灰樹花多糖的分離純化及體外抗肝癌作用研究

張媛媛，孟夢(mèng)，王明飛，王春玲（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

基礎(chǔ)研究

灰樹花多糖的分離純化及體外抗肝癌作用研究

張媛媛，孟夢(mèng)，王明飛，王春玲*
（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

利用超聲破碎、水提醇沉、葡聚糖凝膠過濾層析等方法，對(duì)灰樹花子實(shí)體多糖進(jìn)行分離得到多糖組分GFD-1。高效液相色譜分析表明，GFD-1是分子量為29.574 kDa的多糖均一組分。利用顯色試驗(yàn)、紫外光譜、紅外光譜及原子力顯微鏡分析，GFD-1為不含還原性羰基、酚羥基、游離或結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)的非淀粉類α-吡喃多糖，其糖鏈高度在0.5nm～1nm。GFD-1能夠顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，并呈劑量依賴關(guān)系，IC50為94 μg/mL，但其對(duì)于正常肝臟細(xì)胞L-02無明顯影響；通過AO/EB雙染，經(jīng)GFD-1作用的HepG2細(xì)胞呈典型凋亡形態(tài)學(xué)特征；經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，HepG2細(xì)胞被阻遏在S期。上述結(jié)果可知，初步確定分離純化的GFD-1是一種具有抗腫瘤活性的均一多糖組分，為開發(fā)天然抗腫瘤物質(zhì)和進(jìn)一步分析其抗腫瘤作用機(jī)制提供了參考。

灰樹花；多糖；分離純化；抗腫瘤

灰樹花［Grifola frondosa（Dicks，ex Fr）S.F.Gray］，又名貝葉多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈、蓮花菌等，日本稱之舞茸［1］，美國(guó)稱之林雞，隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬，其肉質(zhì)脆嫩，味如雞絲，營(yíng)養(yǎng)豐富，且含有生物活性物質(zhì)，能烹調(diào)出各種美味菜肴，是近年來開發(fā)的一種研究?jī)r(jià)值的食藥兩用菌。由于其產(chǎn)量大、栽培簡(jiǎn)單，目前在全球各地廣泛分布［1］。上世紀(jì)80年代以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從灰樹花菌絲體和子實(shí)體中提取了包括MT-2、MD-組分、D-組分、Grifolan、X-組分和LELFD在內(nèi)的數(shù)十種活性多糖，結(jié)果表明其具有明顯的生理活性［2］，主要包括抗腫瘤、抗HIV病毒、降血糖及增強(qiáng)免疫力功能［3-4］等，已成為生物學(xué)、藥學(xué)和食品科學(xué)等各研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的疾病，其死亡率僅次于心血管疾病，因此對(duì)腫瘤的研究一直是醫(yī)藥學(xué)重點(diǎn)內(nèi)容之一。肝細(xì)胞癌（HCC）是死亡的第三大常見原因癌［5］，手術(shù)僅能治療很小一部分患者的病癥，而如此高的死亡率及低治愈率，使得找到有效預(yù)防及治療肝癌的控制劑變得十分必要?，F(xiàn)階段對(duì)灰樹花多糖的抗腫瘤活性研究主要集中于肺癌、卵巢癌［6］、膀胱癌等作用；但針對(duì)抗肝癌活性研究的報(bào)道還較少。本研究分離純化出一種具有明顯抗肝癌（HepG2）活性的均一灰樹花多糖組分GFD-1，并集中對(duì)其結(jié)構(gòu)和抗肝癌活性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步深入研究其構(gòu)效關(guān)系和生物活性提供一定的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

灰樹花子實(shí)體：購(gòu)自浙江慶元黃田食用菌種植基地；人體正常肝細(xì)胞L-02：購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，天津科技大學(xué)食品衛(wèi)生與安全研究室保存；人體肝癌細(xì)胞株HepG2：天津醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)，天津科技大學(xué)食品安全與衛(wèi)生研究室保存。

VECTOR22傅立葉變換紅外光譜儀：德國(guó)布魯克儀器公司；LGJ35冷凍干燥機(jī)：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠；高效液相色譜儀：日本島津；TS100倒置相差顯微鏡：日本Nikon；MK-3酶標(biāo)儀：Thermo。

1.2試劑

葡聚糖凝膠、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、核糖核酸酶溶液：Sigma；杜爾伯科改良伊格爾高糖培養(yǎng)基：Hyclone；胎牛血：Gibco；碘化丙啶（PI）、溴化乙錠（EB）、吖啶橙（AO）：Amresco；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1灰樹花子實(shí)體多糖的提取

取灰樹花子實(shí)體烘干、粉碎，將其粉末溶于80℃熱水（料液比1∶20，g/mL）超聲60 min；90℃熱水浸提10 h，將提取液以7 000 r/min離心10 min；重復(fù)離心兩次收集上清，將溶液濃縮至原溶液體積的2/5～3/5后加入3倍體積80%乙醇，4℃過夜，醇沉；將此溶液7 000 r/min離心20 min，收集醇沉物，經(jīng)無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌后冷凍干燥得子實(shí)體多糖粗品。

1.3.2灰樹花子實(shí)體多糖的分離純化

取灰樹花粗多糖溶于水，采用Sevage法脫蛋白，將脫色后的多糖溶液裝于超濾杯中，以0.2 MPa左右的壓力通過截留分子量為10 kDa的超濾膜，將超濾杯中的溶液繼續(xù)以0.2 MPa左右的壓力通過截留分子量為50 kDa的超濾膜繼續(xù)超濾，收集兩組分即粗略制得分子量在10 kDa至50 kDa多糖溶液。多糖溶液離心，取上清經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。上樣于Sephadex-G75色譜柱（26 mm×300 mm），每10 min收集一管，利用苯酚-硫酸法測(cè)定各管多糖含量，合并洗脫峰并真空濃縮冷凍干燥，得多糖均一組分（GFD-1）。

1.3.2.1灰樹花多糖GFD-1相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

將GFD-1樣品制成10mg/mL多糖溶液，用0.22μm的微孔濾膜過濾備用，采用高效凝膠滲透色譜法（HPLC）檢測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量。選用分離葡聚糖的分子量范圍為10kD～80kDa的ShodexOHpakSB-803HQ凝膠色譜柱，以三蒸水為流動(dòng)相，調(diào)整流速為0.8 mL/min，設(shè)定柱溫30℃，待基線平穩(wěn)后，上樣10 μL，示差檢測(cè)器檢測(cè)。

1.3.2.2灰樹花多糖GFD-1理化性質(zhì)的測(cè)定

采用斐林試劑反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、硫酸咔唑反應(yīng)、碘反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、苯酚硫酸法對(duì)灰樹花多糖GFD-1組分進(jìn)行理化性質(zhì)的測(cè)定分析。

1.3.2.3紫外掃描（UV）

將多糖樣品配制成1mg/mL的溶液，在波長(zhǎng)190 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.2.4紅外光譜定性分析（IR）［7-8］

將瑪瑙研缽用蒸餾水洗凈、自然干燥，加入100 mg干燥的KBr研磨成細(xì)粉，實(shí)驗(yàn)組加入1 mg GFD-1多糖樣品混合均勻研磨至2 μm以下的顆粒。在擦拭干凈的壓片模具里放入研磨好的粉末，將其堆積成中間高、四周低的小山形，加壓約15 s制成透明薄片。以純KBr薄片為空白，測(cè)空白背景，再將試樣薄片置于光路中，測(cè)定樣品紅外光譜。

1.3.2.5原子力顯微鏡（AFM）觀察GFD-1結(jié)構(gòu)［9］

將云母片表層撕去，用乙醇及超純水進(jìn)行清洗、晾干。將多糖樣品用超純水配制成100 μg/mL的溶液點(diǎn)在云母片上，置于干燥器中晾干后，在原子力顯微鏡下觀察并在輕敲模式下記錄結(jié)果。

1.3.3灰樹花多糖GFD-1抗腫瘤活性研究

1.3.3.1細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)（MTT）［10］

待培養(yǎng)結(jié)束后，將96孔板從培養(yǎng)箱中取出，向各孔中加入0.5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，充分振蕩酶標(biāo)板使甲臜溶解；用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度A值，檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm，參比波長(zhǎng)為630 nm。

式中：A對(duì)照組為未經(jīng)GFD作用的細(xì)胞吸光度值；A試驗(yàn)組為利用GFD-1作用細(xì)胞組的吸光度值。

1.3.3.2灰樹花多糖GFD-1抗腫瘤形態(tài)學(xué)觀察（AO/ EB）雙染

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用70%的冰乙醇固定15 min，加入等體積混合的AO、EB染色液于37℃避光孵育20 min，用PBS洗去殘留染液，瀝干液體，蓋在載玻片上用LSCM觀察細(xì)胞形態(tài)變化并采集細(xì)胞圖像。

1.3.3.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期［11］

待培養(yǎng)結(jié)束后，用70%冰乙醇4℃固定18 h，用核糖核酸酶溶液（1.0 g/L）在37℃水浴中處理30 min后，加入75 μmol/L碘化丙啶（PI）250 μL，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀對(duì)著色細(xì)胞進(jìn)行分選檢測(cè)并檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為630 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1GFD-1相對(duì)分子質(zhì)量及純度鑒定

通過Sephadex G-75葡聚糖凝膠色譜圖（圖1）結(jié)果分析，以苯酚-硫酸法作洗脫曲線，洗脫曲線峰型為單一對(duì)稱峰，說明GFD-1為均一多糖。

圖1　GFD-1葡聚糖凝膠洗脫曲線Fig.1　Sephadex G-75 chromatographic separation of GFD-1

利用高效液相色譜測(cè)定GFD-1的分子量范圍，結(jié)果如圖2所示。

圖2　GFD-1高效液相色譜圖Fig.2　Analysis and detection of GFD-1 by HPLC

多糖圖譜有單一對(duì)稱主峰，峰面積比為91.57%，進(jìn)一步證明GFD-1為性質(zhì)均一的多糖類物質(zhì)，分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為Dextran系列，測(cè)得多糖分子量為29.574 kDa。

2.2GFD-1理化性質(zhì)分析

灰樹花多糖GFD-1冷凍干燥后為白色絮狀固體，易溶于沸水，可溶于稀酸、稀堿、稀鹽溶液，不溶于乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、正丁醇等有機(jī)溶劑。斐林試劑反應(yīng)陰性，說明分子中不含有游離態(tài)羰基結(jié)果；雙縮脲反應(yīng)陰性，證明了不含蛋白質(zhì)類物質(zhì)；硫酸-咔唑反應(yīng)陽性，說明含有糖醛酸；碘-碘化鉀反應(yīng)陰性，說明不含淀粉類物質(zhì)；三氯化鐵反應(yīng)陰性，說明不含酚類或鞣質(zhì)；苯酚-硫酸反應(yīng)陽性，證明為糖類物質(zhì)。上述顯色實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GFD-1為不含有還原性羰基和酚羥基的非淀粉類多糖。

2.3紫外光譜檢測(cè)

對(duì)灰樹花多糖GFD-1進(jìn)行190 nm～800 nm紫外光譜全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖3所示。

圖3　GFD-1紫外掃描圖譜Fig.3　UV scanning of GFD-1

GFD-1在199 nm有最大吸收峰，在260 nm和280 nm均無明顯的光吸收，說明GFD-1不含游離結(jié)合的蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)，此結(jié)果與雙縮脲實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

2.4紅外光譜檢測(cè)

采用傅立葉紅外光譜（FT-IR）分析GFD-1的官能團(tuán)、結(jié)構(gòu)特征、糖殘基及其構(gòu)型情況，結(jié)果如圖4。

圖4　GFD-1紅外分析圖譜Fig.4　IR spectroscopic analysis of GFD-1

圖譜中3 384 cm-1處的寬峰O-H的伸縮振動(dòng)、2 922 cm-1～2 852 cm-1是C-H的伸縮振動(dòng)，這一區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰；1 700 cm-1～1 775 cm-1處無吸收，表明樣品中沒有羧基結(jié)構(gòu)，即多糖不含有葡萄糖醛酸，是一種中性糖；1 631 cm-1～1 600 cm-1（C=O）及1 401 cm-1（C-H）處均為多糖的特征吸收峰。1 200 cm-1～1 000 cm-1間比較大的4個(gè)峰是C-O伸縮振動(dòng)，由于呋喃型糖環(huán)在此區(qū)間上只有兩個(gè)強(qiáng)吸收峰，說明GFD-1糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型；933 cm-1的吸收峰是D型吡喃葡萄糖的非對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)的特征吸收峰；β型糖苷鍵的吸收峰在890 cm-1左右處，據(jù)此推斷760 cm-1的吸收峰糖苷鍵可能為α型，以上說明灰樹花多糖GFD-1可能為α-吡喃多糖。

2.5原子力顯微鏡觀察GFD-1

原子力顯微鏡（AFM）結(jié)果如圖5所示。

圖5　GFD-1的原子力顯微鏡分析Fig.5　AFM analysis of GFD-1

可以在視野下看到縱橫交錯(cuò)的多糖GFD-1分子的多分支鏈狀結(jié)構(gòu)，形成立體多層網(wǎng)狀，證明GFD-1具有多糖分子典型的多分支結(jié)構(gòu)；并且根據(jù)AFM圖可以看出GFD-1是由長(zhǎng)度在0.5 nm～1.0 nm左右的糖鏈組成。

綜合上述結(jié)果分析可知，實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的GFD-1灰樹花多糖單一組分為分子量29 574、不含還原性羰基、酚羥基、游離或結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)、糖鏈高度在0.5 nm～1 nm左右的非淀粉類α-吡喃多糖。

2.6細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)（MTT）

利用濃度10 μg/mL～100 μg/mL的GFD-1作用于細(xì)胞48 h后，其MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6。

圖6　GFD-1對(duì)HepG2和L-02的體外抑制作用（MTT）Fig.6　Cell inhibition and proliferation tests of GFD-1 on HepG2 cells and L-02 cells（MTT）

GFD-1可明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且抑制率隨濃度的增加而增加，呈劑量依賴關(guān)系。而在此濃度范圍內(nèi)，GFD-1對(duì)人體正常肝細(xì)胞L-02生長(zhǎng)抑制較小。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GFD-1能特異性地殺滅腫瘤細(xì)胞，而對(duì)人體正常細(xì)胞的毒副作用較小。通過式（1）計(jì)算經(jīng)不同濃度的GFD-1處理細(xì)胞48 h后對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率，利用SPSS軟件分析得出其對(duì)HepG2細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）為94 μg/mL。

2.7AO/EB雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

AO染料能透過完整的細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，使細(xì)胞呈綠色熒光；EB染料只能透過受損的細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，使細(xì)胞核呈橘紅色熒光。采用94 μg/mL的GFD-1作用于HepG2細(xì)胞AO/EB雙染結(jié)果如圖7所示。

圖7　AO/EB雙染觀察GFD-1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡（40×10）Fig.7　Observation of GFD-1-induced apoptosis in HepG2 cells by AO/EB staining（40×10）

正常細(xì)胞（圖7A）胞膜完整，細(xì)胞被染成均勻的綠色熒光，無凋亡形態(tài)改變；經(jīng)GFD-1作用48 h后，細(xì)胞呈晚期凋亡形態(tài)：核染色質(zhì)固縮，被致密濃染成亮綠色或黃綠色熒光，部分細(xì)胞胞膜皺縮起泡，即出現(xiàn)凋亡小體（如箭頭所示），圖中可見部分壞死細(xì)胞呈橘紅色濃染，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)界限模糊（如箭頭所示）。AO/EB雙染結(jié)果說明，GFD-1可引起HepG2細(xì)胞發(fā)生核固縮或核碎裂等特征誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.8流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期

利用流式細(xì)胞儀對(duì)GFD-1作用的HepG2細(xì)胞進(jìn)行凋亡率及細(xì)胞周期的檢測(cè)，結(jié)果如圖8和表1所示。

圖8　GFD-1對(duì)HepG2凋亡率的影響Fig.8　Effect of GFD-1 on apoptosis and cell cycle of HepG2 cells

表1　GFD-1對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期影響Table 1　Effect of GFD-1 on apoptosis and cell cycle of HepG2 cells

由檢測(cè)結(jié)果可知，HepG2細(xì)胞經(jīng)94 μg/mL GFD-1處理48 h后，細(xì)胞凋亡率從1.89%增加至39.27%，說明GFD-1可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞周期也發(fā)生了明顯變化，與G0/G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)比例下降不同，S期細(xì)胞數(shù)比例從15.82%高至52.18%，由此判定HepG2細(xì)胞被阻斷在S期。S期在細(xì)胞周期中是進(jìn)行DNA合成的階段，說明GFD-1致使HepG2細(xì)胞不能正常合成DNA，從而抑制HepG2細(xì)胞的正常生長(zhǎng)增殖。

3　結(jié)論

通過水提醇沉、凍干、脫蛋白及超濾分離后經(jīng)過Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱色譜得到灰樹花多糖單一組份GFD-1。通過高效液相色譜證明GFD-1為性質(zhì)均一的多糖類物質(zhì)，并且測(cè)定了多糖分子量。利用顯色實(shí)驗(yàn)、紫外光譜、紅外光譜及原子力顯微鏡初步分析該均一多糖組分GFD-1為不含還原性羰基、酚羥基、游離或結(jié)合的蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)的非淀粉類α-吡喃多糖，糖鏈高度在0.5 nm～1 nm左右。

細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)（MTT）表明GFD-1在一定濃度范圍內(nèi)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞株HepG2的生長(zhǎng)，并呈時(shí)間依賴，IC50為94 μg/mL；用相同濃度GFD-1分別作用HepG2細(xì)胞和人體正常肝細(xì)胞L-02時(shí)，GFD-1對(duì)人體正常肝細(xì)胞影響較小，即GFD-1可以選擇性地抑制肝癌細(xì)胞和人體正常細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)經(jīng)GFD-1處理的HepG2細(xì)胞發(fā)生了S期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：GFD-1作用HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，即GFD-1能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

灰樹花多糖構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究，擬在本實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，對(duì)灰樹花多糖的單糖組成及其連接方式等進(jìn)行后續(xù)研究，闡明灰樹花多糖的構(gòu)效關(guān)系，從而為灰樹花多糖的深度開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

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Isolation，Purification and in Vitro Antitumor Activity of Polysaccharides GFD-1 from Grifola frondosa

ZHANG Yuan-yuan，MENG Meng，WANG Ming-fei，WANG Chun-ling
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

A polysaccharide GFD-1 from Grifola frondosa fruiting bodies had been purified by sonication，water extraction，alcohol precipitation and Sephadex gel filtration chromatograp.By HPLC，GFD-1 was a kind of polysaccharide homogeneous components and its molecular weight was 29.574 kDa.The results of the color experiment，ultraviolet spectroscopy，infrared spectroscopy and atomic force microscope analysis illustrated that GFD-1 was a kind of non-starch α-pyran polysaccharide without reductive carbonyl，phenolic hydroxyl，free or a combination protein and nucleic acid；its sugar chain height was 0.5 nm-1 nm.GFD-1 inhibited proliferation of HepG2 cells in a dose-dependent manner，the IC50of GFD-1 was 94 μg/mL；it had no significant effect on the cell viability of humor normal liver L-02 cells.Meanwhile，in the presence of with GFD-1，HepG2 cells showed typical apoptotic morphological features through the AO/EB double staining.Flow cytometry analysis suggested that HepG2 cells were repressed at the phase S by GFD-1.These results showed that GFD-1 purified from Grifola frondosa possesses anti-tumor regulation effect，serving a reference basis to develop natural anticancer drugs and further analyse the anti-tumor mechanism of GFD-1.

Grifola frondosa；polysaccharide；isolationandpurification；antitumoractivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.001

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BADB33B04）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31000768）

張媛媛（1987—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

2015-08-27