TXNIP過(guò)表達(dá)對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡通路的影響

吳向征 張倩 梁男男 劉曉波 楊艷宏 焦向英

基礎(chǔ)研究

TXNIP過(guò)表達(dá)對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡通路的影響

吳向征 張倩 梁男男 劉曉波 楊艷宏 焦向英

目的 本研究使用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察在正常糖脂濃度下培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞過(guò)表達(dá)TXNIP是否引起細(xì)胞凋亡，并對(duì)TXNIP介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路進(jìn)行初步分析。方法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在正常糖脂濃度下培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞分為3組，即正常培養(yǎng)組、空病毒（Ad-eGFP）組和TXNIP過(guò)表達(dá)（Ad-TXNIP-eGFP）組，均于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。結(jié)果 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h時(shí)病毒轉(zhuǎn)染率達(dá)到高峰，并且熒光蛋白表達(dá)量基本一致。同Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組TXNIP mRNA（38.68±7.35比0.73±0.39，P＜0.01）和蛋白表達(dá)量（1.28±0.25比0.62±0.16，P＜0.01）均明顯增高，說(shuō)明轉(zhuǎn)染及TXNIP過(guò)表達(dá)成功。與AdeGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組Caspase-3相對(duì)活性明顯增高［（3.823±0.238）nmol·h-1·mg-1比（0.956± 0.107）nmol·h-1·mg-1，P＜0.01］；反映下游不同通路的Caspase-8［（132.10±27.33）pg/ml比（81.01±15.34）pg/ml，P＜0.01］、Caspase-9［（290.76±43.15）pg/ml比（88.94±14.68）pg/ml，P＜0.01］和Caspase-12活性［（266.96± 18.50）pg/ml比（52.05±6.13）pg/ml，P＜0.01］均明顯增高。結(jié)論 單純過(guò)表達(dá)TXNIP可以引起正常糖脂濃度培養(yǎng)下INS-1細(xì)胞凋亡。線粒體凋亡途徑、死亡受體活化途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)途徑均參與了TXNIP引起的INS-1細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

硫氧還蛋白相互作用蛋白；INS-1細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑；死亡受體途徑；線粒體凋亡途徑；凋亡

近年來(lái)，隨著生活工作方式的巨大改變，糖尿病逐漸成為威脅人類(lèi)健康的重要疾病之一。但是，糖尿病引起B(yǎng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚不完全明確。近年來(lái)，我課題組一直關(guān)注一種在細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)的蛋白——硫氧還蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了大量研究。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）存在于細(xì)胞漿內(nèi)和線粒體內(nèi)，除具有重要的抗自由基能力外，還具有抑制凋亡的功能。TXNIP又名硫氧還蛋白相互作用蛋白，是唯一一個(gè)內(nèi)源性Trx結(jié)合抑制蛋白質(zhì)，能通過(guò)其第247位點(diǎn)半胱氨酸與Trx的32或35為半胱氨酸結(jié)合而抑制Trx活性，進(jìn)而增加氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)凋亡[1]。

我課題組前期已證明過(guò)表達(dá)TXNIP可以引起心肌細(xì)胞凋亡增加，而使用RNA干擾抑制高糖高脂模擬糖尿病刺激引起的TXNIP表達(dá)上調(diào)，可以顯著減輕細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但對(duì)TXNIP本身誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游途徑認(rèn)識(shí)尚不清晰。胰島B細(xì)胞是分泌胰島素的唯一細(xì)胞，其死亡和數(shù)目減少是糖尿病發(fā)生的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀察TXNIP是否也參與糖尿病時(shí)胰島細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并對(duì)其可能的下游機(jī)制，除經(jīng)典的線粒體凋亡途徑和外源性死亡受體途徑，特別對(duì)新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要儀器和試劑 Heal Force HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，SW-CJ-2FD雙人單面垂直超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），IX73熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS），MX3005P Real-Time PCR儀（美國(guó)STRATAGEN公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），高速離心機(jī)（Thermo Fisher），電泳儀（北京市六一儀器廠DYY-6C型），半干轉(zhuǎn)（BIO-RAD公司），JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所），Kodak Image Station 400（美國(guó)Kodak公司）。

INS-1細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。改良型RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司，胎牛血清、0.25%含EDTA的胰酶和青霉素-鏈霉素溶液（100×）購(gòu)于北京全式金生物科技有限公司。兩種病毒Ad-CMV-TXNIP（WT）-IRES-eGFP、Ad-CMV-eGFP是與廣州賽業(yè)生物科技有限公司合作構(gòu)建獲得的，病毒滴度分別為2.21×1011PFu/ml和2.60× 1010PFu/ml。TXNIP引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)和合成。RNA提取試劑盒購(gòu)于TIANGEN公司，反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR試劑盒購(gòu)于北京全式金生物科技有限公司。凝膠試劑盒購(gòu)于博士德公司，裂解液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所（型號(hào)P0013B），CASP12、CASP8、CASP9化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒購(gòu)于Elabscience公司，Caspase-3活性試劑盒購(gòu)于美國(guó)BIOMOL公司，TXNIP一抗抗體購(gòu)于abcam公司，β-Actin一抗抗體購(gòu)于CST公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)于博士德生物公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)：用含20%胎牛血清、雙抗（青霉素-鏈霉素溶液100 U/ml）的改良型1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞長(zhǎng)滿（80%～90%）時(shí)進(jìn)行傳代和轉(zhuǎn)染處理等操作。傳代時(shí)棄掉原培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，加入700 μl（75 cm×75 cm培養(yǎng)瓶）0.25%含EDTA的胰酶室溫下消化1 min，肉眼觀察到貼壁的細(xì)胞懸浮起來(lái)，鏡下觀察到細(xì)胞變圓、不相連，及時(shí)加入含20%胎牛的1640終止消化，輕輕吹打數(shù)次，傳至2瓶，每瓶約12 ml培養(yǎng)基，混勻后置于孵箱培養(yǎng)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞傳代時(shí)，接種到六孔板上，觀察到細(xì)胞在六孔板上長(zhǎng)滿時(shí)，細(xì)胞數(shù)為1×106/孔。吸出培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次吸出。按照感染復(fù)數(shù)MOI（multiplicity of infection）= 100，每孔1 ml病毒稀釋液（不含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4 h后每孔補(bǔ)液1 ml（含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h換液處理，每隔12 h觀察一次轉(zhuǎn)染率，于轉(zhuǎn)染效率最高時(shí)收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 分組與方法

1.2.1 分組 本實(shí)驗(yàn)共分為3組，即正常培養(yǎng)組、空病毒（Ad-eGFP）組和TXNIP過(guò)表達(dá)（Ad-TXNIP-eGFP）組，使用正常糖脂濃度的1640培養(yǎng)基，均于轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 方法

1.2.2.1 熒光倒置顯微鏡觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率 利用熒光倒置顯微鏡觀察并拍攝同一個(gè)視野下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)算同一個(gè)視野下帶綠色熒光蛋白的細(xì)胞占整個(gè)視野下所有細(xì)胞的百分比，計(jì)算出轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2.2 Real-Time PCR方法測(cè)定 INS-1細(xì)胞TXNIP mRNA的表達(dá) INS-1細(xì)胞mRNA提取用離心柱型總 RNA提取試劑盒，cDNA合成用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix。反轉(zhuǎn)錄的條件是42℃孵育30 min，85℃、5 s，4℃保存。Real-Time PCR儀為 Mx3005P Real-Time PCR儀，反應(yīng)條件是Segment1為94℃、30 s，1個(gè)循環(huán)；Segment2為94℃、5 s，60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；Segment3為95℃、1 min，55℃、30 s，95℃、30 s，1個(gè)循環(huán)。結(jié)果用相對(duì)定量結(jié)果計(jì)算（2-△△Ct法）。所使用的基因引物序列為：GAPDH上游引物：5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′，GAPDH下游引物：5′-AACTTGCCGTGGGTAGAG-3′，TXNIP上游引物：5′-AGTGATTGGCAGCAGGTC-3′，TXNIP下游引物：5′-GGTGTCTGGGATGTTTAGG-3′。結(jié)果以正常對(duì)照組的平均值作為100%，計(jì)算其余各組與之相對(duì)的比值。

1.2.2.3 Western blot方法測(cè)定TXNIP、β-Actin的相對(duì)表達(dá)量 待轉(zhuǎn)染到48 h時(shí)，吸掉培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次并吸干，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞并收集到離心管中，每管加入100 μl裂解液和 10 μl PMSF，在冰上用超聲波打碎，然后4℃裂解3 h左右后，12 000 rpm離心15 min取上清。用BCA法測(cè)出三組的蛋白濃度進(jìn)行定量，按每孔樣量為40 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，80 V電泳30 min至樣品到分離線時(shí)，將電壓轉(zhuǎn)化為120 V電泳60 min左右，電泳完后半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜15 V 15 min，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白在4℃封閉2 h，洗膜后加入相應(yīng)的一抗過(guò)夜（TXNIP、β-Actin稀釋比例為1∶1000）。次日用PBST吸3次，每次5 min后，分別加入對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋比例均為1∶5000）4℃下2 h，然后洗膜20 min。加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物，用Kodak成像掃描儀掃描拍攝蛋白條帶。所有蛋白條帶都與內(nèi)參β-Actin作為對(duì)比，實(shí)驗(yàn)在相同的條件下至少重復(fù)6次。結(jié)果以正常對(duì)照組的平均值作為100%，計(jì)算其余各組與之相對(duì)的比值。

1.2.2.4 Caspase-3相對(duì)活性測(cè)定 Caspase-3代表了細(xì)胞凋亡的終末途徑，對(duì)它的測(cè)量可以反映細(xì)胞的凋亡程度。蛋白提取方法如上，取一個(gè)96孔板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔。將Caspase-3試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品按稀釋濃度由20.000mm～0.156mm進(jìn)行倍比稀釋。每孔加入10 μl三蒸水、50 μl反應(yīng)緩沖液、10 μl底物（Ac-DEVD-AFC）工作液和30 μl裂解液，充分混勻；在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔里依次加入100 μl倍比稀釋的AFC標(biāo)準(zhǔn)液。37℃孵育90 min后在508 nm發(fā)射光和400 nm激發(fā)光檢測(cè)各孔熒光密度值，用標(biāo)準(zhǔn)品的熒光密度值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。Caspase-3活性根據(jù)公式［AFC（1.5 h）-AFC（0 h）］/蛋白濃度/1.5 h（單位：nmol·h-1·mg-1）計(jì)算。

1.2.2.5 Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12活性測(cè)定 Caspase-8是細(xì)胞凋亡死亡受體通路中的一個(gè)啟動(dòng)子，Caspase-9是線粒體凋亡通路中一個(gè)重要分子，而Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要分子，在經(jīng)典的內(nèi)源性和外源性細(xì)胞凋亡途徑中是不被激活的。本試劑盒用雙抗體夾心法，用相應(yīng)的大鼠Caspase抗體包被于酶標(biāo)板上，樣品中含有的Caspase會(huì)與包被抗體結(jié)合，然后依次加入生物素化的抗大鼠Caspase抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，最后加入發(fā)光底物混合液，發(fā)光底物在辣根過(guò)氧化物酶的催化下發(fā)出熒光，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔在450 nm下的OD值，各孔的OD值即可反映其Caspase濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中Caspase活性（單位：pg/ml）可以此進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 通過(guò)對(duì)同一個(gè)視野下帶綠色熒光蛋白的細(xì)胞所占的比例進(jìn)行計(jì)算，分別計(jì)算出AdeGFP組INS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h、48 h的轉(zhuǎn)染率分別為（14.44±3.09）%、（83.30±7.02）%，Ad-TXNIP-eGFP組細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24 h、48 h的轉(zhuǎn)染率分別為（12.29±2.83）%、（82.90±5.61）%。由此可以看出，無(wú)論Ad-eGFP組或Ad-TXNIP-eGFP組48 h的轉(zhuǎn)染率均高于24 h（P＜0.01），所以選用48 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。48 h時(shí)Ad-eGFP組和Ad-TXNIP-eGFP組的轉(zhuǎn)染率未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明各組病毒轉(zhuǎn)染量基本一致。見(jiàn)圖1。

2.2過(guò)表達(dá)組TXNIP mRNA的表達(dá)量 INS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后過(guò)表達(dá)組TXNIP mRNA的表達(dá)量明顯增高。與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞TXNIP表達(dá)量未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.73±0.39比1.01± 0.06，P＞0.05）；與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組TXNIP表達(dá)量明顯增高（38.68±7.35比0.73±0.39，P＜0.01），說(shuō)明病毒載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、目的基因過(guò)表達(dá)成功。見(jiàn)圖2。

2.3 過(guò)表達(dá)組TXNIP蛋白表達(dá)量 INS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后過(guò)表達(dá)組TXNIP蛋白表達(dá)量明顯增高。與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞TXNIP蛋白表達(dá)量未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.62±0.16比 0.70± 0.13，P＞0.05）；與Ad-eGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組TXNIP蛋白表達(dá)量明顯增高（1.28±0.25比0.62±0.16，P＜0.01），進(jìn)一步證實(shí)了病毒載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、目的基因過(guò)表達(dá)成功。見(jiàn)圖3。

2.4 過(guò)表達(dá)TXNIP組Caspase-3相對(duì)活性 過(guò)表達(dá)TXNIP組Caspase-3相對(duì)活性明顯增高。與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞Caspase-3相對(duì)活性未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［（0.956±0.107）nmol·h-1·mg-1比（0.896±0.120）nmol·h-1·mg-1，P＞0.05］；與AdeGFP組相比Ad-TXNIP-eGFP組Caspase-3相對(duì)活性明顯增高［（3.823±0.238）nmol·h-1·mg-1比（0.956±0.107）nmol·h-1·mg-1，P＜0.01］。因?yàn)镃aspase-3代表了細(xì)胞凋亡的終末共同途徑，Ad-TXNIP-eGFP組 Caspase-3相對(duì)活性增高說(shuō)明TXNIP的過(guò)表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致INS-1細(xì)胞凋亡顯著增加。見(jiàn)圖4。

2.5 過(guò)表達(dá)TXNIP組Caspase-8活性升高 與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞Caspase-8活性未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［（81.01±15.34）pg/ml比（79.87±12.88）pg/ml，P＞0.05］；與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組Caspase-8活性明顯增高［（132.10±27.33）pg/ml比（81.01±15.34）pg/ml，P＜0.01］。Caspase-8反映了死亡受體通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況，TXNIP過(guò)表達(dá)組Caspase-8活性升高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)TXNIP可以引起死亡受體通路引起的INS-1細(xì)胞凋亡增加。見(jiàn)圖5。

2.6 過(guò)表達(dá)TXNIP組Caspase-9活性 過(guò)表達(dá)TXNIP組Caspase-9活性升高。與正常組培養(yǎng)相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞Caspase-9活性未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［（88.94±14.68）pg/ml比（81.07±12.58）pg/ml，P＞0.05］；與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組Caspase-9活性明顯升高［（290.76±43.15）pg/ml比（88.94±14.68）pg/ml，P＜0.01］。Caspase-9反映了線粒體凋亡通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況，TXNIP過(guò)表達(dá)組Caspase-9活性明顯升高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)TXNIP可以通過(guò)線粒體通路引起的INS-1細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖6。

2.7 過(guò)表達(dá)TXNIP組Caspase-12活性 過(guò)表達(dá)TXNIP組Caspase-12活性增高。與正常培養(yǎng)組相比，Ad-eGFP組INS-1細(xì)胞Caspase-12活性未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［（52.05±6.13）pg/ml比（50.19±2.37）pg/ml，P＞0.05］；與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組 Caspase-12活性明顯增高［（266.96± 18.50）pg/ml比（52.05±6.13）pg/ml，P＜0.01］。Caspase-12只是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中被激活，反映了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況，TXNIP過(guò)表達(dá)組Caspase-12活性增高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)TXNIP可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡增加。見(jiàn)圖7。

3 討論

2010年楊文英等[2]對(duì)我國(guó)20歲以上成年人糖尿病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)糖尿病患者已占到成年人的9.7%，達(dá)9240萬(wàn)人，而糖尿病前期占15.5%，達(dá)到14 820萬(wàn)，這也意味著未來(lái)有更多的人罹患糖尿病。同時(shí)，我國(guó)糖尿病的治療現(xiàn)狀不容樂(lè)觀。有調(diào)查顯示[3]，我國(guó)糖尿病患者中僅有30.1%的人確診，25.8%的人接受糖尿病治療。這些數(shù)字提示我們，糖尿病已經(jīng)成為一個(gè)我國(guó)未來(lái)必須面對(duì)的重要社會(huì)問(wèn)題。糖尿病分為胰島素依賴(lài)的1型和進(jìn)展較慢可長(zhǎng)期不依賴(lài)胰島素治療的2型，但無(wú)論哪種類(lèi)型糖尿病其實(shí)都出現(xiàn)B細(xì)胞的損傷和凋亡，并最終導(dǎo)致胰島功能的失代償，而不得不進(jìn)入胰島素依賴(lài)期。

前期研究表明，在糖尿病動(dòng)物心肌等組織中Trx的功能顯著下降，可能是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要原因。進(jìn)一步分析提示，Trx功能下降涉及Trx硝基化修飾增加、Trx還原酶（TR）活性下降、TXNIP（Trx interacting protein）表達(dá)上調(diào)三大原因。在糖尿病和高糖引起的Trx系統(tǒng)相關(guān)改變中，TXNIP的表達(dá)上調(diào)非常顯著，引起課題組的極大興趣。

TXNIP在1994年由Chen和Deluca教授[4]首次發(fā)現(xiàn)，在使用1，25-（OH）2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化時(shí)出現(xiàn)一個(gè)46 KD的蛋白大量表達(dá)，因此命名為Vitamin-D3 upregulated protein 1（VDUP1），以后使用酵母菌雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可與Trx結(jié)合，故也稱(chēng)為thioredoxin binding protein-2（TBP2）。TXNIP是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)內(nèi)源性的Trx結(jié)合及抑制蛋白質(zhì)，能通過(guò)和Trx結(jié)合而抑制其活性，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進(jìn)凋亡，因在糖尿病和高糖引起的諸蛋白表達(dá)變化中TXNIP的上調(diào)非常顯著，因而引起眾多研究者的關(guān)注。

本課題組曾經(jīng)對(duì)TXNIP與糖尿病的關(guān)系進(jìn)行了大量研究。先后過(guò)表達(dá)和RNA干擾兩種干預(yù)證明TXNIP是介導(dǎo)糖尿病引起心肌細(xì)胞凋亡的重要原因。同時(shí)研究也提示，TXNIP引起細(xì)胞凋亡除存在Trx依賴(lài)途徑外，也存在不依賴(lài)于Trx的其他途徑[5]。

鑒于胰島細(xì)胞，特別是B細(xì)胞在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)使用腺病毒過(guò)表達(dá)TXNIP，觀察TXNIP本身對(duì)正常糖脂濃度下培養(yǎng)的胰島B細(xì)胞株INS-1細(xì)胞的影響。在各組轉(zhuǎn)染率最高并且熒光蛋白表達(dá)量一致時(shí)，在mRNA水平和蛋白水平對(duì)TXNIP表達(dá)量研究顯示，TXNIP過(guò)表達(dá)組比空病毒組明顯升高，說(shuō)明此時(shí)腺病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)TXNIP成功。在此前提下，對(duì)細(xì)胞終末凋亡途徑的Caspase-3相對(duì)活性檢測(cè)，TXNIP過(guò)表達(dá)組的Caspase-3相對(duì)活性明顯升高，細(xì)胞凋亡增加。由于本實(shí)驗(yàn)用的是正常糖脂濃度的1640培養(yǎng)基，可以排除糖尿病條件下高糖、高脂等其他因素的影響，因此可以確定單純過(guò)表達(dá)TXNIP本身可以引起INS-1細(xì)胞的凋亡。

目前公認(rèn)的主要細(xì)胞凋亡途徑有三種，即經(jīng)典的線粒體凋亡途徑、死亡受體活化途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種引起細(xì)胞凋亡的路徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵場(chǎng)所，參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和修飾，在糖尿病時(shí)由于胰島素合成的代償性增加，伴隨出現(xiàn)大量積累的未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的能力時(shí)，誘發(fā)的ERS會(huì)觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），一旦UPR不可修復(fù)，就會(huì)使細(xì)胞凋亡[6,7]。UPR由一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/BIP和3個(gè)跨膜信號(hào)蛋白組成，分別是PERK［protein kinase RNA（PKR）-like ER kinase］、IRE1α（inositolrequiring protein-1α）和ATF6α（activating transcription factor 6α）[8]，這三個(gè)跨膜蛋白可作為UPR信號(hào)的感受器[9]。Oslowski等[10]證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡中的一個(gè)關(guān)鍵分子是TXNIP。這也引起我們的興趣來(lái)研究單純過(guò)表達(dá)TXNIP對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。

本實(shí)驗(yàn)中我們選取Caspase-12來(lái)反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度。Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要分子，在另外兩條凋亡途徑中不被激活，只反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況[11]。單純過(guò)表達(dá)TXNIP時(shí)，Caspase-12活性顯著，說(shuō)明TXNIP可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡。

死亡受體途徑是靶細(xì)胞表面的死亡受體包括Fas、腫瘤壞死因子受體-1（TNF-R1）等，結(jié)合同源配體后啟動(dòng)凋亡程序，激活Caspase-8，以及激活下游的Caspase-3等，從而引起凋亡。本實(shí)驗(yàn)中我們選擇Caspase-8來(lái)反映TXNIP對(duì)INS-1細(xì)胞死亡受體通路的影響。Caspase-8是死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中關(guān)鍵的啟動(dòng)子，能夠與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合，形成死亡復(fù)合物，進(jìn)而誘導(dǎo)下游Caspase基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本研究中TXNIP過(guò)表達(dá)組的Caspase-8活性顯著升高，表明死亡受體通路參與了TXNIP引起的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

線粒體凋亡通路是在20世紀(jì)90年代被人們所認(rèn)知。一些因素如自由基、紫外線、DNA損傷藥物等可使線粒體DNA損傷增多[13]，引起線粒體外膜通透性增加，存在于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放，釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)Caspase-9前體活化，隨后激活Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14,15]。線粒體凋亡途徑也可以通過(guò)死亡配體激活，Caspase-8可以通過(guò)凋亡相關(guān)蛋白Bid，誘導(dǎo)線粒體外膜通透性改變，引起凋亡相關(guān)因子釋放，激活Caspase-9，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)選擇Caspase-9的活性來(lái)反映TXNIP對(duì)INS-1細(xì)胞線粒體凋亡通路的影響。我們可以看出TXNIP過(guò)表達(dá)組Caspase-9活性顯著升高，說(shuō)明TXNIP可以通過(guò)線粒體凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明：①單純過(guò)表達(dá)TXNIP可以引起正常糖脂濃度培養(yǎng)下INS-1細(xì)胞凋亡；②TXNIP可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的途徑、死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑引起INS-1細(xì)胞的凋亡。關(guān)于三條途徑在TXNIP引起凋亡中的作用大小及相互關(guān)系，則有待我們進(jìn)一步研究分析證實(shí)。

圖1 轉(zhuǎn)染48h胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（n=8，n.s.not significant.）

圖2 Real-Time PCR方法測(cè)定轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞TXNIP的mRNA表達(dá)

圖3 Western Blot方法測(cè)定轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞TXNIP的蛋白表達(dá)

圖4 轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞Caspase-3活性測(cè)定

圖5 轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞Caspase-8活性測(cè)定

圖6 轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞Caspase-9活性測(cè)定

圖7 轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞Caspase-12活性測(cè)定

［1］Parth P，Higgins LJ，Chutkow WA，et al.The interaction of thioredoxin with Txnip.Evidence for formation of a mixed disulfide by disulfide exchange.J Biol Chem，2006，281：21884-21891.

［2］Yang WY，Lu JM，Weng JP，et al.Prevalence of Diabetes among Men and Women in China.N Engl J Med，2010，362：1090-1101.

［3］Xu Y，Wang L，He J，et al.Prevalence and Control of Diabetes in Chinese AdultsDiabetes Control in Chinese Adults Diabetes Control in Chinese Adults.JAMA，2013，310：948-958.

［4］Chen KS，Deluca HF.Isolation and characterization of a novel cDNA from HL-60 cells treated with 1，25-dihydroxyvitamin D-3.BBA-GENE STRUCT EXPR，1994，1219：26-32.

［5］劉曉波，楊嘯，姚艷玲，等.腺病毒過(guò)表達(dá)TXNIP對(duì)INS-1胰島細(xì)胞損傷和凋亡的影響.中國(guó)心血管病研究，2014，12：1127-1132.

［6］Lee S，Kim SM，Dotimas J，et al.Thioredoxin-interacting protein regulates protein disulfide isomerases and endoplasmic reticulum stress.EMBO Mol Med，2014，6：732-743.

［7］Shore GC，Papa FR，Oakes SA.Signaling cell death from the endoplasmic reticulum stress response.Curr Opin Cell Biol，2011，23：143-149.

［8］關(guān)麗英，許彩民，潘華珍.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007，34：1136-1141.

［9］Ron D，Walter P.Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8：519-529.

［10］Oslowski CM，Hara T，O′Sullivan-Murphy B，et al.Thioredoxin-interacting protein mediates ER stress-induced βcell death through initiation of the inflammasome.Cell Metab，2012，16：265-273.

［11］Ferri KF，Kroemer G.Organelle-specific initiation of cell death pathways.Nat Cell Biol，2001，3：E255-263.

［12］劉洪娟，汲晨鋒，高世勇，等.死亡受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展.中草藥，2009，S1：48-51.

［13］Ballinger SW，Patterson C，Yan CN，et al.Hydrogen peroxideand peroxynitrite-induced mitochondrial DNA damage and dysfunction in vascular endothelial and smooth muscle cells.Circ Res，2000，86：960-966.

［14］Stevens JM.Cytochrome c as an experimental model protein. Metallomics，2011，3：319-322.

［15］Gustavsson T，Trane M，Moparthi VK，et al.A cytochrome c fusion protein domain for convenient detection,quantification，and enhanced production of membrane proteins in Escherichia coli——expression and characterization of cytochrome-tagged Complex I subunits.Protein Sci，2010，19：1445-1460.

Effect of adenovirus-mediated TXNIP overexpression on INS-1 cell apoptosis pathway

WU Xiang-zheng，ZHANG Qian，LIANG Nan-nan，et al.Department of Physiology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

JIAO Xiang-ying，E-mail：jiaoxy@gmail.com

Objective To observe if TXNIP overexpression alone can cause INS-1 cell apoptosis，and the effect of TXNIP on different apoptotic pathways，adenovirus carrying TXNIP gene was used to transfect INS-1 islet cells cultured in normal glucose and normal lipid concentration conditions.MethodsINS-1 islet cells in logarithmic growth phase were randomly divided into three groups:normal cultured group，empty adenovirus vector（Ad-eGFP）group and TXNIP overexpression（Ad-TXNIP-eGFP）group.All the cells were collected 48 h after transfection for further assay.ResultsTransfection efficiency reached its peak 48 h after the adenovirus transfection，and the expression of green fluorescent protein in three groups were nearly equally.Compared to the Ad-eGFP group，the expression of TXNIP mRNA（38.68±7.35 vs 0.73±0.39，P＜0.01）and protein（1.28±0.25 vs 0.62±0.16，P＜0.01）of Ad-TXNIP-eGFP group increased significantly，which meant adenovirus-mediated TXNIP overexpression was successful.Caspase-3 activity was significantly increased compared to Ad-eGFP group［（3.823± 0.238）nmol·h-1·mg-1vs（0.956±0.107）nmol·h-1·mg-1，P＜0.01］.To further elucidate the downward pathways may involve in TXNIP induced cell apoptosis，our results shown that Caspase-8［（132.10±27.33）pg/ml vs（81.01± 15.34）pg/ml，P＜0.01］，Caspase-9［（290.76±43.15）pg/ml vs（88.94±14.68）pg/ml，P＜0.01］and Caspase-12 activity［（266.96±18.50）pg/ml vs（52.05±6.13）pg/ml，P＜0.01］were all increased significantly when compared with the eGFP group.ConclusionTXNIP overexpression alone can cause INS-1 cell apoptosis，which were cultured in normal glucose and normal lipid concentration conditions.Furthermore，the apoptosis is mediated bythree different pathways，including mitochondria apoptosis pathway，death receptor pathway and endoplasmic reticulum stress pathway.

Thioredoxin interacting protein；INS-1 islet cells； Endoplasmic reticulum stress pathway；Death receptor pathway；Mitochondria apoptosis pathway；Apoptosis

山西醫(yī)科大學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：Q02201208）

030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系

焦向英，E-mail：jiaoxy@gmail.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．02．026

R587.1

A

1672-5301（2016）02-0185-06

2015-09-25）