雞腦乙酰膽堿酯酶的性質(zhì)及對氨基甲酸酯類物質(zhì)的敏感性研究

張佳佳,黃惠華

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

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雞腦乙酰膽堿酯酶的性質(zhì)及對氨基甲酸酯類物質(zhì)的敏感性研究

張佳佳,黃惠華*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

利用雙水相萃取雞腦中的乙酰膽堿酯酶(acetycholinesterase,AChE),研究其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn):雞腦AChE最適反應(yīng)溫度為37 ℃,最適反應(yīng)pH為7.5,米氏常數(shù)Km為5.67×10-5mol·L-1,最大反應(yīng)速率Vm為0.20×102mol·(min·L)-1。雞腦AChE的Km值明顯小于商品AChE的Km值,表明雞腦AChE對底物具有更大的親和力。研究AChE對氨基甲酸酯類物質(zhì)的敏感性發(fā)現(xiàn):該酶對5種氨基甲酸酯類有毒成分呋喃丹、滅多威、西維因、涕滅威、速滅威的半抑制濃度分別為0.004、0.07、0.23、0.53、5.24 μg·mL-1;其雙分子速率常數(shù)分別為40.89×105、3.09×105、2.80×105、2.78×105、2.74×105L·(mol·min)-1。雞腦AChE對氨基甲酸酯類有毒成分表現(xiàn)出較強的敏感性,具有低成本、高活性、制備簡單的優(yōu)點,對氨基甲酸酯類有毒成分殘留的檢測具有重要意義。

雞腦,乙酰膽堿酯酶,氨基甲酸酯類有毒成分

自20世紀40年代起,包括氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)在內(nèi)的氨基甲酸酯類物質(zhì)就被發(fā)現(xiàn)具有致癌性[1]。酒精飲料、醬油、面包等發(fā)酵食品中都被發(fā)現(xiàn)含有或多或少的EC,引起了各國對食品中EC含量的重視[2]。目前在發(fā)酵飲料如酒類尤其是葡萄酒中,氨基甲酸酯類有毒成分日益引起人們的關(guān)注。大量使用農(nóng)藥會對身體健康及外部生態(tài)環(huán)境造成極大危害[3]。氨基甲酸酯類農(nóng)藥是目前我國使用最主要的農(nóng)藥之一[4],因此,氨基甲酸酯類有毒成分的分析檢測尤為重要。

傳統(tǒng)檢測方法檢測時間長,過程復(fù)雜,分析成本高[5],現(xiàn)在酶抑制法作為氨基甲酸酯類有毒成分殘留的主要測定方法[6-7],具有簡便、快捷及成本低廉等優(yōu)點[8]。檢測用酶是酶抑制法的核心和關(guān)鍵[9],當前商品AChE主要是從家蠅等敏感昆蟲頭部提取,產(chǎn)量低、成本高,難以滿足檢測的需求[10]。因此進行新酶源的開發(fā)研究十分必要。

目前雞腦AChE的研究較少,將雞腦作為新酶源具有以下優(yōu)點:第一,雞腦是雞加工處理過程中的下腳料,來源豐富,也是對廢棄物的高值化利用;第二,相關(guān)研究表明[11],與AChE活性較高的魚腦相比,雞腦AChE不僅酶活高,而且易于純化;第三,實驗中所用雙水相萃取方法成本低、耗時短、操作簡便。研究雞腦AChE酶學(xué)性質(zhì)及對氨基甲酸酯類有毒成分的敏感性,可以為酶抑制法測定氨基甲酸酯類有毒成分的酶源篩選提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗所用雞頭市售清遠雞;碘化硫代乙酰膽堿(ATCHI)Sigma公司,AR,10 mg·mL-1;二硫代對二硝基苯甲酸(DTNB)Sigma公司,AR,10 mg·mL-1,溶解于0.1 mol·L-1pH7.5的磷酸鹽緩沖液中;考馬斯亮藍G-250Sigma公司,BR;牛血清白蛋白Sigma公司,≥98%;農(nóng)藥標準品(滅多威、速滅威、涕滅威、西維因、呋喃丹,100 μg·mL-1,溶解于丙酮中)、商品乙酰膽堿酯酶(家蠅AChE,BR,酶活力>200 U/g,13 mg·mL-1,溶解于0.1 mol·L-1pH8.0的磷酸鹽緩沖液中)、TritonX-100(≥98%)廣州菲博生物科技有限公司。

UV1800型紫外-可見分光光度計日本島津公司;PHS-25型pH計上海虹益儀器儀表有限公司;HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有限公司;XW-80A旋渦混合器上海精科儀器有限公司;BSA124S-CW分析天平賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;JW-3021HR高速冷凍離心機安徽嘉文儀器設(shè)備有限公司;FJ200-S數(shù)顯高速分散均質(zhì)機上海標本模型廠;LGJ-10冷凍干燥機北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1雞腦AChE的制備雞頭從農(nóng)貿(mào)市場買回后洗凈,用鑷子取出腦部組織于培養(yǎng)皿中,用蒸餾水清洗掉血絲,稱重后置于4 ℃冰箱中待用。準確稱取一定質(zhì)量的雞腦組織,以含0.5% TritonX-100的磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1,pH8.0)作為提取液,按照料液比1∶4進行混合,均質(zhì)后于4 ℃靜置30 min,8000 r·min-1,4 ℃離心20 min,收集上清液,稀釋5倍后,儲藏于-20 ℃冰箱中備用。

雙水相萃取:體系總質(zhì)量為10 g,PEG-1000質(zhì)量濃度為15.1%,(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為14.8%,體系pH為5.8,上清液加入量為15.5%,以此建立雙水相體系,攪拌10 min后,靜置分相,以蒸餾水代替上清液加入體系中作為空白組,收集AChE所富集的上相及相應(yīng)的空白組上相。

反萃取:將收集的實驗組及空白組上相調(diào)節(jié)pH為5.0,按照4∶1的比例加入40%(w/v)磷酸氫二鉀鹽溶液(用40%(w/v)的磷酸二氫鉀溶液調(diào)節(jié)40%(w/v)的磷酸氫二鉀溶液的pH至5.0),攪拌均勻后,靜置分相,形成新的雙水相體系。記錄上下相體積,收集下相,測定酶活。

將收集的下相用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1,pH8.0)透析12 h,將透析袋內(nèi)的溶液進行冷凍干燥,即得雞腦AChE酶粉。

1.2.2AChE酶活性的測定改進Ellman法[12]:在試管中先后加入5 mL 0.1 mol·L-1pH7.5磷酸鹽緩沖液和0.1 mL酶液(13 mg·mL-1,溶解于0.1 mol·L-1,pH8.0磷酸鹽緩沖液中),混勻后于37 ℃水浴保溫15 min,而后添加DTNB和 ATCHI各0.1 mL,混勻后立即在412 nm比色,在3 min內(nèi)每隔0.1 min連續(xù)測定吸光度值,記3 min前后的吸光度變化值ΔA,每組3個平行樣取平均值。以蒸餾水代替酶液作為空白,進行酶活性的測定。

酶活(U·mL-1)的定義:每毫升酶液每分鐘分解ATCHI所需的微摩爾數(shù),按下式計算:

式中,V為反應(yīng)體系的總體積,本體系為5.3×10-3L;ΔA為3 min前后的吸光度變化值;

t為反應(yīng)時間,本法為3 min;ε為黃色產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),為1.36×104L·(mol·cm)-1;v為酶液體積,本體系為0.1 mL;l為比色皿光程(1 cm)。

1.2.3雞腦AChE最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度的測定分別配制0.1 mol·L-1pH6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0的緩沖液,其他因素不變的情況下,在上述緩沖液中,按1.2.2的方法測定酶活,以確定AChE的最適反應(yīng)pH。

其他因素不變的情況下,加入酶液以后,分別在20、25、30、35、37、40、45、50 ℃水浴中保溫,按1.2.2的方法測定酶活,以確定AChE的最適反應(yīng)溫度。

式中,ΔA為3 min前后的吸光度變化值;t為反應(yīng)時間,本法為3 min;ε為黃色產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),為1.36×104L·(mol·cm)-1；l為比色皿光程(1 cm)。

1.2.5抑制動力學(xué)的測定取5 mL 0.5 μg·mL-1的不同農(nóng)藥稀釋液(用0.1 mol·L-1,pH7.5磷酸鹽緩沖液稀釋),加入酶液0.1 mL,其中一管以蒸餾水代替酶液作為空白對照,混勻后37 ℃水浴保溫。保溫0、2、4、6、8、10 min后,加入DTNB和ATCHI各0.1 mL,混勻后立即在412 nm處測定酶活,以抑制率I(%)為縱坐標,時間t(min)為橫坐標作圖。

式中,I為抑制率(%);E1為農(nóng)藥抑制后的酶活;E0為空白管的酶活。

1.2.6半抑制濃度IC50的測定取農(nóng)藥稀釋液加入到磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1,pH7.5)中,配制成不同的濃度梯度,分別取5 mL,加入酶液0.1 mL,其中一管以蒸餾水代替酶液作為空白對照,混勻后于37 ℃水浴保溫15 min,加入DTNB和ATCHI各0.1 mL,混勻后立即在412 nm處測定酶活,并計算抑制率,以農(nóng)藥濃度的對數(shù)lgC對抑制率I(%)作圖,求出AChE的IC50。

1.2.7雙分子速率常數(shù)Ki的測定取0.1 mL酶液和5 mL 0.5 μg·mL-1農(nóng)藥稀釋液加入三支試管中,三支試管分別反應(yīng)2、4、6 min后測定酶活,另取一支試管以蒸餾水代替農(nóng)藥作為空白對照。根據(jù)公式分別計算三支試管的Ki,取其平均值[15]。

式中,Ki為雙分子速率常數(shù);E1為不加農(nóng)藥的酶活;E2為加農(nóng)藥的酶活;M為農(nóng)藥的濃度,轉(zhuǎn)化為摩爾濃度;t為反應(yīng)時間。

2　結(jié)果與分析

2.1雞腦AChE的最適反應(yīng)pH

pH不但會影響酶的構(gòu)象和穩(wěn)定性,還會影響酶與底物的解離狀態(tài),從而影響酶的活性[15]。實驗結(jié)果表明,當pH=7～9時,雞腦AChE酶活相對較高,過酸過堿均會對其產(chǎn)生抑制作用,其中最適pH為7.5,這可能與酶活性中心的氨基酸有關(guān),偏堿的環(huán)境可能有利于氨基酸引導(dǎo)底物進入酶的活性位點[17]。雞腦AChE的最適pH與許多已報道的AChE的最適pH相似,如豬腦AChE[18]、家蠅AChE[19]、鲅魚腦AChE[20],均在7.5左右。

圖1　pH對雞腦AChE酶活的影響Fig.1　Effect of pH on the activity of AChE extracted from chicken brain

2.2雞腦AChE的最適反應(yīng)溫度

溫度高低會影響酶催化反應(yīng)的速度及蛋白的活性。實驗結(jié)果表明,雞腦AChE在37 ℃時酶活最高,30～45 ℃之間酶活相對較高,當溫度高于45 ℃時,高溫會引起蛋白變性從而酶活顯著降低。實驗結(jié)果與許多其他來源的AChE的最適溫度基本一致,如豬腦AChE[18],家蠅AChE[19],胎牛血清AChE[21]。

圖2　溫度對雞腦AChE酶活的影響Fig.2　Effect of temperature on the activity of AChE extracted from chicken brain

2.3雞腦AChE動力學(xué)參數(shù)Km、Vm

雞腦AChE的動力學(xué)參數(shù)Km、Vm研究結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知,雞腦AChE的動力學(xué)曲線的線性擬合良好,Km為5.67×10-5mol·L-1,Vm為0.20×102mol·(min·L)-1。與家蠅AChE[22]相比,雞腦AChE的Km明顯較小,且Vm高于家蠅AChE的Vm,表明雞腦AChE對底物親和力較強。

圖3　雞腦AChE的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.3　Double-reciprocal plot of AChE extracted from chicken brain

2.4雞腦AChE和商品AChE的抑制動力學(xué)

5種氨基甲酸酯類有毒成分對雞腦AChE和商品AChE的抑制動力學(xué)曲線如圖4和圖5所示。

圖4　雞腦AChE的抑制動力學(xué)曲線Fig.4　The inhibitory kinetic curve of AChE extracted from chicken brain

由圖4可知,氨基甲酸酯類有毒成分對雞腦AChE的抑制效果隨時間的延長而效果顯著,其中:呋喃丹>滅多威>西維因>涕滅威>速滅威。滅多威和呋喃丹對雞腦AChE的抑制效果最明顯。比較圖4和圖5可知,在相同的抑制時間下,5種成分對雞腦AChE的抑制效果均明顯強于商品AChE。其中,呋喃丹對雞腦AChE的抑制率在10 min就達到90%,高出商品AChE近40%,且對商品AChE的抑制效果較弱的速滅威、涕滅威和西維因,對雞腦AChE的抑制效果也明顯增強。表明雞腦AChE與有毒成分的反應(yīng)短時、高效,更有利于有毒成分殘留的檢測。

表1　氨基甲酸酯類有毒成分抑制AChE的IC50值比較

圖5　商品AChE的抑制動力學(xué)曲線Fig.5　The inhibitory kinetic curve of commercial AChE

2.5氨基甲酸酯類有毒成分抑制雞腦AChE的IC50值比較

5種氨基甲酸酯類有毒成分對雞腦AChE和商品AChE的半抑制濃度IC50如表1所示。

IC50常用來評價AChE對各種抑制劑的敏感性,IC50值越小代表酶對該種抑制劑的敏感性越強,抑制劑抑制酶的活性越強[23]。由表1可知,雞腦AChE活力與氨基甲酸酯類有毒成分在一定的線性區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。雞腦AChE的IC50值大小順序為:呋喃丹<滅多威<西維因<涕滅威<速滅威,均比商品AChE小一個數(shù)量級,且線性區(qū)間更大,檢測下限更低,表明雞腦AChE較商品AChE具有更強的敏感性,更有利于低濃度氨基甲酸酯類有毒成分殘留的檢測。

2.6氨基甲酸酯類有毒成分抑制雞腦AChE的Ki值比較

氨基甲酸酯類有毒成分對AChE的Ki研究結(jié)果如表2所示。

Ki是一級速率常數(shù),Ki值越小,酶對抑制劑越不敏感,比較不同來源酶的Ki值是從本質(zhì)測定敏感性的一種很好的方法[17]。由表2可知,雞腦AChE對5種氨基甲酸酯類有毒成分敏感性的大小順序為:呋喃丹>滅多威>西維因>涕滅威>速滅威。兩種來源的酶對比可知,雞腦AChE的Ki值均大于商品AChE的Ki值,因此雞腦AChE對這5種氨基甲酸酯類有毒成分具有更強的敏感性,與抑制動力學(xué)和IC50測定結(jié)果保持一致。

表2　氨基甲酸酯類有毒成分

篩選對氨基甲酸酯類有毒成分敏感的酶源對有毒物殘留檢測具有重要意義。雞腦AChE利用雞加工的下腳料雞腦,來源豐富,具有制備簡單、所需時間短、成本低的優(yōu)點。根據(jù)抑制動力學(xué)、IC50和Ki的研究,結(jié)果均顯示雞腦AChE比商品AChE表現(xiàn)出更高的敏感性,可以作為氨基甲酸酯類有毒成分檢測的酶源。

3　結(jié)論

3.1雞腦AChE的最適反應(yīng)溫度為37 ℃,最適反應(yīng)pH為7.5,米氏常數(shù)Km為5.67×10-5mol·L-1,最大反應(yīng)速率Vm為0.20×102mol·(min·L)-1。與商品AChE相比,雞腦AChE的Km明顯較小,Vm較大,表明雞腦AChE對底物具有更強的親和性。

3.25種氨基甲酸酯類有毒成分對雞腦AChE的抑制效果:呋喃丹>滅多威>西維因>涕滅威>速滅威,均明顯強于對商品AChE的抑制效果;雞腦AChE對5種氨基甲酸酯類有毒成分呋喃丹、滅多威、西維因、涕滅威、速滅威的IC50值分別為:0.004、0.07、0.23、0.53、5.24 μg·mL-1,均比商品AChE對其的IC50值小一個數(shù)量級;Ki值分別為40.89×105、3.09×105、2.80×105、2.78×105、2.74×105L·(mol·min)-1,均大于商品AChE的Ki值;三種測定結(jié)果均表明雞腦AChE較商品AChE具有更強的敏感性,更有利于低濃度氨基甲酸酯類有毒成分殘留的檢測。

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Study on carbamate sensitivity of acetycholinesterase extracted from chicken brain

ZHANG Jia-jia,HUANG Hui-hua*

(College of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Acetycholinesterase(AChE)was extracted from chicken brain by aqueous two-phase,and its enzymatic characteristics was studied. The result showed that the most optimum conditions of chicken brain AChE were 37 ℃ and pH7.5,Km5.67×10-5mol·L-1,Vm0.20×102mol·(min·L)-1,indicating its more affinity to the substrate,compared with commercial AChE. Its sensitivity to carbamate was studied. The result indicated that the 50% inhibition concentration of five carbamate toxins(carbofuran methomyl,carbaryl,aldicarb,metolcarb)were 0.004,0.07,0.23,0.53,5.24 μg·mL-1,and the bimolecular rate constants were 40.89×105,3.09×105,2.80×105,2.78×105,2.74×105L·(mol·min)-1. These results proved that the AChE extracted from chicken brain was more sensitive to carbamate toxins and had the advantages of low cost,high activity and simple preparation. The AChE extracted from chicken brain showed its great siginificance in carbamate toxins residue detection.

chicken brain;acetycholinesterase;carbamate toxins

2016-01-06

張佳佳(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：15626157081@163.com。

黃惠華(1959-)，男，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與保藏，E-mail：401603106@qq.com。

廣州市科技計劃項目(201300000079)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)12-0117-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.015