內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌的鑒定與耐藥性分析

呂耀龍,李少英,包丹丹,趙春杰

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014109;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

?

內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌的鑒定與耐藥性分析

呂耀龍1,李少英2,*,包丹丹1,趙春杰1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014109;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

本研究以內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中分離的16株乳酸菌為研究對(duì)象,采用形態(tài)觀察、生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)和16S rRNA鑒定,并用紙片擴(kuò)散法對(duì)阿莫西林、氨芐西林和紅霉素三種抗生素進(jìn)行了耐藥測(cè)定。結(jié)果顯示,除DM8為乳酸乳球菌、DM21為約氏乳桿菌外,其余均為植物乳桿菌;供試菌株對(duì)阿莫西林的耐藥率為12.5%,對(duì)氨芐西林和紅霉素表現(xiàn)為敏感。經(jīng)分析,敏感菌株不完全是安全菌株。

乳酸菌,鑒定,耐藥性,分析

內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中含有多種乳酸菌,這些菌種多被應(yīng)用于食品業(yè)、飼料業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域。乳酸菌有著較長(zhǎng)的安全使用歷史,人們普遍認(rèn)為發(fā)酵產(chǎn)品中所用的乳酸菌都是安全(GRAS)菌株,并與人及動(dòng)物腸道固有微生物群落存在著相互的益生作用,對(duì)人和動(dòng)物的健康有益[1]。近年來研究表明,抗生素在醫(yī)藥、飼料等行業(yè)得到了廣泛甚至泛濫應(yīng)用,致使微生物耐藥問題日趨嚴(yán)重,使人們?cè)趹?yīng)對(duì)微生物性疾病時(shí)將面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)[2]。有研究表明,臨床分離的細(xì)菌中有近50%～70%的乳酸菌對(duì)青霉素類藥物表現(xiàn)出耐藥性[3-4]。

阿莫西林、氨芐西林和紅霉素三種抗菌藥物,是臨床治療中感染性疾病應(yīng)用較多的藥物。乳酸菌對(duì)三種抗菌藥物表現(xiàn)為較低的耐藥率,但也存在一定的差異性[3-8]。在不明確菌株耐藥程度的情況下盲目研究機(jī)理及防控乃至用于生產(chǎn)實(shí)踐,將造成后續(xù)工作的不確定性、甚至影響人們的健康。本文旨在研究?jī)?nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林和紅霉素三種抗菌藥物的耐藥性,為進(jìn)一步研究耐藥機(jī)理和選育乳酸菌提供方向,為乳酸菌的安全使用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

表1　紙片法使用的抗菌藥物及藥物敏感型標(biāo)準(zhǔn)

注:S(susceptible)為敏感;R(resistant)為耐藥;I(intermediate)為中度敏感。

實(shí)驗(yàn)菌株來自內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中分離純化保存的菌種,共16株,分別為:DM1、DM2、DM3、DM4、DM6、DM8、DM9、DM10、DM11、DM13、DM14、DM15、DM17、DM18、DM19、DM21;質(zhì)控菌株:大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC:25922)標(biāo)號(hào)DC購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;瓊脂糖Sigma公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒天根生化科技(北京)有限公司;2×Easy Tap PCR Supermix、DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer北京全式金生物技術(shù)有限公司;核酸染料北京賽百盛生物工程公司;16S rRNA序列引物:上游:5′-tgtcgtgagatgttgggttaag-3′,下游:5′-actagcgattccgacttcatgt-3′中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司,查閱文獻(xiàn)[3]而定;阿莫西林(HTWS-C054,10 μg/片)、氨芐西林(C002,10 μg/片)、紅霉素(C023,15 μg/片)杭州天和微生物試劑有限公司;TPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[9]進(jìn)行配制。

熒光分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;超凈臺(tái)哈爾濱市東聯(lián)公司;離心機(jī)Eppendorf公司;PCR擴(kuò)增儀BIO-RAD公司;電泳儀北京市六一儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化按照文獻(xiàn)[10]中方法進(jìn)行。

1.2.2供試菌液制備按照文獻(xiàn)[3]中方法進(jìn)行。

1.2.3供試菌株的形態(tài)及生物學(xué)特性細(xì)菌鏡檢觀察、革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。

1.2.4供試菌株16S rRNA鑒定

1.2.4.1供試菌株DNA提取具體操作步驟按照DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.2.4.2供試菌株DNA驗(yàn)證0.5 μL的6×Loading buffer與5 μL提取后供試菌株的DNA混勻,點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),觀察條帶。電泳參數(shù):電泳液為1×TBE buffer,時(shí)間為30 min,電壓為110 V。

1.2.4.3PCR擴(kuò)增16S rRNA PCR擴(kuò)增的引物通過查閱文獻(xiàn)[3]而定,擴(kuò)增片段長(zhǎng)為275 bp,由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成。

擴(kuò)增體系為50 μL:模板DNA(4 μL)、上游引物(1 μL)、下游引物(1 μL)、2×Easy Tap PCR Supermix(25 μL)、ddH2O(19 μL)。PCR循環(huán)參數(shù)[5],預(yù)變性:94 ℃、3 min,變性:94 ℃、30 s,退火:60 ℃、30 s,延伸:72 ℃、1 min，共45個(gè)循環(huán),末端延伸:72 ℃、5 min。

1.2.4.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證將提取的DNA 5 μL點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),觀察條帶。電泳參數(shù):電泳液為1×TBE buffer,時(shí)間為30 min,電壓為110 V。

1.2.4.5供試菌株16S rRNA同源性分析將1.2.4.3中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI中BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有菌株16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì),找出與供試菌株序列同源性最高菌種。將供試菌株序列與已知NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中乳酸菌序列用DNASTAR軟件中MegAlign進(jìn)行分析,得到同源性百分比,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定供試菌株。

1.2.5供試菌株抑菌直徑測(cè)定采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定,用無菌吸管取1 mL供試菌液,分別加入到25 mL未凝固MRS培養(yǎng)液中,充分搖勻后再倒入平皿中待凝固。在凝固好的平皿中均等放置2個(gè)藥敏紙片、1個(gè)空白紙片。同樣方法做質(zhì)控菌株對(duì)照。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,測(cè)量抑菌圈直徑。上述實(shí)驗(yàn)每個(gè)菌株做3次重復(fù)。

1.2.6供試菌株對(duì)三種抗菌藥的敏感性判斷供試菌株對(duì)三種抗菌藥的敏感性參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)[10,12]規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)(詳見表1)進(jìn)行,報(bào)告各供試菌株對(duì)三種抗菌藥物是敏感、中度敏感、耐藥分別用S、I和R表示[11-12]。

2　結(jié)果與分析

2.1供試菌株的生物學(xué)特性

16株供試乳酸菌的形態(tài)及部分理化特性見表2。從表2可知,各供試菌株的菌落大小不盡相同,偏小、中等居多,菌落顏色均為乳白色,菌落除DM8和DM11外,均為不透明。供試菌株均為革蘭氏陽(yáng)性,4株球菌,12株桿菌,包括4株短桿菌。理化檢測(cè)中硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)均為陰性。運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn),9株陽(yáng)性,7株陰性;陽(yáng)性菌株3株球菌,6株桿菌,陰性菌株2株球菌,其余為桿菌。葡萄糖產(chǎn)氣、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)均為陰性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合乳酸菌特性。本實(shí)驗(yàn)還選取五種代表性的糖:葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn),只有DM17葡萄糖發(fā)酵略產(chǎn)氣,其他均不產(chǎn)氣。糖發(fā)酵中有25%種次為陰性,其余均為陽(yáng)性。致此原因:糖發(fā)酵原理、微生物含有酶系不同所致，綜上，DM8為乳酸乳球菌、DM21為約氏乳桿菌，其余均為植物乳桿菌。

表2　供試菌株的生物學(xué)特性結(jié)果

注:—:表示不透明,半:表示半透明,G+:表示革蘭氏陽(yáng)性,-:表示陰性,+:表示陽(yáng)性,+○:表示陽(yáng)性產(chǎn)氣,=:表示陰性無發(fā)酵。

2.2供試菌株16S rRNA鑒定

2.2.1DNA提取條帶條帶如圖1所示。目的條帶與預(yù)期條帶一致,均大于2000 bp。

圖1　供試菌株總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis of total DNA of the tested strains注:M:DNA Marker DL2000,1:DM1,2:DM2,3:DM3,4:DM4,5:DM6,6:DM8,7:DM9,8:DM10,9:DM11,10:DM13,11:DM14,12:DM15,13:DM17,14:DM18,15:DM19,16:DM21,17:FC,18:DC。

2.2.216S rRNA擴(kuò)增條帶以試劑盒提取的DNA為模板,對(duì)16株供試菌株16S rRNA基因50 μL體系擴(kuò)增,再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,供試菌株、標(biāo)準(zhǔn)菌株都在275 bp處出現(xiàn)特異性的條帶,與預(yù)期吻合,DM16、DM17、DM18有重復(fù)條帶現(xiàn)象,分析可能是因退火溫度不夠高或引物不夠特異所致,詳見圖2。

圖2　供試菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig.2　16S rRNA gene amplificationelectrophoresis of the tested strains注:M:DNA Marker DL2000,1:DM1,2:DM2,3:DM3,4:DM4,5:DM6,6:DM8,7:DM9,8:DM10,9:DM11,10:DM13,11:DM14,12:DM15,13:DM17,14:DM18,15:DM19,16:DM21,17:FC,18:DC。

2.2.316S rRNA同源性分析將上述PCR產(chǎn)物與Genbank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知乳酸菌的16S rRNA基因序列同源性分析并出圖(見圖3)。16株供試菌株中DM2、DM3、DM4、DM6、DM9、DM10、DM11、DM13、DM14、DM15、DM17、DM18和DM19的16S rRNA序列結(jié)果與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)序列的同源性為100%,菌株DM1的16S rRNA序列結(jié)果與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)序列的同源性為99.5%,故判定以上14株供試菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum);DM8的16S rRNA序列結(jié)果與乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)序列的同源性為99.5%,故判定為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis);DM21的16S rRNA序列結(jié)果與約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)序列的同源性為97.9%,故判定為約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)。

圖3　供試菌株的同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Homology and phylogenetic tree oftested strains

2.3供試菌株的耐藥特性

2.3.1供試菌株耐藥抑菌圈直徑及藥敏結(jié)果供試菌株培養(yǎng)24 h后,測(cè)量培養(yǎng)皿抑菌圈直徑大小求均值,得藥敏結(jié)果見表3,耐藥率結(jié)果見表4。

表3　三種抗菌藥物對(duì)16株乳酸菌的抑菌直徑及藥敏結(jié)果

注:R為耐藥,I為中度敏感,S為敏感,W為在CLSI規(guī)定值范圍之內(nèi)。

表4　16株供試菌株對(duì)三種抗菌藥物的耐藥率

表5　三種抗菌藥物對(duì)供試菌株抑菌直徑的F檢驗(yàn)

表4結(jié)果表明,16株菌對(duì)氨芐西林、紅霉素均為敏感,對(duì)阿莫西林有2株為耐藥,其余為敏感。16株菌對(duì)氨芐西林、紅霉素的耐藥率為0,對(duì)阿莫西林的耐藥率為12.5%。

質(zhì)控菌株大腸桿菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林和紅霉素的耐藥直徑均在CLSI規(guī)定允許范圍內(nèi),說明供試菌株耐藥直徑數(shù)值有效。

2.3.2供試菌株的耐藥性分析結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果做三種抗菌藥對(duì)供試菌株抑制性差異分析,結(jié)果見表5。

從表4、表5可以看出,三種抗菌藥物對(duì)乳酸菌抑制作用差異極顯著(p<0.01)。

周寧[7]從全國(guó)不同地區(qū)市售的酸奶中分離的43乳酸菌中,得出對(duì)氨芐西林的耐藥率為34.9%,對(duì)紅霉素的耐藥率為44.2%。秦宇軒[8]等人從市售酸奶中分離的100種乳酸菌,對(duì)鏈霉素和慶大霉素的耐藥率為100%,對(duì)萬古霉素的耐藥率為42%,對(duì)頭孢氨芐、四環(huán)素、紅霉素和土霉素的耐藥率為0。Hummel等[13]將40株商用乳酸菌對(duì)紅霉素、四環(huán)素、氯霉素、青霉素G、氨芐西林的耐藥性研究得出,耐藥率低于7%。MASCO等[14]對(duì)100株乳酸菌的耐藥性研究得出,對(duì)阿莫西林、萬古霉素、氯霉素、紅霉素的表現(xiàn)為敏感。張麗芳等[15]對(duì)34株乳酸菌的耐藥性研究得出,對(duì)紅霉素、氨芐西林、青霉素G均表現(xiàn)為敏感或中度敏感。陳燃等[16]對(duì)31株乳酸菌的耐藥性研究得出,對(duì)紅霉素的耐藥率為9.7%。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與以上學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,16株乳酸菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、紅霉素表現(xiàn)為較低的耐藥率,分別為12.5%、0、0。但Hummel等人[12,17]在對(duì)氯霉素敏感的乳酸菌中檢測(cè)出氯霉素耐藥基因(cat),說明無耐藥型的乳酸菌也可能攜帶耐藥基因。秦宇軒等人[8]在對(duì)紅霉素敏感菌株檢測(cè)到耐藥基因(ermB)。呂耀龍[18]研究?jī)?nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對(duì)氧氟沙星的表現(xiàn)為較高的耐藥率。目前人類大量濫用抗菌藥物,乳酸菌對(duì)多數(shù)抗菌藥物表現(xiàn)為不同程度的耐藥,但也存在著對(duì)部分抗菌藥物表現(xiàn)為敏感。對(duì)抗菌藥物敏感的菌株不完全是安全菌株,也可能含有耐藥基因,只是沒有表達(dá)或表達(dá)不充分。FAO/WHO評(píng)價(jià)益生菌安全的重要指標(biāo)之一是其耐藥性評(píng)價(jià)[15,19]。

3　結(jié)論

3.116株供試菌株中,經(jīng)生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)和16S rRNA鑒定,除DM8為乳酸乳球菌、DM21為約氏乳桿菌外,其余均為植物乳桿菌。

3.216株供試菌株中,2株菌對(duì)阿莫西林表現(xiàn)為耐藥,耐藥率為12.5%;對(duì)氨芐西林和紅霉素均為敏感菌株,耐藥率為0。供試菌株對(duì)三種抗菌藥物表現(xiàn)為較低的耐藥率。內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對(duì)不同的抗菌藥物呈現(xiàn)不同的耐藥性。敏感菌株也可能含有耐藥基因,不完全是安全菌株。鑒于此,對(duì)食品工業(yè)而言,在選育評(píng)價(jià)乳酸菌菌株時(shí),除了考慮其發(fā)酵能力,發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)和安全性外,還應(yīng)檢測(cè)菌株的耐藥性和耐藥機(jī)理,這樣可保證食用菌株的安全性,防范耐藥菌株的擴(kuò)增和耐藥基因的轉(zhuǎn)移。

[1]Mathur S,Singh R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria-a review[J]. International Journal of Food Microbiology,2005,105(3):281-295.

[2]Bronzwaer SLAM,Cars O,Buchholz U,et al. A European study on the relationship between antimicrobial use and antimicrobial resistance[J]. Emerging Infectious Diseases,2002,8

(3):278-282.

[3]李少英.奶牛源性雙歧桿菌和乳桿菌的分離鑒定及耐藥性研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2008:14-28,55-73.

[4]曾振靈,林居純. 氟喹諾酮類藥物耐藥性的研究進(jìn)展[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2005,30(1):11-15.

[5]霍小琰.乳酸菌拓?fù)洚悩?gòu)酶gyrA基因突變與耐喹諾酮類藥物的相關(guān)性[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2012:21-35.

[6]張燕燕.乳酸菌對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2008:44-50.

[7]周寧.中國(guó)不同地區(qū)市售酸奶中乳酸菌的藥物敏感性分析[D].西安:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012:25-34.

[8]秦宇軒,李晶,王秋涯,等.市售酸奶中乳酸菌的鑒定與耐藥性[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,53(8):889-896.

[9]內(nèi)村泰,崗田早苗.乳酸菌實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(日文版)[M].日本東京都新宿區(qū)新小川町,朝倉(cāng)書店,1992:6-29.

[10]鄒立扣,蒲妍君,楊莉,等.四川省豬肉源大腸桿菌和沙門氏菌的分離與耐藥性分析[J].食品科學(xué),2012,33(3):203-206.

[11]凡琴,劉書亮,李娟,等.中國(guó)市售酸奶乳酸菌的耐藥性分析[J].衛(wèi)生研究,2012,41(3):476-479.

[12]CLSI.抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(第十九版信息增刊)[S].2009,1:34-88.

[13]Hummel as,Hertelc,Holzapfel w h,et al. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria[J].Am Soc Microbiol,2007,73:730-739.

[14]Mascoll,Huysg,Swiugsj,et al. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans,animals and probiotic products[J].J Antimicrob Chemother,2006,58:85-94.

[15]張麗芳,田洪濤,張玉蘭,等.健康人體及保健品中乳酸菌和雙歧桿菌的抗藥性分析[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2009,9(6):144-151.

[16]Food and Agriculture Organization/World Health Organization. Guidelines for the evaluation of probiotics in food:report of a Joint FAO/WHO Working Group[R].Cordoba:FAO/WHO,2002.

[17]潘露,胡曉清,王小元.食品中乳酸菌危害因子的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2011,32(6):447-451.

[18]呂耀龍,李少英,馬春艷,等.內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對(duì)氧氟沙星的耐藥性分析[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,7(4):86-89.

[19]韓俊華,李珊珊,裴家偉,等.益生乳桿菌質(zhì)?？股乜剐曰蚺c其耐藥性的相關(guān)性探討[J].食品工業(yè)科技,2013,34(12):181-191.

Identification and drug resistance analysis on the lactic acid bacteria of cow milk in the pastoral areas of Damao Banner in Inner Mongolia

LV Yao-long1,LI Shao-ying2,*,BAO Dan-dan1,ZHAO Chun-jie1

(1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University,Baotou 014109;2.Food Science and Engineering College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018)

The sixteen 16 strains of lactic acid bacteria were isolated from the cow milk in the Damao pasture of Inner Mongolia,and were used as research subjects in the study. The method of morphological observation,biological characteristics test and 16S rRNA identification were adopted in the experiment. The disk diffusion method was used to determine drug resistance of three antibiotics of amoxicillin,ampicillin and erythromycin. Results showed that DM8 wasLactococcuslactis,and DM21 wasLactobacillus,and that except DM8 and DM21,the rest were allLactobacillusplantarum. The study also showed that the tested strains resistant to amoxicillin was 12.5%,the tested strains were sensitive to ampicillin and erythromycin,and the sensitive strain was not entirely safety strain through analysis.

lactic acid bacteria;identification;drug resistance;analysis

2015-10-22

呂耀龍(1982-)，男，碩士，講師，主要從事食品微生物方面的研究，E-mail:lylong1982@163.com。

李少英(1961-)，女，博士，教授，研究方向：有益微生物方面的研究，E-mail:nmglshy@126.com。

內(nèi)蒙古高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJ09059)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060014)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)12-0178-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.026