甲狀腺功能減退癥大鼠卵巢TSHR表達及與TNF-α、IL-6的關系

周換麗，孫　燕，鄧大同，王佑民

甲狀腺功能減退癥大鼠卵巢TSHR表達及與TNF-α、IL-6的關系

周換麗，孫燕，鄧大同，王佑民

目的 探討甲狀腺功能減退大鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）及促黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌激素（E）、孕激素（P）水平變化，并檢測大鼠卵巢中促甲狀腺激素受體（TSHR）的表達，了解TSHR是否與TNF-α和IL-6細胞因子的變化存在關聯(lián)。方法 10只雌性SD大鼠分為2組，正常組（n=5）及甲減組（n=5），正常組飲用自來水，甲減組飲用0.05%丙硫氧嘧啶（PTU）水誘導成年期甲狀腺功能減退大鼠模型。8周后采用ELISA法測定大鼠三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、促甲狀腺激素（TSH）水平及各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P水平，并通過免疫組化檢測卵巢TSHR的表達。結果 ①與正常組比較，甲減組TNF-α、IL-6升高（P＜0.01）；②與正常組比較，甲減組LH、FSH水平升高（P＜0.05），E、P水平降低（P＜0.05）；③甲減組大鼠卵巢原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡中TSHR表達強度較正常組差異無統(tǒng)計學意義。甲減組大鼠卵巢黃體組織中TSHR表達強度高于正常組（P＜0.05）；④TNF-α、IL-6與黃體中TSHR有線性正相關性（P＜0.05）。結論 TSHR在甲狀腺功能減退大鼠卵巢黃體中表達增強，可能與炎性因子TNF-α、IL-6存在關聯(lián)。

甲狀腺功能減退；卵巢；TNF-α；IL-6

網(wǎng)絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.012.html

內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間有著雙向作用，內(nèi)分泌系統(tǒng)通過合成和釋放特殊激素，調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，而與此同時，免疫系統(tǒng)可通過釋放細胞因子，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)［1］。促甲狀腺激素受體（thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR）作為促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）的受體，已被證實不僅僅存在于甲狀腺組織，在牛、大鼠卵巢以及人子宮內(nèi)膜和卵巢中都發(fā)現(xiàn)活性TSHR的存在［2-5］，證實TSHR在生殖調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色。研究［6-7］表明，甲狀腺功能減退可以引起腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素6（interleukin-6，IL-6）細胞因子水平的變化。TSHR作為激素受體，在甲狀腺功能減退大鼠卵巢內(nèi)是否發(fā)生變化，是否與TNF-α、IL-6有關聯(lián)，兩者關聯(lián)是否是甲狀腺功能減退導致不良妊娠結局的又一機制，值得探討。該實驗通過建立甲狀腺功能減退大鼠模型，測定大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及相關黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌激素（estrogen，E）、孕激素（progestin，P），并通過檢測甲狀腺功能減退大鼠卵巢TSHR的表達，初步探討TSHR在甲狀腺功能減退大鼠卵巢中的表達及其是否與TNF-α、IL-6細胞因子的變化有關，為甲狀腺功能減退通過免疫系統(tǒng)在卵巢水平影響生殖系統(tǒng)功能提供新的探索思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物 SPF級6周齡SD雌性大鼠10只，購自安徽醫(yī)科大學動物實驗中心；于安徽醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心喂養(yǎng)，每籠5只，溫度（22±2）℃，晝夜循環(huán)，所有動物自由進食、飲水。實驗過程遵循安徽醫(yī)科大學實驗用動物管理和使用指南。

1.2試劑與儀器 主要試劑：丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）（美國 Sigma公司）；三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxin，T4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P ELISA試劑盒（上海源葉生物技術有限公司）；TSHR抗體：兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。主要儀器：酶標儀RT-6000（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；離心機JW3021HR（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；電熱恒溫箱DNP-9052BS-Ⅲ（上海三發(fā)科學儀器有限公司）；-80℃冰箱（合肥美菱股份有限公司）；OLYMPUSBX53顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3動物模型設計 10只SD雌性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組，正常組（n=5）及甲減組（n=5），正常組飲用自來水，甲減組飲用0.05% PTU水，共8周［8］。后采用陰道分泌物涂片法根據(jù)細胞的變化特點判斷大鼠發(fā)情周期，大鼠發(fā)情周期為4～5 d，避開大鼠發(fā)情前期及發(fā)情期，于大鼠發(fā)情后期及發(fā)情間期取材。

1.4標本制備 血清：水合氯醛0.3 ml/100 g體重，腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心20 min后取血清置于-80℃冰箱保存待測T3、T4、TSH及TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P。卵巢組織：腹腔麻醉后，打開大鼠腹腔，沿著大鼠Y型子宮，找到位于輸卵管兩端的卵巢，用生理鹽水沖洗后，放置于中性福爾馬林液固定，包埋后，送至病理科，連續(xù)4μm石蠟切片。

1.5甲狀腺激素測定 大鼠血清T3、T4、TSH及TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P通過ELISA法測定，具體按試劑盒說明書操作。

1.6TSHR的檢測 采用免疫組化SP法操作：①烤片，60℃、2 h；②常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、100%酒精5 min、95% 酒精5min、75%酒精5min；③抗原修復：置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中，煮沸后，高壓修復1 min 40 s，自然冷卻30 min以上，再用冷水沖洗，PBS沖洗3次，每次3 min；④阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑤正常羊血清工作液封閉，37℃、10 min，傾去勿洗；⑥滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑦滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑧DAB反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木精復染、藍化、常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。在光學顯微鏡觀察拍照，放大倍數(shù)400，所有攝片在同等參數(shù)下進行，采用Image-Pro plus 6.0系統(tǒng)測平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，正態(tài)分布計量資料數(shù)據(jù)以ˉx±s描述，兩組間均數(shù)比較用t檢驗；TNF-α、IL-6與TSHR的相關關系采用線性相關分析，進一步采用多元逐步回歸分析判斷相關因素顯著性。

2　結果

2.1兩組甲狀腺功能水平 PTU飲用水誘導雌性大鼠8周后，PTU誘導組大鼠出現(xiàn)行動緩慢、毛色發(fā)黃、脫毛等現(xiàn)象，且兩組大鼠血清結果顯示，與正常組比較，甲減組T3、T4明顯降低（P＜0.01），TSH升高（P＜0.05），甲狀腺功能減退模型造模成功。見表1。

表1　兩組甲狀腺功能水平比較

表1　兩組甲狀腺功能水平比較

與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項目甲減組（n=5）　正常組（n=5）　t值　P值T3（ng/ml）　68.50±7.24**82.27±3.44　-3.842　0.005 T4（μg/L）　118.45±16.79**　151.56±10.19　-3.769　0.005 TSH（μIU/L） 1 363.50±221.41*1 086.00±100.39　2.552　0.034

2.2兩組TNF-α、IL-6及性激素水平比較 與正常組比較，甲減組TNF-α、IL-6水平顯著升高（P＜0.01）。LH、FSH水平升高（P＜0.05），E、P水平降低（P＜0.05）。

表2　兩組TNF-α、IL-6及性激素水平比較（xˉ±s）

表2　兩組TNF-α、IL-6及性激素水平比較（xˉ±s）

與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項目甲減組（n=5）　正常組（n=5）　t值　P值TNF-α（ng/ml）254.060±50.440**140.650±30.550　4.300　0.003 IL-6（ng/ml）　182.260±10.010**146.360±8.600　6.080　0.000 LH（ng/L）　20.001±2.759*　15.288±1.791　3.204　0.013 FSH（IU/L）　11.449±2.298*　7.134±0.790　4.017　0.010 E（ng/L）　22.119±1.846**　33.182±5.640　-4.166　0.003 P（pmol/L）　566.990±89.946*733.150±92.412-2.881　0.020

2.3兩組卵巢TSHR表達水平 正常組大鼠卵巢組織中，TSHR表達在卵巢上皮細胞胞質（圖1A1）、原始卵泡的卵母細胞（圖1B1）、初級卵泡的顆粒細胞及卵母細胞（圖1C1）、次級卵泡的顆粒細胞及卵母細胞（圖1D1）、黃體顆粒細胞（圖1E1）中；甲減組大鼠TSHR表達部位差異無統(tǒng)計學意義，卵巢上皮細胞胞質（圖1A2）、原始卵泡的卵母細胞（圖1B2）、初級卵泡的顆粒細胞及卵母細胞（圖1C2）、次級卵泡的顆粒細胞及卵母細胞（圖1D2）、黃體顆粒細胞（圖1E2）。甲減組TSHR表達在原始卵泡，初級卵泡及次級卵泡中表達差異無統(tǒng)計學意義，在黃體細胞中表達強度高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

圖1　正常大鼠及甲狀腺功能減退大鼠卵巢組織　TSHR的表達 SP×400A：大鼠卵巢上皮細胞；B：原始卵泡（箭頭所指為原始卵泡）；C：初級卵泡（箭頭所指為初級卵泡）；D：次級卵泡；E：黃體；1：正常組；2：甲減組

表3　兩組卵巢組織原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和黃體　TSHR表達強度比較

表3　兩組卵巢組織原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和黃體　TSHR表達強度比較

與正常組比較：*P＜0.05

項目甲減組正常組　t值P值原始卵泡0.002 2±0.000 70　0.001 5±0.000 48　-1.612　0.146初級卵泡　0.018 5±0.008 58　0.009 2±0.006 57　-1.493　0.210次級卵泡　0.048 1±0.012 09　0.085 5±0.003 55　2.031　0.060黃體細胞　0.104 9±0.012 82*0.090 0±0.006 15　2.346　0.047

2.4TNF-α、IL-6與黃體組織TSHR的關系TNF-α與TSHR呈正線性相關性，差異有統(tǒng)計學意義（r=0.841，P＜0.01）；IL-6也與 TSHR呈正線性相關性，差異有統(tǒng)計學意義（r=0.648，P＜0.05）。進一步采用多元逐步回歸，分析可能對TSHR（Y）表達有影響的因素TNF-α（X1）、IL-6（X2）、T3（X3）、T4（X4）、TSH（X5）、FSH（X6）、LH（X7）、E（X8）、P（X9），其中X為參與多元回歸的自變量，P為多元復相關顯著性，R為復相關系數(shù)，β為標準偏回歸系數(shù)。建立回歸方程：Y=0.069+0.000X1，TNF-α與TSHR有顯著相關性（P＜0.05，R=0.841，β= 0.841）。

3　討論

內(nèi)分泌器官通過分泌特定激素，參與生殖調(diào)控。下丘腦、垂體、甲狀腺、腎上腺以及卵巢功能的失常可以導致女性生殖系統(tǒng)調(diào)控的紊亂［9］。甲狀腺功能減退是生育期婦女常見的內(nèi)分泌疾病，可以導致不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長發(fā)育受限和低體重兒等不良妊娠結局［10-11］。探討甲狀腺功能減退影響生殖器官功能的機制對于臨床更好地防治不良妊娠的發(fā)生有著重要意義。

甲狀腺功能減退影響下丘腦-垂體-卵巢軸的功能，涉及的機制有：甲狀腺激素分泌減少，反饋抑制促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin-releasing hormone，TRH）分泌的作用降低，隨著TRH分泌增加，促使泌乳素、FSH以及黃體生成素（luteinizing hormone，LH）分泌增加，從而導致卵巢調(diào)節(jié)功能紊亂［12］。TSHR作為TSH受體，同卵泡刺激素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）及黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）同屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，能夠被異源二聚體糖蛋白激素（TSH、FSH、LH、HCG）激動，這些異源二聚體糖蛋白激素有相同的GPA1亞基，與不同的β亞基（分別為TSHβ、FSHβ、LHβ、CGβ）結合后形成不同的糖激素蛋白，發(fā)揮不同的生理作用［13］。

研究［13］顯示，一種新的異源二聚體糖蛋白激素thyrostimulin成為G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的一員，能夠與TSHR結合，在體內(nèi)外發(fā)揮作用。TSHR不僅僅存在于甲狀腺組織中，高親和力的TSH結合位點以及TSHR轉錄還存在于淋巴細胞、棕色脂肪組織以及紅細胞，證實TSHR在免疫、產(chǎn)熱及局部血液循環(huán)調(diào)控中扮演著重要角色。在非成熟SD大鼠卵巢組織內(nèi)，卵母細胞表達thyrostimulin，顆粒細胞表達TSHR，兩者構成旁分泌內(nèi)環(huán)境，thyrostimulin與TSHR結合后使得細胞內(nèi)cAMP含量及c-fos蛋白含量增加，進而調(diào)控細胞的生長、發(fā)育和分化。該作用被促性腺激素加強，促性腺激素通過增加細胞內(nèi)cAMP的含量，使得TSHR表達增加。而雌激素作用相反，使得 TSHR表達下降［3］。

本研究顯示，甲減組大鼠體內(nèi)FSH、LH水平增加，E、P水平降低，而卵巢黃體組織中TSHR的表達較正常組強，推測機制可能為：①甲狀腺功能減退使得體內(nèi)FSH及LH增加，促性腺激素水平增加，通過激活cAMP，增加TSHR的表達；②甲狀腺功能減退，體內(nèi)肝臟合成性激素結合蛋白下降，降低體內(nèi)雌激素水平，導致TSHR表達增加。卵巢組織中黃體細胞的形成及退化的調(diào)控機制十分復雜，不僅僅通過激素調(diào)控，且免疫系統(tǒng)包括淋巴細胞、吞噬細胞、單核細胞、中性粒細胞及細胞因子TNF-α及IL-6在此發(fā)揮重要作用。

研究［14］顯示，在牛的整個性周期中TNF存在于黃體，尤其在黃體衰退時期表達和分泌增加。TNF-α不僅由黃體細胞合成，還由巨噬細胞和T淋巴細胞分泌。TNF-α受體表達于類固醇合成細胞及內(nèi)皮細胞。類固醇合成細胞，內(nèi)皮細胞及T淋巴細胞之間的相互作用在黃體溶解中扮演重要角色。而用IL-4、IL-5、IL-6等處理黃體顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)使得皮質酮轉化為皮質醇的1型11羥類固醇脫氫酶（11-β-hydroxysteroiddehydrogenasetype1，11β-HSD）活性增加，功能性黃體中1型11β-HSD活性增強，增加了黃體內(nèi)在皮質醇的含量，抑制了局部免疫細胞的功能，進而影響了免疫細胞在黃體形成及退化中的作用。

研究［15］表明，甲狀腺功能減退大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6等細胞因子水平升高。進而設想，甲狀腺功能減退是否通過改變體內(nèi)細胞因子水平從而影響卵巢組織內(nèi)細胞的生長、發(fā)育和分化，該作用是否與卵巢組織中TSHR表達異常關聯(lián)？本研究結果提示，在甲狀腺功能減退大鼠體內(nèi)TNF-α，IL-6水平增加，與研究［15］結果一致。甲狀腺功能減退大鼠卵巢原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡中TSHR表達與正常組差異無統(tǒng)計學意義，但黃體組織中TSHR的表達較正常組強，TNF-α及IL-6水平升高與TSHR表達增加一致，TNF-α與TSHR顯著正相關性。表明甲狀腺功能減退可能通過影響免疫系統(tǒng)及卵巢黃體組織中TSHR表達，進而影響生殖系統(tǒng)功能。但兩者間關聯(lián)的具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，在甲狀腺功能減退狀態(tài)下，體內(nèi)炎性細胞因子表達水平增加，TSHR在黃體中表達增加，兩者可能導致卵巢組織中局部免疫環(huán)境改變，影響生殖系統(tǒng)功能。

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The TSHR expression on ovary in hypothyroid rats and their relationship w ith TNF-αand IL-6

Zhou Huanli，Sun Yan，Deng Datong，et al
（Dept of Endocrinology，Institute of Endocrinology and Metabolism，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To detect the TNF-α，IL-6 and sex hormones in hypothyroid rats，throughmeasuring the expression of thyroid-stimulating hormone receptor（TSHR）in ovary of hypothyroid rats to know if TSHR has relationship with TNF-αand IL-6.Methods 10 ratswere divided into 2 groups，the control group（n=5）which ratswere fed with normalwater and hypothyroid group（n=5）which were fed with 0.05%propyl thiouracil（PTU）in drinking water.After 8 weeks，the levels of serum TNF-αand IL-6 of each group weremeasured aswell as the immunohistochemical expression of TSHR on the ovary.Results ①The hypothyroid group had the higher levels of TNF-α，IL-6（P＜0.01）compared to the control group；②The hypothyroid group had the higher levels of LH，F(xiàn)SH（P＜0.05）and lower E，P（P＜0.05）compared to the control group；③The expression of TSHR in primordial follicles，primary follicles and secondary follicles in hypothyroid group presented no statistical significance compared to the control group while the level of TSHR in corpus luteum in hypothyroid group was higher than that in the control group（P＜0.05）；④TNF-αand IL-6 had positive linear correlation with TSHR expressed in corpus luteum（P＜0.05）.Conclusion The high expression of TSHR on corpus luteum of ovarymay has relationship with TNF-αand IL-6.

hypothyroid；ovary；TNF-α；IL-6

R 581.2；R 339.221

A

1000-1492（2016）05-0633-05

2016-01-18接收

公益性行業(yè)專項基金項目（編號：201402005）；安徽省自然科學基金項目（編號：1608085MH207）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科、安徽省內(nèi)分泌代謝

病省級實驗室，合肥 230022

周換麗，女，碩士研究生；

王佑民，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：youminwang@21cn.com