超聲-微波回流提取新疆管花肉蓯蓉苯乙醇苷的工藝研究

丁慧玲,許丹丹,金天佑，張紅玉，王　亮

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046)

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超聲-微波回流提取新疆管花肉蓯蓉苯乙醇苷的工藝研究

丁慧玲,許丹丹,金天佑，張紅玉，王亮*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046)

管花肉蓯蓉是新疆特有藥物資源。為了使其充分利用,在單因素研究基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波回流提取管花肉蓯蓉中苯乙醇苷工藝。結(jié)果表明:在超聲頻率40 kHz,超聲功率為50 W,提取時間15 min時由二次回歸模型獲得最優(yōu)工藝條件為提取丙酮體積分?jǐn)?shù)50%,液料比 14∶1(mL·g-1),微波功率100 W,理論得率為49.87%,驗證實驗得49.2%,與理論值接近。通過紅外光譜分析可知超聲-微波提取的是管花肉蓯蓉苯乙醇苷類物質(zhì)。

管花肉蓯蓉,苯乙醇苷,超聲-微波,提取,紅外光譜

管花肉蓯蓉(Cistanchetubulosa(Schenk)Wight)為列當(dāng)科肉蓯蓉屬,多年生寄生草本植物,別名南疆大蕓、管花大蕓、紅柳大蕓,莖入藥,有補精血、益腎壯陽、潤腸通便之效用,世人稱之為“沙漠人參”[1]。近年來國內(nèi)外很多學(xué)者、專家對其化學(xué)成分和藥理活性進行了研究,分離出了近百種化學(xué)成分,主要包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷、木脂素苷、單糖、雙糖、多糖、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、三萜、甾醇、多元醇等,其中苯乙醇苷類是肉蓯蓉屬植物的主要活性成分之一,也是中國藥典“肉蓯蓉”項下鑒別和含量測定的指標(biāo)性成分,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強記憶、助陽等作用[1-2]。因此,對管花肉蓯蓉苯乙醇苷類成分的提取研究和產(chǎn)品開發(fā)都有極重要的意義。

丙酮是非質(zhì)子性溶劑,極性大,溶解能力強,可以除去一些小分子糖和脂溶性雜質(zhì),在工業(yè)生產(chǎn)中由于它的沸點較低,后期有利于回收利用。

微波提取容易造成溶液受熱不均,而超聲波振動的空化效應(yīng)使得樣品介質(zhì)各點受熱一致,并不破壞物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu),超聲-微波協(xié)同萃取,發(fā)揮了兩者優(yōu)點的同時又補充了各自的不足,從而提高了活性物質(zhì)的提取得率、大大縮短提取時間、降低耗能,節(jié)約了成本,在做提取研究方面廣泛應(yīng)用。目前關(guān)于管花肉蓯蓉苯乙醇苷提取工藝研究,主要有水提法、乙醇浸提法、超聲波協(xié)助法、微波協(xié)助法、酶法輔助提取法等方法[3-7],而對于超聲-微波協(xié)助回流提取工藝的研究鮮有報道[8]。

本研究以管花肉蓯蓉為原料,前期的預(yù)實驗通過甲醇、乙醇、丙酮這三種溶劑進行提取,得到實驗結(jié)果是丙酮提取得率最高,因此選用丙酮為提取溶劑,采用Box-Behnken中心設(shè)計法對提取濃度、微波功率、提取液料比等關(guān)鍵因素進行優(yōu)化,建立并驗證相關(guān)的工藝數(shù)學(xué)模型,并對提取的苯乙醇苷進行了紅外光譜分析[9]。為更好地利用新疆名貴瀕危中藥肉蓯蓉資源提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

管花肉蓯蓉由新疆生命核力高科股份有限公司提供,粉碎過篩得到粒徑為80目的樣品置于燒杯中備用;松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)烏魯木齊格林金諾生物科技有限公司;丙酮、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH等其它試劑均為分析純,天津市富于精細(xì)化工有限公司。

HK-20B 1000 g搖擺式高速中藥粉碎機廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司;CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀(超聲波固定頻率40 kHz,功率50 W)上海新拓分析儀器科技有限公司;ME204E電子分析天平(0.0001 g)深圳市盛美儀器有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司;Z-326K臺式冷凍離心機靖江市新大機電設(shè)備制造有限公司;島津UV-2450PC紫外可見分光光度計上海勝斯貿(mào)易有限公司;冷凍干燥機寧波生化儀器有限公司;FTIR-7600型傅里葉變換紅外光譜儀天津港東科技發(fā)展股份有限公司;其他均為實驗室常用設(shè)備。

1.2實驗方法

1.2.1提取管花肉蓯蓉苯乙醇苷的工藝流程新疆管花肉蓯蓉→粉碎(過80目篩)→干燥→稱重→超聲-微波回流提取→抽濾,去上清液→3000 r/min離心10 min(取上清液)→減壓濃縮→冷凍干燥2 d→肉蓯蓉苯乙醇苷類物質(zhì)。

1.2.2測定管花肉蓯蓉苯乙醇苷含量

1.2.2.1繪制松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線精確稱取10 mg松果菊苷對照品溶解在50 mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。分別吸取以上溶液0、1、2、3、4、5 mL置于25 mL容量瓶中,采用比色法[10]測量吸光度,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0086x-0.0227,R2=0.9974。

1.2.2.2苯乙醇苷得率的計算每次取2 g管花肉蓯蓉進行提取,提取后的溶液在3000 r/min的離心機中離心15 min,取上清液在100 mL的容量瓶中定容,在容量瓶中取1 mL的溶液經(jīng)多次實驗稀釋300倍之后,按照1.2.2.1的方法測定吸光度,根據(jù)松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的回歸方程計算管花肉蓯蓉中苯乙醇苷含量,然后按以下公式計算出苯乙醇苷得率:苯乙醇苷得率(%)=算出的苯乙醇苷含量×稀釋倍數(shù)/管花肉蓯蓉粉的質(zhì)量×100

1.2.3超聲-微波回流萃取管花肉蓯蓉中苯乙醇苷

1.2.3.1單因素實驗以丙酮體積分?jǐn)?shù)(%)、微波功率(W)、液料比(mL/g)、提取時間(min)為考察因素,以肉蓯蓉中苯乙醇苷得率為指標(biāo),確定響應(yīng)面實驗因素水平。

a.丙酮體積分?jǐn)?shù):稱2 g管花肉蓯蓉粉,按1.2.1進行預(yù)處理后,固定微波功率80 W,液料比10∶1,提取時間10 min,分別在丙酮水溶液體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的條件下進行超聲-微波協(xié)同回流萃取。

b.微波功率:按最優(yōu)的丙酮體積分?jǐn)?shù),液料比10∶1,提取時間10 min不變,分別在提取微波功率為 20、40、60、80、100、120 W的條件下進行萃取。

c.液料比:按最優(yōu)的丙酮體積分?jǐn)?shù)、微波功率,提取時間10 min不變,分別在液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的條件下進行萃取。

d.提取時間:按最優(yōu)的丙酮體積分?jǐn)?shù)、微波功率、液料比,分別在提取時間為10、15、20、25、30 min的條件下進行萃取。

1.2.3.2響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理[11-15],以丙酮體積分?jǐn)?shù)、微波功率、液料比3個因素為自變量,管花肉蓯蓉苯乙醇苷的得率為響應(yīng)值,設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面實驗,實驗設(shè)計見表1。并平行三次進行驗證實驗。

表1　響應(yīng)面設(shè)計因素水平表

1.2.4紅外光譜分析管花肉蓯蓉苯乙醇肉蓯蓉苯乙醇苷冷凍干燥成干粉,采用KBr壓片法制樣,采用傅里葉紅外光譜進行紅外光譜掃描,分析數(shù)據(jù)。

1.2.5實驗數(shù)據(jù)分析方法使用Origin8.06、EXCEL進行圖表的繪制,Design-Expert8. 06軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)的處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果

圖1　丙酮體積分?jǐn)?shù)對得率的影響Fig.1　Effect of volume fraction of acetone on the yield

2.1.1丙酮體積分?jǐn)?shù)的影響如圖1所示,隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)的增加,苯乙醇苷得率提高,當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時得率最大,這是因為苯乙醇苷類物質(zhì)是極性化合物,易溶于極性溶劑。隨著體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大,得率明顯下降,這是由于大多數(shù)植物中的活性成分能在丙酮中溶解,使其與水溶性物質(zhì)分離,因此一部分苯乙醇苷水溶性成分難以溶解。因此,實驗選擇丙酮體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.1.2微波功率的影響如圖2所示,苯乙醇苷得率隨微波功率增加而提高,當(dāng)達(dá)到100 W時得率達(dá)到最大,之后隨著功率增加而下降。這是由于超聲-微波對肉蓯蓉細(xì)胞壁的破碎作用隨著功率的增加而逐漸增強,從而有利于苯乙醇苷類成分溶出,但當(dāng)達(dá)100 W左右后,提取液溫度較高,使得部分苯乙醇苷結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而降低得率,因此實驗中選取100 W。

圖2　微波功率對得率的影響Fig.2　Effect of microwave power on the yield

2.1.3液料比的影響如圖3所示,隨著液料比的增加,苯乙醇苷得率顯著提高,在液料比達(dá)到15∶1時達(dá)到最大,之后隨著溶劑用量的增加得率下降。這可能是由于液料比達(dá)到15∶1時,肉蓯蓉中的苯乙醇苷幾乎已經(jīng)被萃取完全。另外,進一步加大溶劑用量,會增加后續(xù)濃縮工藝,進而得率損失加大,成本增加,因此實驗選用液料比15∶1。

圖3　液料比對得率的影響Fig.3　Effect of liquid-solid ratio on the yield

2.1.4提取時間的影響如圖4所示,隨時間的增加,苯乙醇苷得率提高,在15 min時得率達(dá)到最大,之后隨著時間的增加得率先下降后保持不變,可能是因為作用時間延長使得提取液溫度較高,破壞了苯乙醇苷的結(jié)構(gòu)。為盡量降低高溫對苯乙醇苷的造成破壞的可能性,盡量選擇較短時間的處理。因此,實驗選擇提取時間15 min。

圖4　提取時間對得率的影響Fig.4　Effect of extraction times on the yield

2.2響應(yīng)面優(yōu)化實驗

依據(jù)軟件Box-Behnken中心組合原理進行實驗,結(jié)果見表2。處理表2的實驗數(shù)據(jù),得到回歸模型方差分析表3,采用Design Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合分析,得到以苯乙醇苷得率(Y)為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程:Y=49.78+0.49A+0.24B-0.48C-0.6AB-0.27AC-0.72BC-1.32A2-3.62B2-1.74C2

表2　響應(yīng)面法實驗設(shè)計及結(jié)果

表3　回歸模型方差分析表

注:**表示極顯著(p<0.01);*表示顯著(0.01

各因素的影響程度分析,各因素的F值可以反映出各因素對實驗指標(biāo)的重要性,F值越大,表明對實驗指標(biāo)的影響越大,即重要性越大。從方差分析表可知:FA=27.13,FB=6.44,FC=25.76,即各因素對苯乙醇苷得率的影響程度大小順序為:丙酮體積分?jǐn)?shù)>液料比>微波功率。

根據(jù)回歸方程,做出響應(yīng)面分析圖(圖5～圖7),考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀,分析丙酮體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率對管花肉蓯蓉苯乙醇苷得率的影響。

2.3雙因素交互分析

由圖5可知,AB交互影響極顯著,隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)和微波功率的增加苯乙醇苷得率也迅速增大。將微波功率固定在0水平時,隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)的增加,苯乙醇苷得率呈緩慢上升趨勢;增大微波功率,苯乙醇苷得率呈上升趨勢,且趨勢明顯,并且在丙酮體積分?jǐn)?shù)為50%,微波功率為100 W時,苯乙醇苷得率達(dá)到最大值。

圖5　丙酮體積分?jǐn)?shù)與微波功率交互的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface of the interaction between acetone concentration and microwave power

圖6可知,AC的交互影響不顯著,隨著料液比的變化,苯乙醇苷得率有較小的上升趨勢,料液比一定,苯乙醇苷得率隨提取體積分?jǐn)?shù)的增大而相應(yīng)增大;丙酮體積分?jǐn)?shù)固定時,苯乙醇苷得率受液料比的影響較小。

圖6　丙酮體積分?jǐn)?shù)與液料比交互的響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface of the interaction between acetone concentration and liquid feed ratio

圖7　微波功率與液料比交互的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface of the interaction between microwave power and liquid feed ratio

圖7可知,BC的交互影響極顯著,微波功率固定時,苯乙醇苷得率受液料比影響較大,隨著液料比的增大呈先增后降的趨勢?；貧w分析結(jié)果與3個因素對響應(yīng)值的影響以及各因素之間的交互影響相吻合?？梢钥闯鲈陧憫?yīng)面的最高點和等高線所選的范圍內(nèi)存在極值。通過分析得到苯乙醇苷最佳超聲-微波提取工藝條件為:提取濃度50.97%,液料比14.2∶1(mL·g-1),微波功率100.3 W,理論最佳得率為49.87%。根據(jù)實際情況按照提取體積分?jǐn)?shù)50%,液料比14∶1(mL/g),微波功率100 W,進行3次平行驗證實驗,得到肉蓯蓉苯乙醇苷的得率為49.2%,與理論值較為接近,有很好的擬合性。實驗結(jié)果充分驗證了所建模型的正確性,說明響應(yīng)面法適用于超聲-微波提取管花肉蓯蓉苯乙醇苷工藝條件的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。而前期實驗采用丙酮回流提取管花肉蓯蓉苯乙醇苷,丙酮體積分?jǐn)?shù)一般要在70%以上,提取液料比為20∶1,提取時間為1.5 h以上,得率最高為39.8%,與之相比較,超聲-微波輔助提取時間縮短80%以上,提取液料比降低,大大提高了提取效率。

2.4管花肉蓯蓉苯乙醇苷紅外光譜分析

圖8為管花肉蓯蓉苯乙醇苷類物質(zhì)的紅外圖譜,與苯環(huán)相連的C=O伸縮振動峰是1697.91 cm-1;在1603.91 cm-1有強度中等的吸收峰,這是苯乙醇苷類成分中的共軛C=O的特征吸收峰;1447.73和1380.81 cm-1附近的C-H的彎曲振動,說明管花肉蓯蓉的化合物成分含有較多飽和烷基;管花肉蓯蓉苯乙醇苷類物質(zhì)的最高峰是1042.49 cm-1處尖銳的單峰,此外在1519.26,1271.62,1161.29 cm-1也都有不同程度的吸收,這些吸收峰均可作為管花肉蓯蓉苯乙醇苷的鑒別特征峰。這一結(jié)果與徐榮等[16-18]紅外光譜法用于肉蓯蓉屬中藥鑒別研究結(jié)果相一致,因此,紅外光譜分析結(jié)果表明通過超聲-微波回流提取分離的物質(zhì)為管花肉蓯蓉苯乙醇苷類物質(zhì)。

圖8　管花肉蓯蓉苯乙醇苷類物質(zhì)的圖譜Fig.8　Infrared spectrum of phenylethanoid glycosides extracted from Cistanche tubulosa

3　結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波回流輔助提取新疆管花肉蓯蓉苯乙醇苷的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為:在超聲頻率40 kHz,超聲功率50 W,提取時間15 min,丙酮提取濃度50%,液料比14∶1(mL/g),微波功率100 W,驗證值為49.2%,與理論值49.87%接近。與丙酮回流提取比較,超聲-微波輔助回流提取時間縮短80%以上,提取的液料比大大降低,提取效率得到提高。同時,紅外光譜分析圖可得超聲-微波輔助回流提取分離的物質(zhì)為管花肉蓯蓉苯乙醇苷物質(zhì)。為進一步的開發(fā)中藥材管花肉蓯蓉提供理論依據(jù)。

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Ultrasonic microwave extraction technology of Xinjiang phenylethanoid glycosides fromCistanchetubulosa

DING Hui-ling,XU Dan-dan,JIN Tian-you,ZHANG Hong-yu,WANG Liang*

(The College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

Cistanchetubulosais endemic to Xinjiang.In order to make full use of its resources,on the basis of single factor tests，the ultrasonic microwave extraction technology of phenylethanoid glycosides fromCistanchetubulosawas studied through the response surface optimization method. And the characteristics was analyzed by the fourier infrared spectrum. The results showed that the ultrasonic frequency 40 kHz,the ultrasonic power was 50 W,the extraction time was 15 min. The optimum extraction conditions by quadratic regression model were as follows extraction concentration 50%,ratio of liquid-solid 14∶1(mL·g-1),extraction microwave power 100 W. The theoretical value of phenylethanoid glycosides yield was 49.87%,under this condition the verification value was 49.2%,which was closed to the theoretical value.Infrared spectrum analysis results showed that ultrasonic microwave extraction wasCistanchetubulosaphenylethanoid glycosides compounds.

Cistanchetubulosa;phenylethanoid glycosides;ultrasonic microwave;extraction;infrared spectrum

2015-11-24

丁慧玲(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:m18709919028_1@163.com。

王亮(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品工程，E-mail：Wang-liang77@hotmail.com。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0301-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.048