螺旋藻規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)良藻株的選育

李正娟,?！∪?石光波,徐青艷,趙肖榮,閆卉新,李博生

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)),北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所,北京 100083)

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螺旋藻規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)良藻株的選育

李正娟,常蓉,石光波,徐青艷,趙肖榮,閆卉新,李博生*

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)),北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所,北京 100083)

本研究選用鈍頂螺旋藻為出發(fā)株,采用毛細(xì)吸管顯微分離法分離單藻絲,并結(jié)合紫外-可見光譜掃描,選育出了2個高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的螺旋藻藻株sina032和sina029。sina032和sina029的生物量較出發(fā)株分別提高了44.8%和39.4%,其生物活性物質(zhì)(葉綠素、藻藍(lán)蛋白、類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素(順式)和蛋白質(zhì))含量和出發(fā)株基本相同,且藻絲形態(tài)良好(藻絲較長、螺旋數(shù)約為20個、螺距較大)、上浮性較好。研究結(jié)果表明,通過單藻絲分離的方法,可選育出生物量高、生物活性物質(zhì)含量高的鈍頂螺旋藻藻株,在工業(yè)化生產(chǎn)中有著重要的實(shí)際意義。

鈍頂螺旋藻,毛細(xì)吸管顯微分離法,單藻絲,生物量,生物活性物質(zhì)

cis-β-carotene and protein)were oughly the same as that of the original strain.They had better filament form(longer filament,about 20 spiral,bigger pitch)and higher flotation activity. These results showed that the method of separation of per algal filament can be used to screenSpirulinastrains with high biomass and high content of bioactivators,which had important and practical significance in the industrial production ofS.platensis.

螺旋藻(Spirulina)是一種屬于藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、顫藻目、顫藻科、螺旋藻屬的原核藻類[1]。螺旋藻富含蛋白質(zhì)(約70%)、碳水化合物、脂肪、色素(主要是葉綠素、藻藍(lán)蛋白和類胡蘿卜素)、維生素、微量元素以及其他對人體有特殊療效的生物活性物質(zhì)等,并含有易于人體消化的八種必需氨基酸,因此具有巨大的商業(yè)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-4]。螺旋藻已廣泛應(yīng)用于食品、功能保健品、化妝品和飼料添加等行業(yè)。

國內(nèi)外已知螺旋藻約有39種[5],但用于人工培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的藻種只有鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻[6],它們原產(chǎn)地分布在非洲乍得湖和墨西哥湖。我國學(xué)者“七五”期間就開始引進(jìn)藻種,并進(jìn)行研究和馴化。為了提高螺旋藻的產(chǎn)量和質(zhì)量,國內(nèi)外許多學(xué)者采用了許多物理或化學(xué)等手段誘變育種,也選育出了許多新的藻種[7-8]。幾十年來,這些藻種在企業(yè)間不斷傳遞使用,在其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中,易受環(huán)境條件的變化而出現(xiàn)藻種混雜退化、生長慢、產(chǎn)量低、質(zhì)量不穩(wěn)定等問題,嚴(yán)重阻礙了螺旋藻產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。因此,十分有必要對螺旋藻藻種不斷進(jìn)行分離、純化及選育,才能實(shí)現(xiàn)螺旋藻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。在這方面國內(nèi)外已采用對單個藻絲體進(jìn)行分離和培養(yǎng)的方法進(jìn)行了一些研究[9-10]。在相同的培養(yǎng)條件下,不同的螺旋藻藻種不但生長速度不同,其所含的營養(yǎng)物質(zhì)也會有一定的差異[11]。因此,本研究以國內(nèi)螺旋藻養(yǎng)殖面積最大、最為集中的產(chǎn)業(yè)化基地(年產(chǎn)量約占全國總產(chǎn)量的40%以上)——內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗螺旋藻園區(qū)為依托,對其生產(chǎn)藻種作為出發(fā)株,進(jìn)行單藻絲分離選育,通過各自生物量比較研究和紫外-可見光譜掃描定性研究營養(yǎng)物質(zhì)的差異,選育出高生物量、高營養(yǎng)的螺旋藻藻株,用于螺旋藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

鈍頂螺旋藻S2內(nèi)蒙古鄂托克旗螺旋藻產(chǎn)業(yè)園;Zarrouk培養(yǎng)基[12]所有化學(xué)試劑均為分析純，購于北京科百奧生物科技有限責(zé)任公司。

人工氣候室德國Binder賓得;HY-8A數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;H/T16MM臺式高速離心機(jī)湖南赫西儀器裝備有限公司;SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計(jì)日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1單藻絲分離、培養(yǎng)及逐步擴(kuò)大培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)在人工氣候室進(jìn)行,采用Zarrouk培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)條件:溫度28～30 ℃,光照強(qiáng)度4500 lux,光照周期L∶D=12 h∶12 h,100 r/min搖床培養(yǎng)。在此條件下培養(yǎng)螺旋藻出發(fā)株6 d。

取幾滴藻液在顯微鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)每滴藻液中的藻絲數(shù)目,根據(jù)藻絲數(shù)目添加適量培養(yǎng)液逐步稀釋藻液,盡量使藻絲分散于培養(yǎng)液中。取稀釋藻液在顯微鏡下用毛細(xì)吸管吸取單根健壯藻絲(藻絲粗壯且較長、螺距較寬、螺旋數(shù)較多、顏色正常),轉(zhuǎn)入已加入適量新鮮培養(yǎng)液的試管中進(jìn)行螺旋藻單株培養(yǎng)(溫度25 ℃,光照強(qiáng)度1000 lux)。待藻液變綠后(約培養(yǎng)15 d)轉(zhuǎn)入150 mL三角瓶,加入50 mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)30 d(溫度25 ℃,光照強(qiáng)度2000 lux)。將藻液轉(zhuǎn)入250 mL三角瓶,加入100 mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d,再加入100 mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d(溫度28 ℃,光照強(qiáng)度4000 lux),重復(fù)操作三次,獲得大量藻絲群體以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在螺旋藻篩選和培養(yǎng)過程中,每天在顯微鏡下觀察并記錄螺旋藻的生長狀態(tài)。

1.2.2螺旋藻出發(fā)株與藻絲群體的生長比較將實(shí)驗(yàn)1.2.1藻絲群體和螺旋藻出發(fā)株S2接種到已加入300 mL新鮮Z氏培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中,接種OD560 nm為0.1,分別設(shè)置3個平行。培養(yǎng)條件為溫度30 ℃,光照強(qiáng)度4500 lux,光照周期L∶D=12 h∶12 h,100 r/min搖床培養(yǎng)15 d。鏡檢各藻株的藻絲形態(tài)。

1.2.3生物量的測定將實(shí)驗(yàn)1.2.2培養(yǎng)的藻液用已恒重的300目濾布過濾,用蒸餾水沖洗掉藻體上附著的鹽分后冷凍干燥,稱量并減掉濾布重量后,即得到各個藻株的生物量(干重/g)[13]。比較各個藻株生長量之間的差異,篩選出3株生物量較高和3株生長量較低的藻株。

1.2.4紫外-可見光光譜分析分別準(zhǔn)確稱取實(shí)驗(yàn)1.2.3篩選出的藻株和出發(fā)株的干粉0.04 g,放入10 mL試管中,加入5 mL 70%乙醇,用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎(600 W,10 min),超聲結(jié)束后,將其離心(6000 r/min,15 min),然后取2 mL上清液,定容至10 mL。用紫外-可見分光光度計(jì)在波長200～800 nm處進(jìn)行掃描,繪制各藻株的吸收曲線。

1.3數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1螺旋藻單藻絲的分離和培養(yǎng)

本研究采用毛細(xì)吸管顯微分離法分離出50根生長狀態(tài)良好的單藻絲(顏色呈綠色、螺旋數(shù)多于6、螺距較大、藻絲粗壯),置于試管中培養(yǎng)。培養(yǎng)15 d后,有42支試管中的藻液顏色變綠。在第15 d分別多次取50支試管中的藻液,在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):a.在藻液顏色呈綠色的試管中有4支試管中并沒有螺旋藻藻絲,幾乎全是雜藻(多為小球藻)。b.在藻液顏色呈綠色的試管中有3支試管中多數(shù)為螺旋藻,含少量小球藻。c.在藻液顏色呈綠色的試管中其余35支試管中全是螺旋藻。d.在未有顏色變綠的8支試管中未觀察到螺旋藻。

將藻液轉(zhuǎn)入三角瓶后,繼續(xù)培養(yǎng),最終有33根藻絲長成藻絲群體。從第16 d開始每天定時在顯微鏡下觀察各三角瓶中螺旋藻的生長狀態(tài)(藻絲顏色、螺距、螺旋數(shù)等)并詳細(xì)記錄。經(jīng)過長達(dá)一個多月的連續(xù)觀察,分離培養(yǎng)的大部分藻絲體生長狀態(tài)良好且藻絲形態(tài)不易隨培養(yǎng)條件的改變而發(fā)生變化,在培養(yǎng)過程中比較穩(wěn)定。

2.2選育藻株生物量和形態(tài)特征的比較研究

螺旋藻單藻絲個體差異大,將其培育成群體,測其生物量差異顯著,將所分離的藻株命名為sinaX,由表1可知,在相同培養(yǎng)條件、相同培養(yǎng)時間,從出發(fā)株S2分離出的33個單藻絲,其生物量按大小排序排在前三名分別是sina029(0.1667 g)、sina032(0.1732 g)、sina017(0.1659 g),其生物量分別比出發(fā)株S2(0.1196 g)提高了39.4%、44.8%、38.7%。而生物量按大小排序排在后三名分別是sina005(0.1303 g)、sina006(0.1225 g)、sina011(0.1145 g),與出發(fā)株S2相比,sina005和sina006的生物量分別提高了8.9%、2.4%,而sina011生物量則下降了4.3%。其中,生物量最高的藻株是sina032相比于生物量最低的藻株sina011提高了約53.7%,這表明,在相同的培養(yǎng)條件下,不同藻株藻絲個體差異大、生物量差異顯著。

表1　螺旋藻各藻株生物量和形態(tài)特征的比較Table 1　Comparison of biomass and morphological characteristics of Spirulina strains

注:++表示藻液靜置12 h后藻絲幾乎全部上浮在液面;+表示藻液靜置12 h后藻絲大部分上浮在液面;-表示藻液靜置12 h后藻絲大部分沉降。

螺旋藻藻絲形態(tài)和其生物量之間有一定的相關(guān)系。從表1和圖1中可以看出,螺旋藻顏色深綠、藻絲越長、螺旋數(shù)越多、螺距越大、上浮性越好,其生物量就越高。其中,sina005、sina006、sina011藻株在培養(yǎng)過程中藻絲形態(tài)不太穩(wěn)定,尤其sina005藻株藻絲形態(tài)發(fā)生變異,部分藻絲呈直線型(圖1)。sina017、sina029、sina032藻株的螺旋數(shù)多于15、藻絲長，且藻絲形態(tài)較穩(wěn)定、上浮性好。這使得螺旋藻易于采收,是螺旋藻大規(guī)模工業(yè)化養(yǎng)殖中重要的性狀。藻絲上浮性可以調(diào)節(jié)其在水體中的位置,是其趨于適宜的環(huán)境,有利于螺旋藻的生長,且浮性好的藻絲易于采收[14]。根據(jù)上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)各藻株藻絲之間個體差異大、生物量差異顯著,表明通過單藻絲分離法選育螺旋藻藻種在生產(chǎn)上是可行的。

圖1　sina005、sina011、sina029 和sina032的形態(tài)比較(100×)Fig.1　Comparison of morphological characteristics of sina005, sina011,sina029 and sina032(100×)

2.3選育藻株間所含營養(yǎng)物質(zhì)定性研究

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,螺旋藻主要生物活性物質(zhì)的可見和紫外光譜特征吸收波長范圍列于表2,該吸收波長范圍與圖2和圖3比較,推斷出各藻株主要活性物質(zhì)存在和差異。如圖2和圖3所示,選育出的6個藻株和出發(fā)株的吸收曲線主要有6個吸收峰,分別位于紅光區(qū)的666 nm和616～628 nm處、藍(lán)紫光區(qū)的475～477 nm和436～444 nm處、近紫外光區(qū)的336～339 nm和260～264 nm處。各個藻株的主要生物活性物質(zhì)的種類相同,分別是葉綠素、藻藍(lán)蛋白(PC)、類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素(順式)和蛋白質(zhì)(表2),但各藻株的主要生物活性物質(zhì)的吸收峰值差異較大。

表2　螺旋藻主要生物活性物質(zhì)的 可見和紫外光譜特征吸收波長Table 2　Visible and ultraviolet spectrum characteristic absorption wavelength of main bioactivators of Spirulina

圖2是生物量較高的3個藻株(sina017、sina029、sina032)與出發(fā)株S2的吸收光譜。如2.2所述,sina029、sina032和sina017的生物量分別比出發(fā)株S2提高了39.4%、44.8%、38.7%。而由圖2可知,sina029、sina032和出發(fā)株S2的主要生物活性物質(zhì)的吸收峰值基本相同,而sina017與S2相比,其葉綠素、藻藍(lán)蛋白(PC)、類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素(順式)和蛋白質(zhì)的吸收峰值依次降低了12.9%、9.3%、20.2%、7.9%和10.1%。這表明生物量高的藻株不一定生物活性物質(zhì)含量高。結(jié)合表1所示的sina017、sina029、sina032的藻絲形態(tài)特征可以看出,螺旋藻藻絲的螺旋數(shù)、顏色、藻絲上浮性與其各主要生物活性物質(zhì)的含量基本呈正相關(guān)。因此,可以通過藻絲形態(tài)特征初步比較各藻株的生物量和主要生物活性物質(zhì)含量。

圖3是生長量較低的3個藻株(sina005、sina006、sina011)與出發(fā)株S2的吸收光譜。如2.2所述,與出發(fā)株S2相比,sina005和sina006的生物量分別提高了8.9%、2.4%,而sina011生物量則下降了4.3%。由圖3可知,sina006和sina011生物活性物質(zhì)的吸收峰值均顯著低于S2,而sina5的生物活性物質(zhì)的吸收峰值含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于S2,其蛋白質(zhì)、藻藍(lán)蛋白(PC)、β-胡蘿卜素(順式)和類胡蘿卜素的吸收峰值分別提高了 43.6%、26.7%、23.7%和12.6%,而葉綠素的吸收峰值稍低于S2。這表明生物量低的藻株不一定生物活性物質(zhì)含量低。因此,在螺旋藻藻種選育中,生物量低的藻株也值得關(guān)注,可以從中篩選出高生物活性物質(zhì)含量的藻株,用于提取生物活性物質(zhì),這與張學(xué)成等的報(bào)道一致[22]。同時也表明,在螺旋藻藻種選育中,不僅要考慮其生物量,還要考慮生物活性物質(zhì)含量,這樣才可以選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的優(yōu)良藻種。

從圖2和圖3還可以看出,生物量較高的藻株(sina029、sina032、sina017)的光合色素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生物量較低的藻株(sina006、sina011),結(jié)合表1中所示藻株的生物量,這表明螺旋藻光合色素含量和生物量之間的關(guān)系呈正相關(guān)。因此,適當(dāng)增加光合色素相應(yīng)吸收波長的光的強(qiáng)度,可以促進(jìn)螺旋藻的光合作用,提高其產(chǎn)量。

圖2　sina017、sina029、sina032與出發(fā)株S2的吸收光譜Fig.2　Absorption spectra of sina017, sina029,sina032 and original strain S2

圖3　sina005、sina006、sina011與出發(fā)株S2的吸收光譜Fig.3　Absorption spectra of sina005, sina006,sina011 and original strain S2

3　結(jié)論

在螺旋藻的實(shí)際生產(chǎn)中,選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)螺旋藻品種和品系是重要的基礎(chǔ)。選育的生產(chǎn)藻種需具有高生物量、高營養(yǎng)、易采收等特性。

本研究對鄂托克旗螺旋藻產(chǎn)業(yè)園的生產(chǎn)藻種鈍頂螺旋藻S2進(jìn)行分離純化,綜合考慮各藻株的生物量和生物活性物質(zhì)的含量,選育出了產(chǎn)量高、生物活性物質(zhì)含量高、形態(tài)良好且穩(wěn)定、易采收的優(yōu)良藻株sina029和sina032,其生物量較S2分別提高了39.4%、44.8%,生物活性物質(zhì)含量和S2基本相同,可直接用于螺旋藻大規(guī)模養(yǎng)殖。

在螺旋藻大規(guī)模生產(chǎn)中,通過單藻絲分離可以選育出高生物量、高營養(yǎng)的優(yōu)良藻種,該方法操作簡便、易行,便于工作人員掌握,且對純化的藻絲體具有很強(qiáng)的針對性,這對于螺旋藻的生產(chǎn)實(shí)踐具有重大意義。

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Selection and breeding of fineSpirulinastrains of large-scale production

LI Zheng-juan,CHANG Rong,SHI Guang-bo,XU Qing-yan,ZHAO Xiao-rong,YAN Hui-xin,LI Bo-sheng*

(Beijing Forestry University,Department of Food Science and Engineering,College of Biological Sciences and Technology,Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Institute of Spirulina,Beijing 100083,China)

This study selectedSpirulinaplatensisas original strain,and two strains sina032 and sina029 with high yeild and quality were obtained by using the method of capillary suction micro separation to separate per algal filament and combining with UV-Vis spectral scan. Compared with the original strain,biomass of the two strains increased by 44.8% and 39.4% respectively.Content of their bioactivators(chlorophyll,phycocyanin,carotenoids,

Spirulinaplatensis;method of capillary suction micro separation;per algal filament;biomass;bioactivator

2016-01-06

李正娟(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：功能性食品及天然產(chǎn)物，E-mail:lzj028040@163.com。

李博生(1956-)，男，教授，研究方向：功能性食品及天然產(chǎn)物，E-mail:Libs7321@126.com。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201304605)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0210-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.034