(shí)驗(yàn)?zāi)M不同劑量分割方式照射后采用Hoechst 33258 染色進(jìn)行免疫熒光觀察，發(fā)現(xiàn)等效總劑量為10 Gy左右的情況下，不同劑量分割方式照射后，細(xì)胞死亡方式截然不同，并且存在死亡方式交叉的現(xiàn)象。由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，該實(shí)驗(yàn)中只能根據(jù)細(xì)胞膜，細(xì)胞核形態(tài)及大小來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞，凋亡樣壞死細(xì)胞和腫脹樣壞死細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)超分割組(1)以凋亡樣壞死細(xì)胞為主，常規(guī)分割組(2)、大分割組(3)和大分割組(7)均以脹亡樣壞死細(xì)胞為主，并且以大分割組(3)脹亡樣細(xì)胞所占的比例最大。這與國(guó)內(nèi)高榮蓮等[14]研究結(jié)果類(lèi)似。他們通過(guò)大劑量的δ射線1次性照射大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)4～32 Gy，觀察細(xì)胞的死亡方式，發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的加大,發(fā)生死亡的細(xì)胞數(shù)有所增加,發(fā)生凋亡的PC12細(xì)胞數(shù)目幾乎可以忽略不計(jì)；照射后的PC12細(xì)胞主要是在腫脹的基礎(chǔ)上發(fā)生死亡的，即PC12細(xì)胞死亡前表現(xiàn)為脹亡樣壞死狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)中超分割組細(xì)胞和其他3組的死亡方式截然相反——凋亡樣壞死為主。高榮蓮等[14]的研究顯示，與單次照射劑量相關(guān)。那么本實(shí)驗(yàn)中大分割組(7)脹亡樣壞死細(xì)胞的比例低于大分割(3)組又如何解釋?zhuān)覀兎治隹赡芘c照射次數(shù)及照射后熒光染色間隔時(shí)間有關(guān)。大分割組(3)3 Gy/次，第1、3、5天照了3次，從第1天照射開(kāi)始到結(jié)束后1 d做熒光染色間隔6 d；而大分割組(7)僅7 Gy/次在第5天照射1次結(jié)束，次日即行熒光染色，雖然單次照射劑量大，但是間隔時(shí)間短，這可能是影響該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的1個(gè)原因。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果我們也可以大膽的推測(cè)：2 Gy/Fx的照射劑量可能就是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡樣壞死與脹亡樣壞死的分水嶺，2 Gy/Fx誘導(dǎo)以凋亡樣壞死的方式結(jié)束生命，大于2 Gy/Fx則誘導(dǎo)脹亡樣壞死。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：超分割照射誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞大部分表現(xiàn)凋亡樣壞死的死亡形式，而大分割照射則誘導(dǎo)其大部分表現(xiàn)脹亡樣壞死。結(jié)合CCK-8的結(jié)果提示可能正是這種表現(xiàn)差別決定了超分割放療較其他劑量分割模式在食管癌的治療中有更好的腫瘤控制率，這就為30多年來(lái)國(guó)內(nèi)外進(jìn)行的食管癌的超分割臨床研究提供了基礎(chǔ)理論支持。然而，模擬不同劑量分割方式照射其他病種的細(xì)胞是否也出現(xiàn)這樣的結(jié)果，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究是否也是同樣的結(jié)果，需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)探索。

實(shí)驗(yàn)中超分割組(1)在10 d內(nèi)的OD值曲線明顯低于其他3個(gè)模擬照射組，提示超分割組(1)照射后活細(xì)胞的數(shù)量明顯少于其他3組，并且從曲線圖上分析其在第10天時(shí)并未像其他3組那樣OD值“反彈”，可能意味著超分割照射對(duì)細(xì)胞毒性作用存在著優(yōu)勢(shì)。常規(guī)分割組(2)、大分割組(3)及大分割組(7)在第7天時(shí)OD值直至最低點(diǎn)，和超分割組(1)的OD值無(wú)明顯差異，可能正體現(xiàn)了等效總劑量前提下，不同劑量分割方式照射后，Eca109細(xì)胞在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)上相同的生物學(xué)效應(yīng)。然而3組細(xì)胞在第10天OD上升，存活細(xì)胞增多，考慮與射線損傷后腫瘤細(xì)胞加速再增殖有關(guān)，從而也印證了超分割放療在控制腫瘤細(xì)胞射線損傷后加速再增殖方面存在的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，超分割照射誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞大部表現(xiàn)以凋亡樣壞死的死亡形式，而大分割照射則誘導(dǎo)其大部分表現(xiàn)脹亡樣壞死。CCK-8的結(jié)果提示可能正是這種選擇決定了超分割放療較其他劑量分割模式在食管癌的治療中有更好的腫瘤控制率。

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(學(xué)術(shù)編輯：杜小波)

Preliminary study of the Eca109 cells’ toxicity and death pattern under different dose fractionation mode irradiation

CAI Hong-wei1，TAN Bang-xian1，LI Xian-fu1，ZHOU Jin-wei1，PU Yu2，MA Dai-yuan1

(1.Department of Oncology,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College；2.Sichuan Key Laboratory of Medical Imaging ,Nanchong 637000，Sichuan，China)

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.08論著

中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金(2010-2012年)；四川省教育廳重點(diǎn)課題(11ZA191)；南充市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(11A0149)

2015-06-15

蔡紅偉(1982-)，男，碩士，住院醫(yī)師。E-mail：chw69940@126.com

馬代遠(yuǎn)，E-mail：mdylx@163.com

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1005-3697(2016)04-0479-05

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