沙門菌定性檢驗(yàn)方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)分析

郭曉煥駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所，河南駐馬店　463000

沙門菌定性檢驗(yàn)方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)分析

郭曉煥
駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所，河南駐馬店463000

目的探究沙門菌定性檢驗(yàn)方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。方法選取駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所2015年1月—2016年2月間以“食品藥品鑒定系統(tǒng)能力驗(yàn)證計(jì)劃”所提供的15件考核樣品為對(duì)象，針對(duì)原始標(biāo)本，利用BPW進(jìn)行前增菌，采用TTB和SC實(shí)施二次增菌?；诖?，通過(guò)3種分離培養(yǎng)基，鑒定分離培養(yǎng)。同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對(duì)比分析前增菌和二次增菌后的增菌效果。結(jié)果基于分離培養(yǎng)方法作用下，15件考核樣品中有12件樣品可檢測(cè)到沙門菌。基于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法作用下，15件考核樣品中有14件樣品可檢測(cè)到沙門菌。結(jié)論在優(yōu)化沙門菌檢測(cè)方案的基礎(chǔ)上，特別是篩查大規(guī)模樣本或監(jiān)測(cè)時(shí)，前增菌后直接進(jìn)行檢測(cè)，或者利用SC二次增菌后鑒定分離培養(yǎng)，有助于減少工作量，減低資源浪費(fèi)。

沙門菌；檢驗(yàn)方法；關(guān)鍵環(huán)節(jié)

［Abstract］Objective To explore the key qualitative test method of salmonella.Methods Zhumadian City Food and drug inspection and the January 2015— Fcbrnany 2016 are provided by the food and drug identification system capacity verification plan 15 examination sample selection as the object，the original specimens，use BPW of pre enrichment and using TTB and SC implementation secondary enrichment.Based on this，through three kinds of separation medium，were isolated and identified.At the same time，by real-time fluorescent quantitative PCR，analysis and comparison to increase bacteria and secondary enrichment increased bacterial.Results Based on the methods of isolation and culture under the action of 15 assessment samples of 12 samples were detected salmonella.Based on the method of real-time fluorescence PCR detection under the 15 assessment samples of 14 samples were detected salmonella.Conclusion In Salmonella detection scheme based optimization，especially large-scale screening of samples or monitoring，pre enrichment direct detection，or using SC second increase bacteria isolation and identification of culture，it can help to reduce the workload and reduce the waste of resources.

［Key words］Salmonella；Test method；Key link

目前，全球食源性疾病呈現(xiàn)出日漸流行趨勢(shì)，致使食品完全問題逐漸得到社會(huì)各界的關(guān)注與重視，然而，沙門菌是導(dǎo)致食源性疾病的關(guān)鍵致病菌，且檢測(cè)方案的可行性與監(jiān)測(cè)敏感性存在密切聯(lián)系。針對(duì)我國(guó)，衛(wèi)生部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（即行標(biāo)）和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/ T4789.4-2010（即國(guó)標(biāo)）是沙門菌分離鑒定的兩大方法［1］。其中，行標(biāo)主要用于檢測(cè)臨床標(biāo)本，國(guó)標(biāo)主要用于檢測(cè)食品來(lái)源標(biāo)本。對(duì)于國(guó)標(biāo)，需對(duì)檢測(cè)標(biāo)本實(shí)施二次增菌，且需以2個(gè)溫度條件和2種增菌液為前提，具有操作復(fù)雜等特點(diǎn)［2］。鑒于此，如何提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)效率，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，成為學(xué)者研究的話題。為此，此文選取駐馬店市食品藥品檢驗(yàn)所2015年1月—2016年2月以 “食品藥品鑒定系統(tǒng)能力驗(yàn)證計(jì)劃”所提供的15件考核樣品為對(duì)象，對(duì)比分析了沙門菌檢驗(yàn)方法，取得了一定成效，現(xiàn)將相關(guān)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1樣品

以“食品藥品鑒定系統(tǒng)能力驗(yàn)證計(jì)劃”所提供的15件考核樣品為對(duì)象，所以樣品均為凍干狀，是一種白色微球，且3 mm左右是其直徑。

1.2儀器與試劑

①儀器：熒光定量PCR儀；②試劑：緩沖蛋白胨水；四硫酸鈉煌綠增菌液；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液；木糖賴氨酸膽酸鹽瓊脂；亞硫酸鉍；三糖鐵瓊脂；科瑪嘉沙門顯色瓊脂；診斷血清；VITEK生化試劑。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定 在PT要求指導(dǎo)下，以國(guó)標(biāo)方法為依據(jù)，開展檢驗(yàn)工作。①前增菌：基于無(wú)菌操作下，取BPW1ml，待完全溶解樣品后，將BPW添加至10 mL，以36℃1℃為基準(zhǔn)，8～18 h為培養(yǎng)時(shí)間。②增菌：輕輕晃動(dòng)經(jīng)培養(yǎng)的樣品混合物，取1 mL放置于10 mLTTB中，以42℃1℃為基準(zhǔn)，18～24 h為培養(yǎng)時(shí)間。與此同時(shí)，取1 mL放置于10 mLSC中，以36℃1℃為基準(zhǔn)，18～24 h為培養(yǎng)時(shí)間。③分離：各取1環(huán)上述2種增菌液，分別放置于BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板和CAS顯色平板上，基于36℃1℃下，培養(yǎng)18～24 h。對(duì)平板上的菌落生長(zhǎng)狀況、典型菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。④生化試驗(yàn)：分別挑取2個(gè)以上的典型或可疑菌落，將其接種于三糖鐵瓊脂上，在斜面劃線基礎(chǔ)上，進(jìn)行底層穿刺。針對(duì)接種針，可不滅菌，直接將其接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，以36℃1℃為基準(zhǔn)，18～24 h為培養(yǎng)時(shí)間。基于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板下，對(duì)可疑菌落進(jìn)行挑取，以VITEK2 Compact操作手冊(cè)為指導(dǎo)，開展試驗(yàn)工作，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。若符合生化三塘初篩，則利用VITEK系統(tǒng)，實(shí)施生化鑒定。在此基礎(chǔ)上，借助沙門多價(jià)血清凝集實(shí)驗(yàn)，對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行判定。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR方法 ①制備模板DNA：取1 mL每種增菌液，以8 000 rpm/min為指標(biāo)，離心5 min，待除去上清后，添加DEPC1mL，并洗滌沉淀。以8000rpm/min為指標(biāo)，離心5 min，待除去上清后，添加100DEPC水，基于沸水下，進(jìn)行10 min的加熱。以12 000 rpm/min為指標(biāo)，離心10 min，待除去上清后，以供備用。②熒光PCR反應(yīng)：12.52PCR反應(yīng)混合物屬于25反應(yīng)體系范疇，0.2為上、下游引物，2為模板DNA。PCR反應(yīng)條件：基于95℃下10 min，95℃下15 s，60℃下1 min，以40個(gè)循環(huán)為標(biāo)準(zhǔn)。每一樣本均表現(xiàn)出S型擴(kuò)增曲線，其菌液濃度隨著Ct值的增加而減小。同時(shí)，Ct值處于10～35范圍內(nèi)，標(biāo)志著診斷為陽(yáng)性，反之，則為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

2　結(jié)果

2.1分離培養(yǎng)方法檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)BPW前增菌，所有培養(yǎng)液表現(xiàn)出不同程度上的混濁現(xiàn)象，說(shuō)明存在菌落。通過(guò)TTB和SC二次增菌，相較于前增菌，樣品的培養(yǎng)管差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，15件樣品中有12件樣品存在典型菌落。樣品種菌落分布，見表1。

表1　樣品種菌落分布

2.2基于前增菌和二次增菌條件下，對(duì)比2種增菌液增菌效果

針對(duì)不同增菌液二次增菌后增菌效果，如表2所示。

表2　不同增菌液二次增菌后增菌效果對(duì)比

3　討論

沙門菌，是一種食源性致病菌，較為常見。目前，國(guó)標(biāo)檢測(cè)屬于常用的檢測(cè)方法，其需較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，一般情況下，需4～5 d，且需滿足2種增菌液和2個(gè)溫度培養(yǎng)條件，大大增加了人力、物力和材料的耗費(fèi)［3］。

此研究以 “食品藥品鑒定系統(tǒng)能力驗(yàn)證計(jì)劃”所提供的15件樣品為對(duì)象，樣品來(lái)源具有較強(qiáng)的可靠性，在確定初始濃度的前提下，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)增菌條件提供存在濃度差異的樣品。同時(shí)，此研究利用熒光PCR檢測(cè)方法［4］對(duì)2種菌液增菌效果進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，在檢測(cè)細(xì)菌DNA精確定量的基礎(chǔ)上，對(duì)菌液的濃度和增殖效率進(jìn)行正確反映，其靈敏度、特異性與可靠度均較高，相較于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，其具有有效區(qū)分增菌效果差異的作用。與其他相關(guān)報(bào)道［6］結(jié)果基本一致，該占比達(dá)到72.13%。

一般而言，食品樣品自身存在物理性質(zhì)，且蘊(yùn)藏一定量的致病菌，加之受到諸多雜菌影響，易導(dǎo)致常規(guī)檢測(cè)結(jié)果存在誤差，影響檢測(cè)正確率?；贐PW作用下［7］，對(duì)樣品實(shí)施富集增菌培養(yǎng)，以達(dá)到維持或降低增菌液中pH值的目的，控制雜菌迅速生長(zhǎng)繁殖，促使靶菌得以增殖。然而，針對(duì)受到物理?yè)p傷的樣品，例如，冷傷、輻射等，其菌體修復(fù)增殖效果并不顯著，只有通過(guò)二次增菌，例如，TTB、SC等，以滿足沙門菌平板分離的靈敏度需求［8］。

提高沙門菌檢測(cè)敏感度的關(guān)鍵在于有效增菌，對(duì)于食物中毒溯源的病原菌，通過(guò)前增菌后直接檢測(cè)，促使其更具科學(xué)性與實(shí)用性［9］。因?yàn)?，食物中毒案例中所涉及的留樣食品，其與受到低污染的自然食品存在差異，其含有大量致病菌，增加檢測(cè)難度［10］。此研究樣板數(shù)量較少，導(dǎo)致研究存在局限性。因此，為提高沙門菌檢測(cè)質(zhì)量，還需相關(guān)人員進(jìn)一步研究沙門菌定性檢測(cè)方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

［1］孫康德，李潔瓊，陳福祥，等.食源性沙門菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷及鼠傷寒沙門菌同源性分析 ［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27（11）：913-916.

［2］武利平.光纖倏逝波生物傳感器快速檢測(cè)水中沙門菌和腸炎沙門菌的方法研究［D］.北京：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，2014.

［3］張秀芹.飼料中沙門菌快速檢測(cè)方法的建立及其分離株的耐藥性與致病性分析［D］.長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2014.

［4］鄭秋月，戰(zhàn)曉微，肖珊珊，等.沙門氏菌MALDI-TOF MS分型方法建立［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2014，30（10）：1344-1347.

［5］於穎，王文靜，陸曄.PMA-qPCR定量檢測(cè)畜禽肉類中沙門菌活菌的研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，30（05）：500-506.

［6］曲梅，張新，呂冰，等.沙門菌定性檢驗(yàn)方法關(guān)鍵環(huán)節(jié)評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014（19）：2743-2745，2749.

［7］祝儒剛，宋立峰.肉及肉制品中沙門氏菌活細(xì)胞的PCR檢測(cè)研究［J］.食品科學(xué)，2012.33（16）：199-203.

［8］王宇，靳偉東，蘭凱，等.熒光定量PCR技術(shù)在臨床微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2015，6（30）：151-152.

［9］程潔萍，譚翰清，朱穎梅.TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)奶粉中沙門氏菌的研究［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2015，15（10）：1165-1168.

［10］潘玉輝，李玉，蔡秀芝，等.幾種主要食源性致病菌熒光定量PCR快速檢測(cè)方法的建立［J］.醫(yī)學(xué)信息，2015，28 （25）：78-79.

Analysis of Key Qualitative Test Method of Salmonella

GUO Xiao-huan
Zhumadian Municipal Food and Drug Inspection Institute，Zhumadian，Henan Province，463000 China

R378

A

2096-1782（2016）07-0123-03

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.07.123

郭曉煥（1974.11-），女，河南駐馬店人，本科，微生物檢驗(yàn)技術(shù)中級(jí)，專業(yè)方向：微生物檢驗(yàn)。

2016-04-05）（

2016-04-05）