生姜提取物對(duì)苯并芘染毒大鼠抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶活性的影響

李　鋒,劉振偉,李慶芝,李大鵬,唐曉珍,王永麗,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018;2.萊蕪市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東萊蕪 271100)

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生姜提取物對(duì)苯并芘染毒大鼠抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶活性的影響

李鋒1,劉振偉2,李慶芝2,李大鵬1,唐曉珍1,王永麗1,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018;2.萊蕪市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東萊蕪 271100)

探討生姜提取物對(duì)苯并芘染毒大鼠抗氧化酶及II相解毒酶的影響。用不同劑量的生姜提取物(100、200和400 mg/kg(bw)對(duì)Wistar大鼠連續(xù)灌胃14 d后,一次性腹腔注射20 mg/kg·bw的苯并芘染毒,檢測(cè)肝臟和腎臟中的抗氧化酶和II相解毒酶的活性。結(jié)果表明,三個(gè)劑量的生姜提取物灌胃處理對(duì)大鼠體重?zé)o顯著影響(p>0.05),同時(shí)對(duì)肝、肺和腎的臟體比也無(wú)顯著影響(p>0.05)。與苯并芘處理組相比,200和400 mg/kg·bw的生姜提取物能明顯提高肝臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活力,以及肝和腎中醌還原酶(NQO1)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的活力(p<0.05)。以上結(jié)果表明,生姜提取物能顯著提高大鼠肝臟中抗氧化酶及II相解毒酶的活性。

生姜提取物,苯并芘,抗氧化,解毒酶,大鼠

生姜(ZingiberofficinaleRosc.)是姜科姜屬草木植物,在熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛種植[1]。在東亞及東南亞國(guó)家,生姜是常用的調(diào)味料和傳統(tǒng)的中藥材[2]。我國(guó)生姜種質(zhì)資源豐富,栽培面積、產(chǎn)量及出產(chǎn)量均居世界首位[3]。生姜中富含姜辣素、姜油樹(shù)脂等活性成分,具有抗氧化、抗炎抑菌、解毒、止吐止泄等活性,保健和醫(yī)藥價(jià)值均較高[4-5]。

研究表明外源性親電子試劑及致癌物在體內(nèi)會(huì)造成氧化損傷,導(dǎo)致細(xì)胞膜、核酸和蛋白質(zhì)等正常的細(xì)胞成分受到損害,并最終導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[6-8]。在這些物質(zhì)的體內(nèi)代謝過(guò)程中,抗氧化酶和II相代謝酶構(gòu)成了機(jī)體重要的防御體系[9]。抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等,它們?cè)谇宄钚匝踝杂苫确矫姘l(fā)揮重要作用。II相解毒酶(如醌還原酶(NQO1)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)等)通過(guò)催化內(nèi)源性極性物質(zhì)以共價(jià)結(jié)合的形式與I相反應(yīng)的活化產(chǎn)物或外來(lái)物質(zhì)結(jié)合,從而改變其毒性[10]。通過(guò)誘導(dǎo)II相解毒酶,可以有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)外源性致癌物及親電子試劑的代謝解毒。前期研究表明,多種生姜成分具有很強(qiáng)的抗氧化及II相酶誘導(dǎo)能力。但這些研究大多集中在生姜成分的體外活性研究,如通過(guò)DPPH等自由基清除體系評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性[11],通過(guò)Hepa1c1c7等細(xì)胞模型研究其對(duì)醌還原酶的誘導(dǎo)能力[12]等。這些較強(qiáng)的體外作用能否在體內(nèi)重現(xiàn)尚缺少進(jìn)一步的證據(jù)來(lái)支持。而且,已有研究多采用單一的生姜化合物,而在實(shí)際飲食中生姜成分多以混合物的形式攝入。因此,本實(shí)驗(yàn)以生姜提取物為原料,建立苯并芘大鼠染毒模型,研究了生姜提取物灌胃處理對(duì)大鼠抗氧化酶和II相解毒酶活性的影響,以期為生姜功能食品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮的市售生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)購(gòu)自當(dāng)?shù)卮鬂?rùn)發(fā)超市;6周齡雄性SPF級(jí)Wistar大鼠50只購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(滬)2007-2005;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純;還原型輔酶II瑞士Roche公司,分析純;苯并(α)芘(≥96.0%)百靈威科技有限公司,分析純;黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)美國(guó)Sigma-Aldrich公司,分析純;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)試劑盒南京建成生物工程研究所。

TDL-50B低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);Beckman Coulter Avanti J-30I高效離心機(jī)美國(guó)Beckman Coulter公司;UV-5500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司;AL104電子天平梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司;SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1生姜提取物的制備[13]稱(chēng)取200 g左右樣品洗凈、去皮、涼干后,切成1～2 mm的薄片,采用無(wú)水乙醇按照料液比1∶6(m/v)于50 ℃恒溫水浴中提取4 h,過(guò)濾,濾液采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干,然后溶于100 mL水中,加入等體積的乙酸乙酯,萃取三次,合并乙酸乙酯層,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到生姜浸膏。經(jīng)測(cè)定,浸膏中總酚含量折算為沒(méi)食子酸等價(jià)物為46.1 mg/g(Folin-Ciocalteu試劑法[14]),姜辣素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.76%(香草醛比色法[15])。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組飼養(yǎng)室溫度控制在(22±1) ℃,每天保持12 h光暗交替。動(dòng)物適應(yīng)培養(yǎng)一周后,將體重相近的大鼠隨機(jī)分成五組:空白組、苯并芘致毒組(BαP組)、低劑量生姜提取物處理組(B+LG組)、中劑量生姜提取物處理組(B+MG組)和高劑量生姜提取物處理組(B+HG組)。每只大鼠單籠飼養(yǎng),自由采食和飲水。生姜提取物溶于蒸餾水中,每日上午9點(diǎn)分別灌胃0.2 mL的生理鹽水(空白組和BαP組)、100 mg/kg·bw生姜樣品(B+LG組)、200 mg/kg·bw生姜樣品(B+MG組)、400 mg/kg·bw生姜樣品(B+HG組),連續(xù)灌胃14 d。末次灌胃1 h后,苯并芘致毒組及生姜提取物處理組大鼠均腹腔注射20 mg/kg·bw的苯并芘(溶解到玉米油中),對(duì)照組注射同等體積的玉米油,然后禁食12 h,稱(chēng)取體重;處死動(dòng)物,摘取肝和腎臟。按如下公式,計(jì)算臟體比:

1.2.3抗氧化酶活性的測(cè)定取一定量的肝臟組織,按照重量體積比1∶9加入生理鹽水,于組織勻漿器中制成10%的勻漿液。取部分勻漿液,于3000 r/min離心10 min,取上清液,按照試劑盒方法測(cè)定肝臟中GPx、CAT和SOD酶活性[11]。

1.2.4臟器中II相解毒酶活性的測(cè)定取一定量的肝臟和腎臟置于冰冷的Tris-KCl緩沖液(pH7.6)中,在冰浴中制成10%的勻漿液。于4 ℃下20000×g離心20 min,取上清液,繼續(xù)100000×g離心60 min,取上清液,用于測(cè)定醌還原酶(NQO1)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SAS 8.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),p<0.05時(shí)表示均值間差異顯著,p<0.01時(shí)表示均值間差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1生姜提取物對(duì)大鼠體重及臟體比的影響

如圖1所示,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前各組大鼠體重?zé)o顯著差異。經(jīng)連續(xù)14 d灌胃后,空白組、BαP處理組及三個(gè)劑量的生姜提取物灌胃組之間,動(dòng)物的體重增加沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。表明在12 h之內(nèi),20 mg/kg·bw的BαP腹腔注射處理不會(huì)顯著影響大鼠的體重。據(jù)報(bào)道,BαP腹腔注射的半數(shù)致死劑量約為500 mg/kg·bw,而本實(shí)驗(yàn)中BαP的使用劑量為20 mg/kg·bw,遠(yuǎn)低于其半數(shù)致死劑量。經(jīng)過(guò)對(duì)各組動(dòng)物的肝臟和腎臟的臟體比分析,各處理組之間肝、腎器官的臟體比也不存在顯著性差異(p>0.05)。

圖1　生姜提取物處理組中大鼠的體重增加值Fig.1　Body weight gains of rats treated with different doses of ginger extracts

表1　生姜提取物對(duì)苯并芘染毒大鼠肝臟抗氧化酶活力的影響

注:與空白組相比,*p<0.05,**p<0.01;與BαP組相比,#p<0.05,##p<0.01。圖2、圖3同。

2.2生姜提取物對(duì)大鼠抗氧化酶活力的影響

如表1所示,空白組中大鼠肝臟SOD的活力為(64.8±3.0) U/mg·prot,BαP處理導(dǎo)致動(dòng)物肝臟SOD的活力顯著下降(p<0.05),為(55.2±3.5) U/mg·prot。在生姜提取物灌胃處理組中,肝臟SOD的活力分別為(56.7± 6.4) U/mg·prot(100 mg/kg·bw),(59.1± 1.7) U/mg·prot(200 mg/kg·bw)和(58.3± 4.9) U/mg·prot(400 mg/kg·bw),但與BαP處理組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

BαP組大鼠肝臟GPx酶活力為(387.6±28.6) U/mg·prot,與空白組相比(362.5±26.1) U/mg·prot無(wú)顯著差異(p>0.05)。經(jīng)過(guò)連續(xù)14 d不同劑量的生姜提取物灌胃處理后,與空白組相比,生姜提取物處理組中肝臟GPx活力均極顯著升高(p<0.01);同時(shí),與BαP組相比,200和400 mg/kg·bw的生姜提取物處理組中GPx活力顯著增加(p<0.05),100 mg/kg·bw的生姜提取物灌胃組無(wú)顯著變化(p>0.05)。對(duì)于CAT活性,BαP處理導(dǎo)致肝臟中CAT的活力由空白組中的(13.9±2.2) U/mg·prot顯著升高至(21.0±4.8) U/mg·prot(p<0.05)。生姜提取物灌胃處理后,肝臟中CAT酶的活力進(jìn)一步升高,與空白組相比差異極顯著(p<0.01)。與BαP組相比,100、200和400 mg/kg·bw生姜提取物處理組的活力分別提高了27%、60%和63%,其中200和400 mg/kg·bw劑量組與BαP組差異極顯著(p<0.01)。這些結(jié)果表明,200和400 mg/kg·bw生姜提取物處理能在一定程度上提高動(dòng)物肝臟的GPx和CAT活力,緩解BαP造成的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

2.3生姜提取物對(duì)大鼠臟器中II相解毒酶活力的影響

如圖2所示,與空白組相比,BαP處理顯著提高了動(dòng)物肝臟和腎臟中NQO1酶的活力(p<0.05)。與BαP組相比,不同劑量的生姜提取物灌胃處理對(duì)肝臟及腎臟中NQO1酶活力的影響顯著。在肝臟中,低、中、高劑量生姜提取物灌胃處理均可顯著高NQO1酶的活力,經(jīng)過(guò)14 d連續(xù)處理后,高劑量組酶活力最高,比BαP單獨(dú)處理組提高了94%。在腎臟中,所有處理組的NQO1酶活力均顯著高于空白組(p<0.05);與BαP組相比,中高劑量生姜提取物處理組腎臟中NQO1酶活力分別顯著提高了29%和50%(p<0.05)。以上結(jié)果表明,生姜提取物可顯著提高大鼠肝臟和腎臟中NQO1酶活力。

圖2　生姜提取物對(duì)大鼠臟器中NQO1活力的影響Fig.2　Effects of ginger extracts on quinonereductase activity in organs of rats

生姜提取物處理對(duì)大鼠臟器中GST酶活力的影響見(jiàn)圖3。與對(duì)照組相比,BαP刺激導(dǎo)致肝臟及腎臟中GST酶的活力顯著升高(p<0.05)。與BαP組相比,中高劑量的生姜提取物連續(xù)灌胃14 d,大鼠肝臟和腎臟中GST酶的活力顯著上升(p<0.05),但低劑量生姜提取物處理組與BαP組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)。這些結(jié)果表明,中高劑量的生姜提取物對(duì)肝臟和腎臟中GST酶的活力具有顯著的提升作用(p<0.05)。

圖3　生姜提取物對(duì)大鼠臟器中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.3　Effects of ginger extracts on glutathione-S transferase activity in organs of rats

3　討論

由于肝臟是BαP進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的重要器官,也是其毒性作用主要的靶器官[17],因此,我們首先研究了生姜提取物對(duì)苯并芘染毒大鼠肝臟內(nèi)抗氧化酶活力的影響。結(jié)果表明,用200和400 mg/kg·bw的生姜提取物連續(xù)灌胃14 d,能夠顯著改善BαP氧化損傷造成的肝臟GPx和CAT酶活力的下降。我們的研究結(jié)果與Kota等[18]的報(bào)道相一致,他們發(fā)現(xiàn)在飲食中添加5%的姜粉組與不添加的對(duì)照組相比,可以使大鼠肝臟中GPx的活性提高30%,SOD活性提高141%,CAT的活性提高94%。El-Sharaky等[19]也發(fā)現(xiàn)100 mg/kg·bw的生姜提取物能有效改善溴苯導(dǎo)致的大鼠肝臟中GPx和SOD酶活性的下降。Ahmed等[20]也發(fā)現(xiàn)用含1%生姜的飼料喂養(yǎng)大鼠,可以顯著抑制馬拉硫磷引起的大鼠抗氧化酶活性的下降,并且顯著提升大鼠血液中谷胱甘肽的含量,其作用效果與100 mg/kg·bw的抗壞血酸類(lèi)似。這些結(jié)果表明,在不同的外源性毒物導(dǎo)致的機(jī)體氧化應(yīng)激模型中,生姜提取物均表現(xiàn)出提高機(jī)體抗氧化酶活力的作用。

外源性毒物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化主要包括I相反應(yīng)和II相反應(yīng)。I相反應(yīng)往往會(huì)激活某些不具活性的致癌物前體,而II相反應(yīng)在II相解毒酶的催化下,可通結(jié)合反應(yīng)等使高活性的致癌物失活,起到真正解毒作用。因此,誘導(dǎo)II相解毒酶的表達(dá),可以有效促進(jìn)II相反應(yīng),保護(hù)機(jī)體免受毒性物質(zhì)和活性氧的侵害。其中,NQO1和GST酶是體內(nèi)主要的代表性II相解毒酶,NQO1可催化多種醌類(lèi)及其衍生物發(fā)生失去兩個(gè)電子的還原反應(yīng),從而保護(hù)細(xì)胞免受其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的反應(yīng)活性氧及親電子物質(zhì)的損傷[21]。GST酶催化GSH與多種致癌劑的親電中心結(jié)合,形成硫醚連接的谷胱甘肽結(jié)合物,改變其極性從而利于其排出體外[22]。很多研究證實(shí),具有癌癥化學(xué)預(yù)防作用的植物化學(xué)物質(zhì)大多具有較強(qiáng)的II相解毒酶誘導(dǎo)活性[23]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),與BαP處理組相比,中高劑量的生姜提取物處理組具有顯著提升大鼠肝臟和腎臟中的NQO1和GST酶活力的能力。本文的研究結(jié)果與Nirmala[24]等人的報(bào)道一致。目前,有關(guān)生姜提取物體內(nèi)誘導(dǎo)II相解毒酶作用的研究報(bào)道相對(duì)較少。但是體外細(xì)胞模型研究證實(shí)很多生姜成分具有較強(qiáng)的II相解毒酶誘導(dǎo)能力,如6-脫氫姜烯酚和1-脫氫-6-姜二酮等能顯著誘導(dǎo)鼠肝癌Hepa1c1c7細(xì)胞中NQO1的活性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)生姜提取物具有較強(qiáng)的體內(nèi)誘導(dǎo)II相解毒酶的能力,可能與這些成分的共同作用有關(guān)。

4　結(jié)論

用100、200和400 mg/kg·bw的生姜提取物對(duì)Wistar大鼠連續(xù)灌胃14 d,各處理組間動(dòng)物體重沒(méi)有顯著性差異,肝、肺和腎的臟體比也無(wú)顯著差異(p>0.05)。與BαP處理組相比,200和400 mg/kg·bw的生姜提取物能明顯提高肝臟中抗氧化酶GPx和CAT的活力(p<0.05),但對(duì)SOD酶影響不顯著;200和400 mg/kg·bw的生姜提取物對(duì)肝和腎中主要的II相解毒酶NQO1和GST的活力也具有顯著的提升作用(p<0.05)。以上結(jié)果表明,生姜提取物通過(guò)提高大鼠肝臟中主要抗氧化酶及II相解毒酶的活性,能夠提高機(jī)體的抗氧化能力和對(duì)苯并芘的代謝解毒作用。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于揭示生姜這一藥食兼用植物的保健作用提供了參考,同時(shí)也可為開(kāi)發(fā)高附加值的生姜功能食品及新型藥品提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of ginger extract on activities of antioxidant enzymes and phase II detoxifying enzymes in benzo(α)pyrene-treated rats

LI Feng1,LIU Zhen-wei2,LI Qing-zhi2,LI Da-peng1,TANG Xiao-zhen1,WANG Yong-li1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China;2.Laiwu Academy of Agricultural Science,Laiwu 271100,China)

The aim of this study was to investigate the effects of ginger extract on activities of antioxidant enzymes and phase II enzymes in benzo(α)pyrene(BαP)-treated rats. Wistar rats were fed by gavage with different doses of ginger extract 100,200 and 400 mg/kg·bw for 14 days. After 14 day of feeding,20 mg/kg·bw of BαP was intraperitoneally injected to the rats. Afterwards,the animals were sacrificed and their livers and kidneys were collected for analysis of antioxidant enzymes and phase II enzymes. Results showed that three doses of ginger extract did not significantly affect body weight of the rats(p>0.05),as well as the organs to body weight ratios(p>0.05). Compared with the BαP group,both 200 and 400 mg/kg·bw of ginger extract significantly elevated the activities of glutathione peroxidase(GPx)and catalase(CAT)in liver,as well as the activities of quinone reductase(NQO1)and glutathione S-transferase(GST)in liver and kidney(p<0.05). These results suggested that ginger extract could improve the activities of antioxidant enzymes and phase II enzymes in rats.

ginger extract;benzo(α)pyrene;antioxidant enzymes;detoxifying enzymes;rats

2015-10-26

李鋒(1983-)，男，博士，講師，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)化學(xué)，E-mail:lifeng0605@163.com。

王永麗(1982-)，女，博士，講師，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制，E-mail:lily8941@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201417)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2013M540561)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)12-0350-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.058