不同培養(yǎng)條件對秦皇島地區(qū)葡萄灰霉病菌菌絲生長的影響

白曉蒙，靜大鵬，李雙民，齊慧霞*

(1 河北科技師范學院生命科技學院，河北 秦皇島，066600；2 河北省懷來縣職業(yè)技術教育中心；3 河北省昌黎縣職業(yè)技術教育中心)

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不同培養(yǎng)條件對秦皇島地區(qū)葡萄灰霉病菌菌絲生長的影響

白曉蒙1,2，靜大鵬1，李雙民3，齊慧霞1*

(1 河北科技師范學院生命科技學院，河北 秦皇島，066600；2 河北省懷來縣職業(yè)技術教育中心；3 河北省昌黎縣職業(yè)技術教育中心)

為明確秦皇島地區(qū)葡萄灰霉病菌菌絲生長的適宜環(huán)境，采用不同溫度、光照、培養(yǎng)基、氮源和碳源對葡萄灰霉病菌菌絲生長進行了試驗研究。結果表明：秦皇島地區(qū)葡萄灰霉病菌絲生長的最適宜溫度是20～25 ℃，全光條件下最適宜于菌絲的生長；葡萄灰霉菌在供試的各種營養(yǎng)條件的培養(yǎng)基上均能生長，最適宜于其生長的培養(yǎng)基是脅本哲氏培養(yǎng)基；碳源和氮源試驗中，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基和以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基最適于菌絲的生長。

葡萄；灰霉?。痪z生長；秦皇島地區(qū)

葡萄灰霉病是由灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)引起的一種世界性的重要病害[1]，近年來在我國葡萄生產上的危害日漸加重。此外，灰霉菌還能危害番茄、草莓、黃瓜等多種植物，引起果實腐爛[2～4]。葡萄灰霉病菌以分生孢子及菌核在被害部位越冬，次年春季隨氣溫升高，病菌分生孢子及菌核萌發(fā)產生的分生孢子，借氣流傳播到花穗及幼果穗上進行侵染[5]。目前國內對灰霉病的研究多集中于番茄、草莓及其他作物的生物學特性、抗逆性和防控上[6～8]，而對葡萄上灰霉病病原菌的鑒定[1]、病菌的致病性[9]以及病菌的抗藥性[10]等方面鮮有研究。而秦皇島地區(qū)是我國釀酒葡萄種植的主產區(qū)之一，每年因葡萄灰霉病的發(fā)生給當?shù)仄咸焉a帶來了的損失有逐年加重的趨勢，特別是對該地區(qū)葡萄灰霉病的病菌生物學特性的研究未見報道。為此，筆者通過對葡萄灰霉病菌與溫度、光照、營養(yǎng)源等因素的關系進行試驗研究，以明確當?shù)仄咸鸦颐共【纳飳W特性，期望對于當?shù)仄咸鸦颐共〉奶镩g防控工作提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株：從秦皇島市昌黎縣中糧華夏長城葡萄酒有限公司的葡萄基地，選取葡萄為樹齡為10年、籬架勢、株行距1.5 m×2.0 m且栽培管理一致的赤霞珠(Cabernet Sauvignon)釀酒品種，從上采集帶有灰霉病菌的果實，用無菌水將葡萄表面清洗后，將果實置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至大量菌絲出現(xiàn)。然后從果實上取少量菌絲于無菌水中配置成孢懸液，接種在PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)大量菌絲。再從新生長的菌絲中取少量配置成孢懸液，再次接種培養(yǎng)。如此重復直至生長出單菌落后，鏡檢確定所生長出的菌是為灰霉病菌[11]。鑒定結束后，再次用接種環(huán)挑取灰霉病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并依據(jù)柯赫氏反接種法鑒定[12]，對培養(yǎng)出的病菌進行鑒定，明確為灰霉菌后，將純化的病原菌轉入PDA斜面培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆谩?/p>

供試培養(yǎng)基品種：燕麥片培養(yǎng)基、玉米粒培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、脅本哲氏培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基和大米汁培養(yǎng)基，共7種培養(yǎng)基備用；此外，以改良后的理查德培養(yǎng)基 (Richard medium)為基礎培養(yǎng)基，根據(jù)試驗需求進行使用，其主要成分為：KNO310 g，KH2PO45 g，MgSO42.5 g，F(xiàn)eCl30.02 g，蔗糖30 g和蒸餾水1 000 mL。

1.2試驗方法

1.2.1溫度對病原菌菌絲生長的影響將病原菌打成直徑4 mm的菌餅，接種于PDA平板培養(yǎng)基上，分別置于5，10，15，20，25，30，35，40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每處理3皿，3次重復，用十字交叉法逐日測量菌落直徑。

2.2.2不同光照條件對病原菌菌絲生長的影響在PDA平板上移入直徑4 mm的菌餅，分別置于全光，12 h光暗交替，全暗等3組光照條件下，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d，用十字交叉法逐日測量菌落直徑，每處理3皿，3次重復。

2.2.3不同培養(yǎng)基對病菌菌絲生長的影響將直徑為4 mm的病菌菌餅接種到燕麥片，玉米粒，PDA，PSA，脅本哲氏，Czapek，大米粒等7種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)及測量方法同2.2.2。

2.2.4不同營養(yǎng)條件對病菌生長的影響以改良的Richard培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以30 g蔗糖的含碳量為標準，以分子量計算，分別用相同含碳量的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖和可溶性淀粉替換蔗糖，配制成含有不同碳源的培養(yǎng)基。以10 g KNO3的含氮量為標準，以分子量計算，分別用相同含氮量的NH4NO3，(NH4)2SO4，尿素，蛋白胨替換KNO3，配制成含有不同氮源的培養(yǎng)基。接種、培養(yǎng)及測量方法同2.2.2。

1.3數(shù)據(jù)處理

應用Excel 2003版和DPS 7.05版分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并用字母標記法進行Duncan新復極差法分析。

2　結果與分析

2.1不同溫度對葡萄灰霉病病菌生長的影響

葡萄灰霉病菌在5～30 ℃的范圍內均可生長(表1)。其中，溫度在5～10 ℃范圍內菌絲生長緩慢，隨著溫度的升高和培養(yǎng)時間的延長，菌絲生長迅速加快。當葡萄灰霉菌培養(yǎng)到第3天時，在15 ℃與20 ℃下培養(yǎng)的菌絲之間無顯著差異，其他培養(yǎng)溫度下各處理間差異就已經達到極顯著水平；第4天時，15 ℃下培養(yǎng)的菌絲與20 ℃，25 ℃下培養(yǎng)的菌絲之間差異極顯著，且20 ℃和25 ℃下培養(yǎng)的菌落直徑已經達到7.35 cm和7.77 cm，基本已經長滿整個培養(yǎng)皿，而15 ℃下培養(yǎng)的菌落直徑僅為3.67 cm；在30 ℃下培養(yǎng)的菌絲則又生長緩慢，第4天時菌落直徑僅為3.75 cm，與在20 ℃和25 ℃下培養(yǎng)的菌絲相比差異達極顯著。由此可見，最適宜菌絲生長的溫度是20～25 ℃。

表1　不同溫度對葡萄灰霉病病菌生長(菌落直徑)的影響 　 cm

注：大寫字母代表0.01水平的差異情況，小寫字母代表0.05水平的差異情況。下同。

2.2不同光照條件對葡萄灰霉病病菌生長的影響

葡萄灰霉菌在全暗、光暗交替和全光的光照條件下均可生長，但不同光照處理對菌絲生長的影響比較大(表2)。其中葡萄灰霉病菌在培養(yǎng)的第2天時，不同光照處理下菌落生長直徑就已經表現(xiàn)出了顯著差異。在培養(yǎng)的第3天時，菌落生長直徑差異均達到極顯著水平。以在全光條件下菌絲生長最快，其次為在光暗交替環(huán)境下。在此二者環(huán)境條件下，菌絲在培養(yǎng)第4天時，菌落直徑達到8.40 cm；全暗的環(huán)境下菌絲生長最慢，但在第6天時菌落直徑也達到了7.10 cm。

表2　不同光照條件對葡萄灰霉病病菌生長(菌落直徑)的影響 　 cm

2.3不同培養(yǎng)基對葡萄灰霉病病菌生長的影響

脅本哲氏培養(yǎng)基最適宜葡萄灰病霉菌生長，其次是PDA，PSA，大米汁培養(yǎng)基，最不適宜的是燕麥片培養(yǎng)基(表3)。葡萄灰霉病菌在培養(yǎng)的第3天時，在玉米汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落與在脅本哲氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落相比，菌落直徑無顯著差異；在該2種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落與在其他各培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落之間存在極顯著差異。第4天時，在PDA和Cazpek培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，菌落直徑無顯著差異；燕麥片和玉米汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落，菌落直徑也無顯著差異；但與其他各培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落之間，菌落直徑存在極顯著差異。

表3　不同培養(yǎng)基對葡萄灰霉病病菌生長(菌落直徑)的影響 　 cm

2.4不同碳源培養(yǎng)對葡萄灰霉病病菌生長的影響

碳源中以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基最適合葡萄灰霉病病原菌菌絲的生長，其次是以乳糖為碳源的培養(yǎng)基，最不適合葡萄灰霉病菌的生長的是以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基(表4)。各種碳源的培養(yǎng)基中，菌絲生長速度由快到慢依次為：蔗糖，乳糖，葡萄糖，麥芽糖，可溶性淀粉。在培養(yǎng)第3天時，以乳糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑無顯著差異；其他各碳源的培養(yǎng)基間，菌落直徑差異均達到極顯著水平。第4天時，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基菌落生長最快，直徑達到7.83 cm，且與其他各處理間達到了極顯著差異。

表4　不同碳源培養(yǎng)基對葡萄灰霉病病菌生長(菌落直徑)的影響 　 cm

2.5不同氮源培養(yǎng)基對葡萄灰霉病病菌生長的影響

蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基最適合葡萄灰霉病原菌菌絲的生長，其次是以KNO3為氮源的培養(yǎng)基，最不適合葡萄灰霉病原菌菌絲生長的是以尿素為氮源的培養(yǎng)基(表5)。各種氮源的培養(yǎng)基中，菌絲生長速度由快到慢依次為：蛋白胨，KNO3，NH4NO3，(NH4)2SO4，尿素。培養(yǎng)的第3天時，除以NH4NO3與(NH4)2SO4為氮源的培養(yǎng)基和以KNO3與(NH4)2SO4為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落之間差異不顯著外，與其他氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落生長相比均達到了差異極顯著水平；培養(yǎng)的第4天時，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基和以NH4NO3為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落之間無顯著差異，在以(NH4)2SO4和KNO3為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落之間無顯著差異，但以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落生長最快，與它們之間差異達到極顯著水平。

表5　不同氮源培養(yǎng)基對葡萄灰霉病病菌生長(菌落直徑)的影響 　 cm

3　結論與討論

葡萄灰霉病菌在5～30 ℃下均可正常生長，其中溫度在20～25 ℃菌絲生長速度最快，35 ℃及以上菌絲均不能生長。這一結果與張鵬[13]葡萄灰霉病菌的研究結果基本一致，還與劉福平等[14]和徐明等[15]報道的番茄灰霉病病菌的適宜生長溫度基本一致，說明該病菌在葡萄和番茄上生長對溫度的要求并無差異。

光照對葡萄灰霉病菌菌絲生長有一定的影響。本次試驗結果表明：全光照最適宜于葡萄灰霉病菌菌絲的生長，其次是光暗交替較適宜于菌絲生長。這一結果與雷百戰(zhàn)等[16]報道光照對灰霉菌菌絲生長不大的結果存有差異；與徐明等[15]報道的番茄灰霉病病菌在黑暗條件下生長最好也存在差異的結果也存在差異，說明不同地區(qū)、不同作物上的灰霉病病菌生長對光照需求存在差異。

此外，不同的營養(yǎng)條件對葡萄灰霉病菌的生長影響不同。在供試的7個培養(yǎng)基中，脅本哲氏培養(yǎng)基最適合菌絲的生長；在碳源和氮源試驗中，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基最適合葡萄灰霉病菌的生長，最適合的氮源培養(yǎng)基是蛋白胨。但張鵬[13]的研究結果認為病菌在硝酸鈉、硫酸按作為氮源的培養(yǎng)基中生長速度要大于在蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基，這可能是由于不同地區(qū)生態(tài)條件、栽培條件等諸多因素對葡萄灰霉病菌菌株的生長特性有所影響。因此，不同地區(qū)葡萄灰霉病菌的特性與差異還待進一步探究。

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(責任編輯：朱寶昌，陳于和)

Effects of Different Culture Conditions on Mycelium Growth of Grape Gray Mould in Qinhuangdao

BAI Xiaomeng1,2,JING Dapeng1,LI Shuangmin3,QI Huixia1

(1 College of Life Science & Technology,Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao Hebei,066600;2 Vocational Education Center of Huailai County,Hualai Hebei;3 Vocational Education Center of Changli County,Changli Hebei;China)

In order to determine the suitable environment for the growth of grape gray mould in Qinhuangdao area, the different temperatures, lights, culture media, as well as nitrogen and carbon sources were used to study in this paper. The results showed that in Qinhuangdao area, the most suitable temperature ofBotrytiscinereamycelial growth ranged from 20 ℃ to 25 ℃while all-light conditions tended to be suitable for the mycelium growth. Grape gray mould could grow in all tested culture media, the most of them seemed to beWakimotoTetsujimedium. In the C- and N-source tests, both media using sucrose as carbon source and peptone as nitrogen source were better for mycelium growth.

grape;gray mould;mycelium growth;Qinhuangdao area

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.01.006

，女，碩士，教授。主要研究方向：植物病害流行及防治。E-mail: qihuix@163.com。

2016-01-11; 修改稿收到日期: 2016-02-21

S436.631.1+9

A

1672-7983(2016)01-0030-05

白曉蒙，碩士研究生。主要研究方向：葡萄病害及其防治。