蜂膠黃酮的超聲波提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

曾林暉,鄧澤元,余修亮,李紅艷

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

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蜂膠黃酮的超聲波提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

曾林暉,鄧澤元,余修亮,李紅艷*

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

在選擇超聲波頻率的基礎(chǔ)上,分別研究了提取時(shí)間、超聲波功率、超聲波占空比和液面高度對蜂膠總黃酮提取得率的影響。再采用響應(yīng)面法,對超聲波輔助提取蜂膠黃酮的工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。并對超聲波提取的蜂膠黃酮進(jìn)行抗氧化活性的研究。結(jié)果表明,20 kHz聚能超聲波對蜂膠黃酮的提取效果最好。其它因素對蜂膠總黃酮得率的影響大小順序?yàn)?超聲波占空比>液面高度>提取時(shí)間>超聲波功率;得到最佳的超聲波提取工藝參數(shù)為:提取時(shí)間18 min,超聲功率100 W,占空比75%,液面高度4 cm,蜂膠黃酮得率達(dá)到(39.06±0.48) mg/g。此方法提取出的蜂膠黃酮有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力。

超聲波,蜂膠,黃酮,響應(yīng)面法,抗氧化

蜂膠是由蜜蜂(Apismellifera)采集膠源植物的幼芽、樹皮等部位分泌的樹脂,再混合蜜蜂上顎腺和蠟腺等腺體分泌物及少量花粉混合而成的,是一種具有芳香性氣味的膠狀物質(zhì)[1]。蜂膠的主要成分為樹脂(55%),蜂蠟(30%),芳香揮發(fā)油(10%),花粉(5%)等。目前蜂膠中被鑒定的物質(zhì)已達(dá)300余種,主要有酚酸及其酯類、黃酮類、萜烯類、芳香類、脂肪酸等[2]。蜂膠具有廣譜的抗菌活性,對大多數(shù)病原菌和病毒都有抵抗作用,并能提高人體免疫力,有“紫色黃金”和“黃酮類化合物的寶庫”的美譽(yù)[3]。同時(shí),蜂膠還具有抗氧化、抗增殖、抗炎和降脂降糖等作用[4-5],因此被廣泛地應(yīng)用于食品、藥品以及化妝品等領(lǐng)域[6]。蜂膠近年來成為保健食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),對蜂膠中黃酮類化合物的提取研究也具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前,常采用乙醇冷浸泡或加熱回流提取蜂膠中功能性成分,但這些方法存在耗時(shí)長、溶劑使用量大等缺點(diǎn)。同時(shí),過高的提取溫度可能破壞蜂膠中功能性物質(zhì)。超聲波在液體介質(zhì)中能產(chǎn)生空化效應(yīng),有效破壞包埋結(jié)構(gòu)的外層,加速內(nèi)容物的溶出,從而提高提取效率。以往對超聲波提取工藝的優(yōu)化,往往會(huì)忽略超聲波頻率、周期、液面高度的研究,而這些參數(shù)的變化會(huì)直接影響超聲的提取效果。本文以蜂膠為原料,采用超聲波提取蜂膠中的黃酮類物質(zhì),先對超聲波的頻率進(jìn)行選擇,然后采用響應(yīng)面分析法對蜂膠黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得蜂膠黃酮的最佳提取工藝參數(shù),并對提取的蜂膠黃酮進(jìn)行抗氧化活性的研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蜂膠(Apismellifera)南昌同心紫巢生物工程有限公司提供;蘆丁(生化試劑,含量≥95.0%)、DPPH阿拉丁化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);FRAP試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;Al(NO3)3、KAc、無水乙醇均為市售分析純。

SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵上海亞榮生化儀器廠;FA2204B電子天平上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(20 kHz,GA92-ⅡDA)、超聲波清洗機(jī)(28、40、68 kHz,GA-5200D)無錫上佳生物科技有限公司;722 G型可見分光光度計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;ELx800 光吸收酶標(biāo)儀美國伯騰儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蜂膠預(yù)處理 蜂膠經(jīng)篩選去雜后置于-18 ℃下冷凍12 h,在低溫干燥狀態(tài)下取樣,快速粉碎,過200目篩,收集粉末,密封,于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2蜂膠總黃酮提取精密稱取2.5 g蜂膠粉末,加入80%乙醇溶液75 mL,按照設(shè)定的條件進(jìn)行超聲波輔助提取,提取液經(jīng)過抽濾后,濾液用乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中,待測。

1.2.3總黃酮含量的測定按照GBT 24283-2006標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。

1.2.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用無水乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中。此溶液中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.2 mg/mL。精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL,分別置于25 mL容量瓶中,加95%的乙醇至體積7.5 mL,依次加10% Al(NO3)3溶液0.5 mL、9.8% KAc溶液0.5 mL,搖勻,加蒸餾水定容至刻度。靜置1 h后,以30%乙醇溶液為空白對照,用1 cm比色皿于415 nm處測定吸光度。以25 mL容量瓶中蘆丁含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=1.182x-0.0202,R2=0.9997。

1.2.3.2黃酮得率的計(jì)算精密吸取蜂膠提取液0.5 mL于25 mL容量瓶中,按上述方法測定樣品中總黃酮含量。按照以下公式計(jì)算得率:

式中:X-由回歸方程計(jì)算出蜂膠黃酮的濃度(mg/mL);N-稀釋倍數(shù);V-提取液體積(mL);M-稱取的蜂膠質(zhì)量(g)。

1.2.4蜂膠總黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn)分別考察超聲波頻率、提取時(shí)間、功率、超聲波周期(占空比)、液面高度對提取率的影響,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4.1超聲波頻率和提取時(shí)間在乙醇濃度80%、料液比1∶30、功率300 W的條件下,分別考察頻率為20、28、40、68 kHz的超聲波提取率隨時(shí)間的變化,并進(jìn)行無超聲波提取實(shí)驗(yàn)做為對照組。其中28、40、68 kHz為發(fā)散型超聲波;20 kHz為聚能型超聲波,實(shí)驗(yàn)時(shí)其占空比設(shè)定為50%(超聲2 s/間隔2 s)、液面高度為3 cm。

1.2.4.2超聲波功率在頻率20 kHz、占空比50%(聚能時(shí)間2 s)、乙醇濃度80%、料液比1∶30、提取時(shí)間20 min、液面高度3 cm的條件下,分別考察功率50、100、200、300、400 W對蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.4.3超聲波占空比在頻率20 kHz、聚能時(shí)間2 s、乙醇濃度80%、料液比1∶30、提取時(shí)間20 min、功率300 W、液面高度3 cm的條件下,分別考察占空比20%、33.3%、50%、66.7%、80%對蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.4.4液面高度液面高度是超聲探頭末端到容器底部的距離。在頻率20 kHz、占空比50%(聚能時(shí)間2 s)、乙醇濃度80%、料液比1∶30、提取時(shí)間20 min、超聲功率300 W的條件下,分別考察液面高度1、3、5、7、9 cm對蜂膠黃酮提取率的影響。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以提取時(shí)間(A)、超聲功率(B)、占空比(C)、液面高度(D)為響應(yīng)因素,編碼水平為-1、0、1,蜂膠黃酮提取率(Y)為響應(yīng)值,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.6抗氧化活性的研究

1.2.6.1DPPH自由基清除率的測定[7]分別檢測5、10、15、20、25、30 μg/mL總黃酮濃度的蜂膠黃酮提取液對0.2 mmol/L DPPH溶液的自由基清除率。以Trolox(5、10、15、20、25、30 μg/mL)作為陽性對照。分別確定達(dá)到同一自由基清除率時(shí)Trolox和蜂膠黃酮的濃度,濃度越低表明其清除自由基的能力越強(qiáng),即其抗氧化能力越強(qiáng)。

準(zhǔn)確吸取100 μL的蜂膠黃酮提取液,加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,37 ℃避光靜置30 min,以甲醇為空白,用酶標(biāo)儀測定吸光值A(chǔ)517。按下列公式計(jì)算自由基清除率,以清除率為縱坐標(biāo),蜂膠黃酮濃度為橫坐標(biāo),Trolox作為陽性對照:

式中:A樣品為樣品吸光值;A空白為空白液吸光值。

1.2.6.2FRAP抗氧化能力的測定[8]分別檢測50、75、125、250、400、500 μg/mL的Trolox以及50、75、125、250、400、500 μg/mL的蜂膠黃酮提取液在593 nm處的吸光值,并繪制對照品Trolox和蜂膠黃酮的還原力曲線。當(dāng)達(dá)到同一吸光值時(shí)所需的樣品濃度越小,表示還原力越強(qiáng),即抗氧化能力越強(qiáng)。

準(zhǔn)確吸取180 μL的FRAP工作液,加入5 μL的蜂膠黃酮提取液,37 ℃孵育3 min后,用酶標(biāo)儀測定吸光值A(chǔ)593。以A593為縱坐標(biāo),蜂膠黃酮濃度為橫坐標(biāo)作圖。Trolox為陽性對照。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,通過運(yùn)用Excel、OriginPro 9.0 數(shù)據(jù)處理軟件和Design-Expert 8.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1超聲波頻率和超聲時(shí)間由圖1可知,隨提取時(shí)間的增加,四種不同頻率超聲波的蜂膠黃酮提取率在短時(shí)間內(nèi)都快速提高,而后趨于穩(wěn)定,提取速率顯著高于浸泡組。發(fā)散超聲波呈現(xiàn)出提取率隨頻率降低而升高的趨勢,這可能是由于超聲波的頻率越低,空化作用越強(qiáng),溶劑分子和物料表面的相互作用越劇烈,加快了溶劑分子擴(kuò)散到物料內(nèi)部的速率,從而加速黃酮類物質(zhì)的溶出[9-10]。聚能超聲波比發(fā)散超聲波具有更快的提取速率和更高的提取率。發(fā)散超聲波在30 min時(shí)達(dá)到最高提取率,而聚能超聲波在15 min時(shí)就具有較好提取效果。Zhongli Pan[11]等比較了頻率為20 kHz的聚能超聲波和發(fā)散超聲波對石榴皮中抗氧化物質(zhì)的影響,結(jié)果表明兩種超聲波都具有較好的提取效果,但是聚能超聲波消耗更低的能量。因此,從提取率和節(jié)約能源方面考慮,選定20 kHz的聚能超聲波進(jìn)行提取,選擇15 min超聲時(shí)間為最佳提取時(shí)間。

圖1　超聲波頻率和提取時(shí)間對黃酮提取率的影響Fig.1　Effect of ultrasound frequency and extraction time on flavonoid extraction yield

2.1.2超聲波功率由圖2可知,隨超聲波功率的增加,黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在200 W時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于當(dāng)超聲功率在0～200 W范圍內(nèi)時(shí),空化泡的形成隨功率的升高而變得更容易,并且空化泡的崩解也隨功率的升高而變得更加劇烈;當(dāng)功率超過200 W后,空化泡增長的過大,以至于不能崩解或者很脆弱的崩解,大大降低了空化作用的效果,并且過多的空化泡也會(huì)阻礙超聲波的傳播[12]。此外,當(dāng)超聲波的功率處于較高的水平時(shí),其熱效應(yīng)也非常顯著,使得反應(yīng)體系的溫度急劇升高,將加速溶劑乙醇的揮發(fā),降低了提取效果[13]。因此,選定超聲波功率為200 W。

圖2　超聲波功率對黃酮提取率的影響Fig.2　Effect of ultrasound power on flavonoid extraction yield

2.1.3超聲波占空比由圖3可知,隨占空比不斷提高,蜂膠黃酮提取率呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢,在占空比為66.67%時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)占空比在20%～66.67%范圍內(nèi)增加時(shí),累積超聲時(shí)間不斷增加,提取率不斷升高。當(dāng)占空比高于66.67%時(shí),由于超聲波的持續(xù)作用,熱效應(yīng)開始凸顯,導(dǎo)致溶液溫度不斷升高,乙醇迅速揮發(fā),因而降低了提取效果。Herrera[14]等用超聲波來提取樹莓中的酚類化合物時(shí)也發(fā)現(xiàn)占空比對結(jié)果具有顯著的影響。所以,選擇66.67%為最優(yōu)占空比。

圖3　超聲波占空比對黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasound duty cycle on flavonoid extraction yield

圖4　液面高度對黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of liquid height on flavonoid extraction yield

2.1.4液面高度由圖4可見,提取率隨液面高度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在液面高度為3 cm時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)液面高度在1～3 cm范圍內(nèi)增加時(shí),超聲波變幅桿在溶液中的輻射面積不斷增加,空化作用不斷增強(qiáng),使得提取率不斷升高;當(dāng)液面高度超過3 cm時(shí),提取率隨液面高度的升高而顯著降低,可能的原因是隨著液面高度的增加,輻射面不斷增大,超聲波慢慢的被吸收和消散,這將導(dǎo)致空化作用的強(qiáng)度降低[15]。因此,選定超聲波的最佳液面高度為3 cm。

表2　Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3　回歸模型的方差分析

2.2響應(yīng)面分析

2.2.1響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案選取超聲時(shí)間(A),超聲功率(B),占空比(C),液面高度(D)四個(gè)因素作為自變量,以蜂膠黃酮提取率作為響應(yīng)值。Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

2.2.2方差分析及顯著性檢驗(yàn)用軟件Design-Expert.8.05對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,分析結(jié)果如表3所示。對各因素進(jìn)行回歸擬合,得到回歸方程:

圖5　超聲提取時(shí)間(A),超聲功率(B),占空比(C),液面高度(D)對蜂膠黃酮提取率的影響Fig.5　Effect of ultrasound extraction time(A),ultrasound power(B),duty cycle(C),liquid height(D)on extraction yield of flavonoids

蜂膠黃酮提取率(mg/g)=+38.57+0.35A-0.057B+0.39C+0.38D-0.18AB+0.25AC+0.19AD-0.53BC-0.02BD+0.57CD-0.78A2-0.31B2-0.76C2-1.15D2

圖5是各因素間交互作用的響應(yīng)曲面3D分析圖,等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱,等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則表示不顯著,同時(shí)有閉合的圓或橢圓表示有最大值。

2.2.3最優(yōu)工藝條件的確定與模型驗(yàn)證通過Design-Expert.8.05軟件對回歸方程進(jìn)行計(jì)算,得到超聲波輔助提取蜂膠黃酮最佳工藝條件,即采用頻率20 kHz的聚能超聲波,在提取時(shí)間為17.60 min,超聲功率103 W,占空比76.84%,液面高度3.84 cm的條件下,得到最高的黃酮得率為38.94 mg/g?？紤]到實(shí)際條件的可操作性,將最佳工藝條件調(diào)整為:超聲提取時(shí)間18 min,超聲功率100 W,占空比75%,液面高度4 cm。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性,采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到蜂膠黃酮的實(shí)際得率為(39.06±0.48)mg/g。說明所得回歸方程對蜂膠黃酮提取率進(jìn)行分析和預(yù)測非常可靠,具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

2.2.4蜂膠黃酮抗氧化活性測定

圖6　Trolox和蜂膠黃酮對DPPH·的清除能力Fig.6　DPPH· radical scavenging activity of Trolox and propolis flavonoids

2.2.4.1DPPH·清除能力測定由圖6可知,一定濃度范圍內(nèi),DPPH·的清除率隨蜂膠黃酮和Trolox濃度的增加而增大,呈現(xiàn)一定的量效依賴關(guān)系。在相同濃度下,Trolox比蜂膠黃酮的清除率要強(qiáng)。當(dāng)清除率達(dá)到60%時(shí),所需的Trolox和蜂膠黃酮的濃度分別為18和21 μg/mL。由此可知,蜂膠黃酮具備一定的DPPH·清除能力,但稍弱于Trolox。

2.2.4.2FRAP抗氧化能力測定由圖7可知,一定濃度范圍內(nèi),Trolox和蜂膠黃酮的總抗氧化能力隨濃度的增加而增大,呈現(xiàn)一定的量效依賴關(guān)系。在相同濃度下,Trolox比蜂膠黃酮的清除率要強(qiáng)。當(dāng)吸光值達(dá)到0.6時(shí),所需的Trolox和蜂膠黃酮的濃度分別為250和330 μg/mL,可見蜂膠黃酮具有較強(qiáng)的FRAP抗氧化能力,但弱于Trolox。

圖7　Trolox和蜂膠黃酮總抗氧化能力測定Fig.7　Total antioxidant activity of Trolox and propolis flavonoids

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對超聲波輔助提取蜂膠黃酮過程中的不同工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。選定了合適的超聲波頻率,通過響應(yīng)曲面法建立了超聲波輔助提取蜂膠黃酮的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,得到了超聲波提取蜂膠黃酮的最佳工藝,并進(jìn)行蜂膠黃酮抗氧化活性的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,超聲提取時(shí)間、超聲波功率、超聲波占空比和液面高度對蜂膠黃酮提取率影響的大小關(guān)系是:占空比>液面高度>超聲提取時(shí)間>超聲功率。優(yōu)化出的超聲波輔助提取蜂膠黃酮的最佳工藝條件為:超聲波頻率為20 kHz,超聲提取時(shí)間18 min,超聲功率100 W,占空比75%,液面高度4 cm,此條件下蜂膠黃酮的實(shí)際得率為(39.06±0.48)mg/g。超聲波提取得到的蜂膠黃酮具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力,是一種天然的抗氧化資源。

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權(quán)威·核心·領(lǐng)先·實(shí)用·全面

Optimization of the ultrasound-assisted extraction of flavonoids from propolis and its antioxidant activity

ZENG Lin-hui,DENG Ze-yuan,YU Xiu-liang,LI Hong-yan*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The flavonoids of propolis were extracted by ultrasound assisted method,the extracted conditions were optimized by response surface methodology,and the antioxidant activities of flavonoids extracted by pulsed ultrasound were analyzed by DPPH and FRAP assay. First,the optimal frequency of ultrasound was selected. On the basis of single variable experiment,the extracted conditions of flavonoids in propolis were optimized by 4-variable,3-level Box-Behnken experimental design. The optimized ultrasound frequency was 20 kHz,the order of other factors affecting the total flavonoid content was the duty cycle>liquid height>extraction time>the power of ultrasound. The optimized parameters were as follows:extraction time 18 min,the power of ultrasound 100 W,duty cycle 75% and liquid height 4 cm. The extraction yield of flavonoids were(39.06±0.48)mg/g. At these conditions,the flavonoids extracted by pulsed ultrasound assisted method showed great DPPH and FRAP antioxidant activities.

ultrasound;propolis;flavonoids;response surface methodology;antioxidant activity

2015-11-24

曾林暉(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail:linhuizeng1990@aliyun.com。

李紅艷(1986-)，女，博士，副教授，研究方向：抗氧化、食品營養(yǎng)、食品化學(xué)，E-mail:lihongyan@ncu.edu.cn。

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青年研究基金項(xiàng)目資助(SKLF-QN-201506)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0295-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.047