高密度CO2殺菌蛋清液貯藏期間抗氧化物活性以及過敏源特性變化分析

戴　妍,范　蓓,盧　嘉,侯　猛,韓兆鵬,盧曉明,*

(1.北京德青源農(nóng)業(yè)科技股份有限公司,北京 102115;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所,北京 100193)

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高密度CO2殺菌蛋清液貯藏期間抗氧化物活性以及過敏源特性變化分析

戴妍1,范蓓2,盧嘉2,侯猛1,韓兆鵬1,盧曉明1,*

(1.北京德青源農(nóng)業(yè)科技股份有限公司,北京 102115;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所,北京 100193)

研究高密度CO2殺菌和巴氏殺菌處理對貯藏期間蛋清液抗氧化物活性和過敏原特性變化的影響。將蛋清液分對照組、巴氏殺菌處理組(55 ℃水浴殺菌3.5 min)和高密度CO2處理組(分別在10、20、30 MPa壓力下殺菌10 min),然后放置于4 ℃恒溫貯藏,檢測4周貯藏期間蛋白質(zhì)羥自由基清除能力、DPPH自由基抑制率、還原力以及過敏源特性的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:高密度CO2殺菌(DPCD)10 MPa處理組蛋清液在1周儲藏期間中羥自由基清除率和還原力顯著高于(p<0.05)對照處理組。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,儲藏期間DPCD處理并沒破壞蛋清液中的重要過敏源——卵白蛋白。

高密度CO2殺菌,抗氧化物,過敏源,蛋清

高密度CO2殺菌技術(shù)是一種新型非熱力(冷殺菌)技術(shù)。在食品工業(yè)中使用這種殺菌技術(shù)可以最大限度地保留食品中有益成分,是一種綠色潔凈技術(shù)[1-2]。國內(nèi)外學(xué)者對高密度CO2殺菌技術(shù)處理后的絕大多數(shù)液體和部分固體食品的理化、品質(zhì)以及安全特性進(jìn)行了研究[2-4]。

液態(tài)蛋可分為蛋清液、蛋黃液、全蛋液三類[5],液態(tài)蛋有很高的營養(yǎng)價值,它可以應(yīng)用于焙烤、餐飲業(yè)、面條、餅干、蛋糕、甜食以及煎蛋等食品的開發(fā)[5]。目前液態(tài)蛋常用的殺菌方式為巴氏殺菌。工業(yè)上液態(tài)蛋巴氏殺菌條件為水浴55～66 ℃殺菌2.5～3.5 min。巴氏殺菌法效率高,殺菌效果好,能夠延長液蛋產(chǎn)品貨架期。但是這種加熱殺菌方式在一定程度上破壞了蛋液中營養(yǎng)成分和功能特性,而且它不能從根本上消除蛋液中有害微生物的影響[6]。

食品過敏特性以及抗氧化活性都是影響食品質(zhì)量和安全最為重要的因素[7-10]。國內(nèi)僅劉文營[1]初步研究了高密度CO2殺菌處理對于蛋清液在貯藏期間微生物、pH、起泡能力、乳化性、疏水性和表面巰基等方面的影響[1],目前國內(nèi)外對于高密度CO2殺菌處理對于蛋清液抗氧化物活性與過敏特性的影響仍然是空白。本文通過對蛋清液設(shè)置對照、巴氏殺菌以及高密度CO2殺菌處理,比較了它們在4 ℃條件下貯藏4周抗氧化物活性以及過敏特性差異,從抗氧化特性和過敏特性的角度來客觀闡明高密度CO2殺菌方式也能夠達(dá)到或者超過未經(jīng)處理或巴氏殺菌蛋液水平,從而為高密度CO2殺菌的應(yīng)用前景以及后期該種技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化提供有價值的參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮殼蛋德青源公司;純度為99.5%的二氧化碳?xì)怏w北京千禧京城氣體有限公司;biolabs P7710 蛋白Marker北京百靈克公司;三羥甲基氨基甲烷、5,5-二硫二硝基苯甲酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、甘油、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R-250、DPPH美國Amresco公司;Urea美國Sigma公司;lowery蛋白濃度測試盒、牛血清白蛋白BSA等藥品北京索來寶公司;其它試劑均為分析純。

Shimadzu UV-1780紫外可見分光光度計(jì)日本;SL-Ⅲ型低溫層析冷柜;Eppendorf移液器美國;XHF-D勻漿機(jī);H1850R高速冷凍離心機(jī);BG電泳儀北京索來寶公司;Tocan gelation image system凝膠成像儀南京生物技術(shù)公司;TS-2脫色搖床金壇儀器有限公司;DK-600B水浴鍋、SFT-HPR-1000高密度二氧化碳DPCD處理儀、電子天平等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料處理將新鮮殼蛋破碎,分離出蛋清液,用勻漿器3000 r/min勻漿30 s,取15 mL蛋清液直接放入20 mL離心管中,對照處理組蛋液直接放入4 ℃冷柜中儲藏備用,巴氏殺菌處理組則將蛋清液用真空包裝袋密封后,置于55 ℃水浴鍋,殺菌3.5 min后取出冷卻到室溫,取15 mL蛋清液直接放入20 mL的離心管中,然后置于4 ℃冷柜中儲藏備用,在第0 d、1、2、3、4周進(jìn)行取樣分析。

將鮮蛋清液(20 mL)放入離心管中,采用高密度CO2殺菌法(10、20和30 MPa)處理10 min。處理結(jié)束后取出離心管,然后迅速放入4 ℃冷柜中儲藏備用[1-2],每個處理組使用4份蛋清液樣品。

1.2.2羥自由基清除能力分析羥自由基(OH)清除能力測定方法參考楊瑾[11]的方法,具體如下:用蒸餾水稀釋將蛋清液樣品至蛋白濃度為5 mg/mL,蛋清蛋白質(zhì)濃度用lowery試劑盒法測定,然后用羥自由基測定試劑盒測定稀釋液的羥自由基(OH)清除能力,在550 nm下比色,羥自由基清除力(%)=[OD對照組-OD樣品/OD對照組]×100,式中,OD樣品為樣品的吸光度值;OD對照組為對照樣吸光值(含雙蒸水、底物應(yīng)用液,但不含樣品和H2O2)。

1.2.3DPPH自由基清除率分析蛋清液樣品的DPPH自由基抑制率測定參考文獻(xiàn)[10]。稱取0.03 g蛋清液迅速和3 mL 0.004% DPPH-乙醇溶液混合,振蕩搖勻。在室溫下放置30 min后,以無水乙醇為空白,于517 nm處測定吸光值。吸光值越小代表其清除DPPH自由基能力越強(qiáng)。

1.2.4還原力分析用蒸餾水稀釋將蛋清液樣品至蛋白濃度為0.5 mg/mL,蛋清液蛋白質(zhì)濃度用lowery蛋白試劑盒測定。取樣品溶液2 mL,加入2 mL 1%的K3(CN)6溶液,置于50 ℃的水浴鍋中反應(yīng)80 min,迅速冷卻后離心(3000×g,10 min,20 ℃),取上清液2 mL,加入2 mL去離子水和0.5 mL濃度為0.1%的FeCl3溶液?；旌暇鶆蚝箪o置60 min,于700 nm 處測定吸光值,吸光值越大,說明樣品的還原力越強(qiáng)[11]。

1.2.5過敏源特性分析特異性過敏源卵白蛋白(ovalbumin)采用SDS-PAGE進(jìn)行分析:取蛋清液(1 g),加入20 mL蒸餾水,然后使用XHF-D型勻漿機(jī)攪拌。攪拌后的蛋清液樣品用lowery蛋白濃度測試盒法進(jìn)行測試。將蛋清液的蛋白質(zhì)濃度1 mg/mL,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE采用的分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為4%。將蛋清液樣品按1∶5與樣品緩沖液(含有2% SDS,10% 甘油,1%β-巰基乙醇,pH=6.8的Tris-HCl以及0.05%溴酚蘭)混合,混合后的樣品液置于100 ℃沸水中加熱5 min。取大約含20 μg的樣品液上樣(使用biolabs P7710蛋白Marker做對照)。電泳分離采用恒流模式(30 mA)保持2.5 h后,取出凝膠后,用考馬斯亮藍(lán)R-250染液(1 g/L)染色1 h后,用脫色液(120 mL/L甲醇和75 mL/L乙酸)隔夜脫色。脫色后的凝膠用凝膠成像儀拍照[12-14]。

1.2.6數(shù)據(jù)處理用SPSS 16.0 數(shù)據(jù)分析軟件對各指標(biāo)進(jìn)行分析,Unpaired Student T-test 用于分析各處理組蛋清液各指標(biāo)顯著性差異(p<0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1巴氏殺菌和高密度CO2殺菌對蛋清液樣品DPPH自由基能力的影響

在0～4周的儲藏時間中,對照組、巴氏殺菌處理組以及高密度CO2(10、20、30 MPa)殺菌處理組蛋清液中DPPH吸光值呈現(xiàn)出一種先上升后緩慢下降的趨勢(圖1),這與Liu等[15]研究儲藏期內(nèi)蛋液的DPPH變化趨勢一致。原因可能是儲藏期間導(dǎo)致蛋清液發(fā)生水解和氧化,水解作用強(qiáng)于氧化作用,因此會使蛋清液中產(chǎn)生更多的DPPH自由基抑制產(chǎn)物[16]。

圖1　儲藏期間DPPH的變化分析 Fig.1　DPPH variation during storage

第0 d高密度CO230 MPa殺菌處理組蛋清液中DPPH吸光值顯著高于(p<0.05)巴氏殺菌處理組吸光值。第1周高密度CO2(10 MPa和20 MPa)殺菌處理組蛋清液的DPPH值顯著高于(p<0.05)對照處理組,其余各組無明顯差別(p>0.05)。第3周高密度CO230 MPa殺菌處理組DPPH值顯著低于(p<0.05)對照處理組。第4周高密度CO210 MPa殺菌處理組DPPH值顯著低于(p<0.05)對照處理組,其他各處理組無顯著性差異(p>0.05)。Tong[17]等認(rèn)為食品DPPH吸光度升高則代表DPPH自由基抑制率(抗氧化特性)下降,反之如果食品DPPH吸光值降低則代表DPPH自由基抑制率的增強(qiáng)。上述結(jié)果可以看出在儲藏后期高密度CO2殺菌處理組蛋清液DPPH自由基抑制率略好于對照處理組,而它與巴氏殺菌處理組蛋清液相比則無任何差別。

2.2蛋清液樣品羥自由基清除能力分析

羥自由基是一種最具有反應(yīng)特性,對臨近生物分子最具有損傷特性的含氧自由基[16]。在0～4周儲藏時間中,對照處理組、巴氏殺菌處理組以及高密度CO2(10、20、30 MPa)殺菌處理組蛋清液中羥自由基清除率呈現(xiàn)上升的趨勢(圖2)。原因可能是4 ℃儲藏期間可能導(dǎo)致蛋清液中卵粘蛋白-溶菌酶等復(fù)合體水解,從而產(chǎn)生更多羥自由基抑制產(chǎn)物[18],引起自身抗氧化能力在一定程度的增加。

圖2　儲藏期間羥自由基清除率的變化分析 Fig.2　Hydroxyl radical scavengingability variation during storage

高密度CO230 MPa殺菌處理組蛋清液在0 d和1周羥自由基清除率顯著低于(p<0.05)其他處理組。第1周高密度CO210 MPa殺菌處理組蛋清液羥自由基清除率顯著高于巴氏殺菌、高密度CO220 MPa和30 MPa殺菌處理組(p<0.05)。第3周高密度CO220 MPa和30 MPa殺菌處理組蛋清液羥自由基清除率顯著高于(p<0.05)巴氏殺菌處理組。第4周高密度CO220 MPa殺菌處理組蛋清液羥自由基清除率顯著低于(p<0.05)對照處理組和巴氏殺菌處理組,其余各處理組之間差異不大。這種高密度CO230 MPa殺菌處理比起單純的巴氏殺菌處理可能會引起蛋清液中更多抗氧化物活性酶鈍化,因此在儲藏第0～1周時它的羥自由基清除率低于其他處理組,后期可能隨著蛋清液的水解產(chǎn)生更多羥自由基抑制產(chǎn)物,部分抗氧化物酶活性恢復(fù),引起儲藏第4周時高密度CO230 MPa殺菌處理組蛋清液羥自由基清除率的提高。

2.3蛋清液樣品還原力分析

還原力(reducing powder)是表征食品抗氧化特性的重要指標(biāo)。食品還原力吸光度值越高,其抗氧化能力越強(qiáng)[10]。對照組、巴氏殺菌處理組以及高密度CO2(10、20、30 MPa)殺菌處理組蛋清液在0 d到第4周儲藏期中還原力吸光值呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(圖3),所有處理組蛋清液的還原力吸光值在第1周達(dá)到最大,隨后則呈現(xiàn)下降趨勢。第0 d高密度CO210 MPa殺菌處理組蛋清液還原力值顯著低于(p<0.05)巴氏殺菌處理組。在第1周時,高密度CO210 MPa殺菌處理組蛋清液還原力值顯著高于(p<0.05)對照處理組。第2周高密度CO230 MPa殺菌處理組蛋清液的還原力值顯著高于(p<0.05)巴氏殺菌處理組。在其他儲藏期間,各處理組還原力值無顯著性差異(p>0.05)。在儲藏前期(1～2周)時間,高密度CO2殺菌處理組蛋清液還原力水平可能要略高于對照和巴氏殺菌處理組,但后期高密度CO2殺菌與其他處理組之間差異性不大。

圖3　儲藏期間還原力變化分析 Fig.3　Reducing power variation during storage

2.4蛋清液樣品過敏特性分析

圖4表示對照、巴氏殺菌、高密度CO2(10、20、30 MPa)殺菌處理組蛋清液SDS-PAGE分析。圖4顯示蛋清液經(jīng)SDS-PAGE處理后顯示的主要蛋白條帶有5條,分子量約為60、52、40、32、27 ku。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與吳序櫟等[8]和趙偉[19]等研究的蛋清液主要蛋清液電泳條帶結(jié)果基本吻合。在前人文獻(xiàn)已經(jīng)鑒定出的蛋清液蛋白電泳條帶中[20],卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,卵白蛋白和溶菌酶分子量分別為250、78、43和14.3 ku。蛋清液中卵白蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白是主要過敏源[8],卵白蛋白對水解以及人體消化作用具有很強(qiáng)抵抗性,因此這種蛋白質(zhì)非常容易和人體中IgE和IgG等免疫球蛋白結(jié)合引發(fā)過敏[21]。從圖4中的SDS-PAGE圖譜可以看出,儲藏期間所有處理組過敏源卵白蛋白并未發(fā)生明顯變化,高密度CO2殺菌處理并未使蛋清液中卵白蛋白更大程度的變性。各組樣品蛋清液卵白蛋白電泳條帶無明顯差異。

圖4　儲藏期間各處理組蛋清液電泳分析Fig.4　SDS-PAGE patterns of liquid egg white treatment groups during storage

3　結(jié)論

在4 ℃儲藏期間,對照組、巴氏殺菌以及高密度CO2(10、20、30 MPa殺菌處理組)蛋清液DPPH自由基清除率和還原力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,而羥自由基(OH·)清除能力呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢。第0 d～1周時,高密度CO2殺菌處理組蛋清液DPPH較高,因此這種處理方式的DPPH自由基抑制率較差,第3～4周時,高密度CO2(10、30 MPa)殺菌處理組蛋清液的DPPH較低,它的DPPH自由基抑制率顯著高于對照處理組。第1～3周時,高密度CO210 MPa和30 MPa殺菌處理組蛋清液顯示了較高的還原力,分別高于對照處理組和巴氏殺菌處理組。第1周高密度CO210 MPa殺菌處理組蛋清液的羥自由基清除率顯著高于巴氏殺菌處理組,高密度CO220 MPa和30 MPa殺菌處理組。第3～4周高密度CO230 MPa殺菌處理組蛋清液具有較高的羥自由基清除率。高密度CO210 MPa殺菌處理蛋液組具有較好的抗氧化物活性水平,因此采用這種高密度殺菌方式可以達(dá)到短期鈍化蛋清液中的抗氧化物酶水平或是降低了水解和氧化作用,從而在一定程度上提升了蛋清液的抗氧化能力。單純采用高密度CO2殺菌技術(shù)并沒有起到破壞蛋清液中重要過敏源(卵白蛋白)的作用。在抗氧化物活性與過敏源特性方面,高密度CO2殺菌、對照組和巴氏殺菌處理組蛋液差異性不大。針對高密度二氧化碳處理影響蛋清液功能性的機(jī)理和影響方式,至今還不清晰,尚需更深入的研究。

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The changes of antioxidation parameters and antigenicity characteristics of ovalbumin in refrigerated-storage liquid egg white samples during dense phase carbon dioxide sterilization treatments

DAI Yan1,FAN Bei2,LU Jia2,HOU Meng1,HAN Zhao-peng1,LU Xiao-ming1,*

(1.Beijing DQY Egg Safety Agricultural Technology Co.,Ltd.,Beijing 102115,China;2.The Chinese Academy of Agricultural Sciences Institute of Atomic Energy Use,Beijing 100193,China)

In order to investigate the changes of antioxidant parameters and antigenicity characteristics of ovalbumin in liquid egg white samples treated by dense phase carbon dioxide sterilization and pasteurization treatment during refrigerated storage,the samples of liquid egg white were divided in control,pasteurization(treated at 55 ℃ for 3.5 min in a waterbath)and dense phase carbon dioxide sterilization(treated at 10 MPa,20 MPa and 30 MPa respectively for 10 min),and the samples were directly investigated during refrigerated storage at 4 ℃.The hydroxyl radical scavenging ability,DPPH radical scavenging ability,reducing powder and antigenicity characteristics were detected in these samples during 4 ℃ refrigerated-storage for 4 weeks. The results showed that the samples of liquid egg white under 10 MPa dense phase carbon dioxide sterilization(DPCD)treatments had significantly higher(p<0.05)hydroxyl radical scavenging ability and reducing powder than control group at first week. The results of SDS-PAGE showed that dense phase carbon dioxidesterilization treatments could not destroy the main antigenicity(ovalbumin)overall.

dense phase carbon dioxide sterilization;antioxidant;antigenicity;egg white

2015-10-22

戴妍(1986-)，女，博士，助理研究員，研究方向：蛋品科學(xué)與加工技術(shù)，E-mail:daiyan@dqy.com.cn。

盧曉明(1982-)，女，高級研究員，主要從事蛋品科學(xué)與加工技術(shù)方面的研究，E-mail:luxiaoming@dqy.com.cn。

蛋制品加工技術(shù)研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化示范(2012BAD28B08)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303084)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)12-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.014