響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇多糖的提取及其抑菌活性

許　瑞，李鳳英，崔蕊靜，趙希艷，郭　朔，武朋林

(河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

?

響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇多糖的提取及其抑菌活性

許瑞*，李鳳英，崔蕊靜，趙希艷，郭朔，武朋林

(河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

為確定超聲條件對杏鮑菇多糖得率的影響和評價其抑菌活性，采用響應(yīng)面法(RSM)對超聲提取杏鮑菇多糖的條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳的超聲提取條件為：提取時間82 min，提取溫度95 ℃，功率213 W，提取劑用量20 mL/g。預(yù)測得率14.5%，試驗測定值與預(yù)測值無顯著性差異(P>0.05)。通過對大腸桿菌、變形桿菌、白色鏈球菌、產(chǎn)氣桿菌、黑曲霉的抑菌試驗表明，多糖對大腸桿菌和黑曲霉有較好的抑菌活性。試驗結(jié)果表明，杏鮑菇多糖可作為潛在的功能性成分應(yīng)用于醫(yī)藥或功能性食品。

杏鮑菇多糖；提取條件；抑菌活性；響應(yīng)面法

杏鮑菇是一種可食性蘑菇，主要生長于亞洲地區(qū)、中東、歐洲地中海地區(qū)和非洲地區(qū)。杏鮑菇是平菇屬種類中最多的一種，菌肉肥厚，菌柄乳白。杏鮑菇含有可刺激免疫系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)。試驗證明，杏鮑菇中的主要成分多糖具有許多生物活性，包括抗腫瘤，抗氧化等[1]。

采用水提法從植物類物質(zhì)中提取多糖具有耗時長[2,3,4]、耗水量大[5]等缺點。近來，超聲技術(shù)應(yīng)用于植物材料中提取多糖[6]。超聲處理可提高物質(zhì)在固相和溶劑之間轉(zhuǎn)移，通過破壞細胞壁改善多糖的提取率。另一些研究報道顯示，超聲處理會對多糖產(chǎn)生有害影響，會導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的改變[7]，但是還未有報道顯示超聲處理對杏鮑菇多糖(polysaccharides from Pleurotus eryngii，PPE)的抑菌活性是否有影響。多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性有關(guān)，例如游離基清除活力。因此，超聲處理對多糖理化性質(zhì)的影響還需要做更多、更深入的研究。響應(yīng)面法可有效地發(fā)現(xiàn)在不同條件下提取PPE時各種參數(shù)的相互作用，以及這些參數(shù)對PPE得率的影響。雖然超聲提取技術(shù)已廣泛用于不同原料的提取，但是對PPE的提取還沒有文獻報道。為此，筆者探討超聲處理對PPE得率的影響及PPE的抑菌活性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

杏鮑菇購于秦皇島市昌黎縣。DPPH購于Sigma公司，其他化學(xué)品和試劑均在當(dāng)?shù)刭徺I，并全部為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1多糖提取方法杏鮑菇的菌核用體積分數(shù)為0.80的乙醇在80 ℃下回流提取2 h，共進行3次。將杏鮑菇切碎，60 ℃干燥后研磨粉碎，得到的杏鮑菇粉末4 ℃保存。每次提取都稱量5 g杏鮑菇粉末，采用超聲波清洗器(GDS-1012T，中國)在不同的超聲時間(60，80，100，120，140 min)、溫度(55，65，75，85，95 ℃)、提取劑用量(5，10，20，40，60 mL·g-1)和功率(100，200，300，400，500 W)條件下提取，所得萃取液經(jīng)Whatman Nr 1濾紙過濾，然后將濃縮濾液在50 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮，并用Sevag試劑[8]去除提取物中的蛋白。除去Sevag試劑后，在體積分數(shù)為0.95的乙醇溶液中加入提取物，4 ℃保持過夜以沉淀多糖。將沉淀物在3 000×g下離心10 min收集沉淀，然后用丙酮和石油醚沖洗并凍干，用干燥后的沉淀物計算多糖得率[3]。

1.2.2響應(yīng)面法軟件OriginPro (Version 8.0, USA)用于試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析和模型構(gòu)建。用4因素二次回歸旋轉(zhuǎn)設(shè)計來確定響應(yīng)模式，然后建立相應(yīng)的模型。本次試驗中4個變量因素分別為超聲時間(X1)、溫度(X2)、功率(X3)和提取劑用量(X4)，每個變量都為5水平，因變量為PPE的得率。方程中的代表符號和水平見表1。試驗設(shè)計中的7次重復(fù)試驗用于評估純誤差平方和，所有的試驗點均進行了3次測定。

表1　PPE提取的設(shè)計因素和水平

1.2.3抑菌性測定多糖提取物抑菌活性的測定中，測定了一些與食品相關(guān)的細菌如大腸桿菌、變形桿菌、白色鏈球菌、產(chǎn)氣桿菌、黑曲霉。各種微生物菌株的培養(yǎng)物接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細菌)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(真菌)中于4 ℃保藏。抑菌活性試驗基于紙片法[9]，將10 mg多糖粉末溶于DMSO(二甲基亞砜)體積分數(shù)為0.10的溶液中，以毫米為單位測量無菌紙片的抑菌圈直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲提取條件對PPE得率的影響

超聲功率、時間、溫度及提取劑用量對PPE得率的影響，以及它們之間的相互關(guān)系見圖1～圖6。3D曲面圖說明了自變量對因變量的主要作用和相互作用，每一個變量都表現(xiàn)出和PPE得率之間有復(fù)雜的關(guān)系。實驗結(jié)果表明，超聲時間越長，溫度越低，PPE得率就越大(圖1)；在恒定的超聲功率和某段范圍內(nèi)的溫度作用下，PPE得率隨著超聲時間延長增大到某一值后就開始降低。

當(dāng)超聲功率處于較低范圍內(nèi)時，PPE得率隨著超聲功率增加而增加(圖2)；當(dāng)超聲功率位于較大值時，會得到相反的結(jié)果。一般情況下延長超聲時間可提高提取率，但是當(dāng)使用較高的超聲功率時，PPE得率隨著超聲時間延長而降低，這可能是由于超聲波作用使得多糖發(fā)生了降解。在較高的超聲溫度下，液體的粘度和密度降低可進行快速傳質(zhì)[10,11]。并且，較高的超聲溫度會導(dǎo)致氣泡數(shù)目和表面接觸面積增加。因此，適宜的超聲溫度可提高提取效率。

當(dāng)超聲功率為200 W時，超聲溫度對PPE得率表現(xiàn)出積極的影響(圖4)；當(dāng)超聲功率為250 W時，超聲溫度有不同的作用效果。當(dāng)超聲功率較高時，超聲溫度對PPE得率表現(xiàn)出負面作用，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能的原因是超聲波和高溫對多糖的降解作用[12,13]。

提取劑用量對PPE提取率表現(xiàn)出線性作用，而超聲時間、溫度和功率表現(xiàn)出二次效應(yīng)(圖3，圖5，圖6)。圖6表明的是提取劑用量(X4)和超聲功率(X3)對PPE得率的影響。當(dāng)提取劑用量較高時，隨著超聲功率的降低，PPE得率增加至最大值，然后再降低(圖6)。但是當(dāng)提取劑用量較低時，多糖提取率表現(xiàn)為不斷上升。

綜合以上情況，增加所有4個因素在一定程度上都可以提高杏鮑菇多糖的得率，如果是采用較高提取溫度或較長提取時間，就會降低PPE得率。超聲法能夠提高多糖的得率歸因于對細胞的破壞、更好的溶劑滲透和物質(zhì)傳遞。因此，由于超聲法的高效性，超聲處理是一種理想的提取PPE的方法。

2.2模型擬合

一般情況下，響應(yīng)曲面的優(yōu)化可能會產(chǎn)生不理想或誤導(dǎo)性的結(jié)果，除非該模型表現(xiàn)出良好的擬合，這就有必要進行模型檢驗。表2為從試驗設(shè)計中得出的PPE得率的優(yōu)化條件，試驗設(shè)計中包含31次測試，每個變量的不同水平分別編碼為-γ，-1，0，+1，γ來進行統(tǒng)計分析。PPE得率的結(jié)果示于表2中，根據(jù)試驗結(jié)果，不同的提取條件下會提取出不同數(shù)量的多糖。

表示PPE得率的數(shù)學(xué)模型，是所研究區(qū)域內(nèi)的自變量函數(shù)的數(shù)學(xué)模型，以等式表示為：

Y=-179.6+0.81X1+2.61X2+0.31X3+0.32X4-0.004 8X1X2-0.000 015X1X3-

式中Y為PPE得率；X1，X2，X3，X4分別為超聲時間、溫度、功率和提取劑用量的編碼變量。

圖1　提取時間和提取溫度對PPE得率的響應(yīng)面　　　　圖2　超聲功率和提取時間對PPE得率的響應(yīng)面

圖3　提取時間和提取劑用量對PPE得率的響應(yīng)面　　　　圖4　超聲功率和提取溫度對PPE得率的響應(yīng)面

圖5　提取溫度和提取劑用量對PPE得率的響應(yīng)面　　　　圖6　超聲功率和提取劑用量對PPE得率的響應(yīng)面

表2　響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇多糖提取的試驗設(shè)計方案及結(jié)果

從變量的模型分析結(jié)果看，PPE得率和變量之間的關(guān)系是顯著的，計算得出的p值小于0.1并且相關(guān)系數(shù)為0.997(表3)。相關(guān)系數(shù)(R2)被定義為解釋變異與總變異的比值，是一種擬合程度的測定。R2值越小就表明模型中相關(guān)變量的相關(guān)性越差。當(dāng)R2趨于1時，模型可與實際數(shù)值吻合。經(jīng)方差分析，PPE得率模型的R2值為0.994 5，這表明回歸模型很好的定義了該系統(tǒng)的實際情況。

表3　響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇多糖提取的試驗結(jié)果方差分析

通過回歸模型的預(yù)測，提取PPE的最佳條件為：213 W，82 min，95 ℃和20 mL/g。在此條件下提取PPE的得率為14.1%，但是在95%置信區(qū)間內(nèi)它和預(yù)測值14.5%無顯著性差異。

統(tǒng)計分析表明，4個自變量及其二次項對PPE的得率有顯著影響，并且在X2和X3及X2和X4之間都有顯著的交互作用(P<0.01)。這些結(jié)果表明PPE提取率存在一個最大值。

表4　杏鮑菇多糖提取物的抑菌活性

2.3多糖抑菌活性

與大腸桿菌、變形桿菌和黑曲霉相比較，多糖提取物對白色鏈球菌和產(chǎn)氣桿菌表現(xiàn)出較低的抑菌活性(表4)，原因可能是這兩種微生物含有孢子，使其具有很強的抗逆性和抗藥性。多糖提取物對白色鏈球菌無抑菌活性。

3　結(jié)論與討論

響應(yīng)面圖表明了超聲功率、時間、溫度和提取劑用量對多糖的提取率具有重要、復(fù)雜的影響。超聲時間、溫度、功率和提取劑用量是影響提取多糖的重要因素。滿足多糖最大提取率的超聲提取條件為：82 min,95 ℃,213 W和20 mL/g。超聲提取技術(shù)是一種有效的從杏鮑菇中提取多糖的方法。在最適合的超聲條件下提取多糖，多糖提取率為14.1%±0.95%，與預(yù)測值無明顯差異(P>0.05)。這說明響應(yīng)面法有很好的預(yù)測性，它界定了超聲提取條件和PPE得率之間的非線性關(guān)系。但是，多糖結(jié)構(gòu)和抑菌活性之間的特定聯(lián)系還是未知的，還需要進行更詳盡的研究來闡明生物活性，并確定生物活性變化的真正原因。

[1]于海洋，彌春霞，吳薇，等.靈芝多糖提取方式比較及多糖應(yīng)用研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(8): 2 318-2 319，2 400.

[2]來林康，鄧尚貴.魚腥草多糖提取工藝及抗氧化活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(35):12 646-12 649.

[3]武蕓，丁莉，趙黎明.西洋菜中多糖提取工藝研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015,33(1)：91-94.

[4]倫志明，池玉杰，韓樹英，等.野生花臉香蘑多糖提取工藝優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(7):2 113-2 115，2 117.

[5]江念，陳根洪，鄭小江，等.正交法優(yōu)化烏蘞莓多糖提取工藝研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015,33(3)：334-336,360.

[6]Soria A C,Villamiel M.Effect of ultrasound on the technological properties and bioactivity of food:a review[J].Trends in Food Science and Technology，2010，21(7):323-331.

[7]Zhou C,Ma H.Ultrasonic degradation of polysaccharide from a red algae (Porphyra yezoensis)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，4(6):2 223-2 228.

[8]Fu L L,Chen H X,Dong P,et al.Effects of ultrasonic treatment on the physicochemical properties and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from mushroom Inonotus obliquus[J].Journal of Food Science，2010，75(4)：C322-C327.

[9]Yan R W,Yang Y,Zeng Y Y,et al.Cytotoxicity and antibacterial activity of Lindera strychnifolia essential oils and extracts[J].J Ethnopharmacol，2009，121(3):451-455.

[10]Hemwimol S,Pavasant P,Shotipruk A.Ultrasound-assisted extraction of anthraquinones from roots of Morinda citrifolia[J].Ultrasonics Sonochemistry，2006，13(6):543-548.

[11]Yang B,Jiang Y M,Zhao M M.Effects of ultrasonic extraction on the physical and chemical properties of polysaccharides from longan fruit pericarp[J].Polymer Degradation and Stability，2008，93(1):268-272.

[12]Sun J,Yin G Y,Du P,et al.Optimization of extraction technique of polysaccharides from pumpkin by response surface method[J].Journal of Medicinal Plants Research，2011，5(11):2 218-2 222.

[13]Zhao Q,Kennedy J F,Wang X,et al.Optimization of ultrasonic circulating extraction of polysaccharides from Asparagus officinalis using response surface methodology[J].International Journal of Biological Macromolecules，2011，49(2):181-187.

(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Optimization of Ultrasonic Extraction of Polysaccharides fromPleurotusEryngiiby Response Surface Methodology and Evaluation of Their Antibacterial Activities

XU Rui,LI Fengying,CUI Ruijing,ZHAO Xiyan,GUO Shuo,WU Penglin

(College of Food Science & Technology,Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei,066600，China)

An ultrasonic technique was employed to extract polysaccharides fromPleurotuseryngii(PPE) in this study. The effects of ultrasonic conditions on the recovery and antioxidant activities of polysaccharides were evaluated. The optimal conditions for ultrasonic extraction of PPE were determined by response surface methodology (RSM). RSM was applied to evaluate the effects of four independent variants (ultrasonic power, time, temperature and solvent-solid ratio) on the recovery of PPE. The results indicated that the expected recovery of polysaccharides might reach 14.5% when the optimal ultrasonic conditions were as extraction time 82 min, extraction temperature 95 ℃, ultrasonic power 213 W and solvent-solid ratio 20 mL/g. The experimental determinations were not significantly different (P>0.05) from the expected value under the above condition. Meanwhile, the PPE antibacterial activities in vitro were evaluated, and tended to be antibacterial capacity to bothE.coliandAspergillusniger. PPE could be explored as a potential functional agent for medicine or functional foods.

Pleurotuseryngiipolysaccharide;extraction condition;antibacterial activities;response surface methodology

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.01.004

河北科技師范學(xué)院博士科研啟動基金項目(項目編號：2013YB017)。

，男，博士，講師。主要研究方向：多糖生物活性。E-mail: robust100@163.com。

2015-12-16; 修改稿收到日期: 2016-01-07

TQ914.1

A

1672-7983(2016)01-0020-06

許瑞(1980-)，男，博士，講師。主要研究方向：多糖生物活性。