阿司匹林及其衍生物與脂肪酸結(jié)合蛋白4復(fù)合物的晶體學(xué)研究

黃 佩李敏軍左 剛郭豪杰周 歡謝牧云郁 峰徐春艷何建華（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 張江園區(qū) 上海 20204）2（中國科學(xué)院大學(xué) 北京 00049）

阿司匹林及其衍生物與脂肪酸結(jié)合蛋白4復(fù)合物的晶體學(xué)研究

黃 佩1，2李敏軍1左 剛1郭豪杰1，2周 歡1謝牧云1郁 峰1徐春艷1何建華1
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（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 張江園區(qū) 上海 201204）2（中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

脂肪酸結(jié)合蛋白4 （Fatty Acid Binding Protein 4， FABP4）作為脂肪酸伴侶，參與調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、運輸、脂介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及巨噬細胞的炎癥反應(yīng)。該蛋白的抑制經(jīng)常作為治療脂肪代謝疾病的有效方案。本文報道了經(jīng)典非甾體抗炎藥阿司匹林及其水解物水楊酸與FABP4蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，從而推測阿司匹林可能通過FABP4蛋白途徑抑制動脈粥樣硬化的分子機制。結(jié)構(gòu)分析進一步闡明了FABP4蛋白疏水殘基Phe16苯環(huán)側(cè)鏈與水楊酸之間的C-H-π相互作用比親水位點靜電相互作用提供更穩(wěn)定的結(jié)合。該發(fā)現(xiàn)為設(shè)計更高選擇性FABP4抑制劑提供了新的途徑。

脂肪酸結(jié)合蛋白4，蛋白質(zhì)晶體學(xué)，C-H-π相互作用

脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty Acid Binding Proteins，F(xiàn)ABPs）是動物細胞內(nèi)一類調(diào)節(jié)脂肪代謝的蛋白質(zhì)超家族。它作為脂肪分子伴侶參與脂肪介導(dǎo)的生物過程以及多種脂肪信號調(diào)節(jié)的系統(tǒng)代謝平衡［1］。FABPs蛋白家族進化保守，在果蠅、線蟲、小鼠和人體中均有發(fā)現(xiàn)［2］。該蛋白家族在人體內(nèi)組織或器官中分布有多種FABP蛋白亞型，表現(xiàn)出獨特的組織特異性及細胞特異性［3］。其中，在脂肪細胞中大量分布的FABP4蛋白備受關(guān)注［4］。

FABP4蛋白，也稱A-FABP或者aP2蛋白，主要分布于成熟的脂肪細胞和脂肪組織，也分布于巨噬細胞等［5］。該蛋白的表達量在脂肪細胞分化時增加，并且蛋白活性受長鏈脂肪酸、氧化低密度脂蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體 γ、胰島素的調(diào)節(jié)［6-7］。在細胞中，F(xiàn)ABP4結(jié)合多種脂肪酸參與脂肪轉(zhuǎn)運、降解和生成過程，同時在脂肪的細胞內(nèi)信號通路、炎癥反應(yīng)和代謝調(diào)節(jié)等活動中扮演重要角色。研究表明，F(xiàn)ABP4與脂肪酸代謝紊亂、二型糖尿病、動脈粥樣硬化以及肥胖等疾病密切相關(guān)。FABP4蛋白抑制是二型糖尿病、脂肪肝和動脈粥樣硬化等疾病的治療方案［1，8］。

近年來，人源FABP4蛋白與脂肪酸以及一系列小分子抑制劑的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)被陸續(xù)報道［9-12］。人源FABP4蛋白表現(xiàn)為典型的脂籠蛋白結(jié)構(gòu)，其中10條依次互為反平行的 β鏈折疊成扁型的桶狀結(jié)構(gòu)，位于 β1-β2之間的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域被認為是β桶的蓋子，封閉該蛋白的頂端，而另一端β桶被短的α螺旋部分關(guān)閉。由此形成的空腔為脂肪酸等小分子配體結(jié)合位點。針對該位點的小分子抑制劑設(shè)計目前主要考慮兩個方面：其一為由與脂肪酸帶電荷羧基結(jié)合的氨基酸殘基Arg106、Arg126 和Tyr128組成的親水位點；另一個為疏水殘基Phe57為代表的一系列疏水殘基組成的疏水位點［10］。由于FABP4蛋白對疏水配體有著天然的低選擇性，容易與其他亞型交叉抑制而引發(fā)副作用。因此在已知的蛋白-配體結(jié)合模式以外，定義新的配體結(jié)合位點與相互作用模式，并開發(fā)相應(yīng)的高親和、高選擇性抑制劑以避免副作用產(chǎn)生，將具有重要的現(xiàn)實意義。依托上海同步輻射裝置（Shanghai Synchrotron Radiation Facility， SSRF）光源生物大分子晶體學(xué)實驗站，開展FABP4蛋白-小分子片段復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)測定與篩選，能夠為設(shè)計與發(fā)現(xiàn)高選擇性抑制該蛋白生物功能的藥物小分子提供關(guān)鍵理論依據(jù)。

阿司匹林也稱乙酰水楊酸（Acetylsalicylic Acid，ASA）是一種經(jīng)典非甾體抗炎藥（Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug， NSAID），目前被廣泛應(yīng)用于動脈粥樣硬化的治療中［13］。本文通過研究乙酰水楊酸及其水解物水楊酸（Salicylic Acid， SA）作為小分子片段與FABP4蛋白形成的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，推測阿司匹林存在通過抑制FABP4蛋白生物功能來治療動脈粥樣硬化的一種可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 FABP4蛋白表達純化

1.1.1 FABP4蛋白表達

將人源FABP4蛋白的cDNA重組到表達載體pET28a中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli感受態(tài)細胞BL21（DE3）后過表達目標蛋白。挑取單克隆，加入到50 mL含有25 mg·mL-1卡那霉素的LB （Luria-Bertani）培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速220 r·min-1、37°C恒溫箱振蕩培養(yǎng)。過夜后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入800 mL含有25 mg·mL-1卡那霉素新鮮的LB培養(yǎng)基，37°C恒溫箱振蕩培養(yǎng)。當(dāng)檢測菌液的OD600 nm值達到0.6-0.8時，加入0.2 mmol·L-1異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside， IPTG），20°C恒溫誘導(dǎo)16h。低溫高速（4°C，8 000 r·min-1）離心10 min收集菌體。

1.1.2 FABP4蛋白分離純化

收集的菌體加入20 mmol·L-1NaH2PO4，pH=8.0，300 mmol·L-1NaCl，5 %甘油的細胞裂解緩沖液中重懸。高速分散器將細胞懸浮液均勻分散，去除小的細胞團塊。壓力破碎細胞直至菌液澄清，溫度設(shè)定為4°C，壓力為100-120 MPa。獲得細胞破碎液后離心管分裝，4°C，15 000 r·min-1高速離心30min，收集上清液。

將蛋白離心上清液加入到含鎳的金屬螯合親和層析色譜柱，含20 mmol·L-1咪唑的裂解緩沖液沖洗柱上雜蛋白。含200 mmol·L-1咪唑裂解緩沖液洗脫FABP4蛋白并收集。將收集的FABP4蛋白用截留分子量為3 kDa的超濾管（Millipore）進行濃縮。隨后使用分子篩純化上一步的蛋白。分子篩進樣前，蛋白需10000r·min-1高速離心除去雜質(zhì)和氣泡。分子篩預(yù)裝柱選用120mL HiLoad Superdex75 16/60 column （GE Healthcare），緩沖液為20 mmol·L-1NaH2PO4，pH=7.5，50 mmol·L-1NaCl，5%甘油。收集280 nm紫外吸收峰峰值處對應(yīng)蛋白樣品。SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）檢測顯示蛋白樣品純度達 95%以上，該蛋白進一步濃縮至10 mg·mL-1左右，用于蛋白結(jié)晶生長實驗。

1.2 FABP4蛋白-小分子復(fù)合物晶體制備

采用懸滴-氣相擴散法制備單獨蛋白晶體，兩種結(jié)晶條件被選用為該蛋白的結(jié)晶母液，分別為1.6mol·L-1檸檬酸鈉 pH=6.5和20% 聚乙二醇（PEG-10000），0.1 mol·L-1羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES），pH=7.5［14］。用于結(jié)晶的蛋白樣品濃度約為10 mg·mL-1，與結(jié)晶母液分別取2 μL混合形成懸滴液。晶體板靜置于18 °C恒溫室等待蛋白晶體生長。

蛋白配體復(fù)合物晶體通過利用小分子配體浸泡FABP4蛋白晶體實驗獲得。分別配制水楊酸和乙酰水楊酸配體濃度為10mmol·L-1的兩種結(jié)晶母液，并將FABP4蛋白晶體在其中浸泡2h即得到蛋白-小分子復(fù)合物晶體。

1.3 晶體衍射數(shù)據(jù)收集及結(jié)構(gòu)解析

含有20%甘油的結(jié)晶母液作為晶體防凍液用于衍射數(shù)據(jù)收集前的晶體冷凍保存。將目標晶體轉(zhuǎn)移到防凍液中靜置10-20 s并快速轉(zhuǎn)移液氮中保存。晶體衍射數(shù)據(jù)的收集在SSRF生物大分子線站BL17U1［15］進行，實驗溫度為100 K，探測器為美國ADSC公司Quantum Q315r CCD。收集的FABP4蛋白晶體衍射數(shù)據(jù)用HKL2000軟件包［16］和XDS［17］進行指標化、積分和整合處理。以PDB數(shù)據(jù)庫中編碼為2HNX的已知人源FABP4結(jié)構(gòu)作為分子置換的搜索模型，用CCP4軟件包［18］中的phaser-MR軟件解析相位。采用PHENIX［19］進行結(jié)構(gòu)模型修正，COOT［20］調(diào)圖。PyMOL［21］制作三維結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白表達純化及復(fù)合物晶體制備

FABP4蛋白在設(shè)計時含有 6×His標簽（anti-6×His tag monoclonal antibody），通過鎳親和層析柱可以初步純化。為獲得高度均一的高純度蛋白，本實驗進一步使用分子篩純化蛋白。分子篩通過280 nm紫外吸收檢測，洗脫體積在76 mL處出現(xiàn)過飽和的吸收峰，對應(yīng)的相對分子質(zhì)量為15 kDa，說明FABP4蛋白溶液狀態(tài)下為單體存在。經(jīng)過分子篩純化步驟所得的蛋白經(jīng)15%的SDS-PAGE檢測，蛋白純度已達到95%以上，適用于結(jié)晶實驗。

將純化獲得的蛋白在兩種配方的結(jié)晶母液中進行晶體生長實驗，這兩種母液分別為1.6 mol·L-1檸檬酸鈉 pH=6.5和20% PEG-10000，0.1 mol·L-14-HEPES，pH=7.5。生長得到兩種不同外觀的蛋白晶體（圖1），而且這兩種晶體的生長所需時間和所屬分子空間群均不相同。在檸檬酸鈉溶液中，生長3 d左右能夠得到刀片狀晶體（圖1（a）），其空間群為P212121。在HEPES/PEG結(jié)晶母液中，兩周后能看到呈現(xiàn)棱柱狀的晶體（圖1（b）），其所屬空間群為P21212。然而由于高濃度的檸檬酸鹽容易與小分子發(fā)生競爭，阻礙弱結(jié)合能力的小分子片段與FABP4的結(jié)合［12］，最終利用HEPES/PEG結(jié)晶母液中生長的蛋白晶體與SA及ASA （圖2）結(jié)合，得到復(fù)合物晶體。利用這些復(fù)合物晶體采集到了較高分辨率的X-射線單晶衍射數(shù)據(jù)（約0.13nm），具體的晶體衍射數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計參見表1。

圖1 不同結(jié)晶條件下生長出的FABP4 蛋白晶體（a） 檸檬酸鈉溶液，（b） HEPES/PEG結(jié)晶母液Fig.1 Two types of FABP4 crystals growing from two different mother liquors.（a） Sodium citrate solution， （b） HEPES/PEG solution

圖2 水楊酸、乙酰水楊酸和FABP4抑制劑BMS309403的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical schemes of the ligands SA， ASA and the FABP4 inhibitor BMS309403.

表1 衍射數(shù)據(jù)采集與數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計Table1 Statistics of crystal data collection and structure refinement.

2.2 蛋白復(fù)合物配體結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)水分子與配體的關(guān)系

如圖3所示，人源FABP4蛋白表現(xiàn)為典型的脂籠蛋白結(jié)構(gòu)。該蛋白主要由10條依次互為反平行的β鏈折疊成扁型的桶狀結(jié)構(gòu)，由圖3可以發(fā)現(xiàn)，組成“桶”內(nèi)壁的氨基酸極性分布有明顯的區(qū)域性。位于上部的殘基大多為帶電荷或極性側(cè)鏈氨基酸，它們與螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域一起組成了完整的蛋白配體結(jié)合空腔。而“桶”的下半部則主要為非極性側(cè)鏈氨基酸，它們通過疏水相互作用形成了桶狀結(jié)構(gòu)的底部。

FABP4蛋白配體結(jié)合位點為一個兩親性的“口袋”。其中親水端深入蛋白中部，疏水端靠近蛋白表面。位于該蛋白中部，序列保守的氨基酸殘基Arg106、Arg126和Tyr128側(cè)鏈組成親水端位點。通過靜電相互作用它們可以和脂肪酸等配體的羥基結(jié)合。而位于該蛋白螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域的殘基Phe16、Met20、Val25、Ala33以及位于β3-β4之間loop上的Phe57、β5-β6之間loop上的Ala75等疏水殘基則形成一個較為松散的疏水區(qū)與脂肪酸的疏水脂肪鏈相結(jié)合（圖4）。

圖3 FABP4配體結(jié)合空腔的結(jié)構(gòu)水Fig.3 Structural water molecules inside of the ligand binding cavity of FABP4.

圖4 水楊酸（a）及乙酰水楊酸（b）與FABP4配體結(jié)合位點Fig.4 Ligand binding sites of FABP4 bound with SA （a） and ASA （b）.

復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示FABP4蛋白內(nèi)部存在21個坐標相對固定的結(jié)構(gòu)水分子（圖3中小圓點標示），其中19個結(jié)構(gòu)水分布在配體結(jié)合空腔內(nèi)。通過氫鍵與組成空腔的極性殘基側(cè)鏈相互作用，這些網(wǎng)絡(luò)化的結(jié)構(gòu)水分子被穩(wěn)定在配體結(jié)合位點。配體小分子的結(jié)合將部分有序的結(jié)構(gòu)水置換出來是一個熵增加的過程，即結(jié)構(gòu)水的存在與配體的結(jié)合存在相互競爭的關(guān)系。這一關(guān)系是影響抑制劑小分子結(jié)合FABP4的一個關(guān)鍵因素。

2.3 蛋白復(fù)合物的配體結(jié)合位點結(jié)構(gòu)分析

水楊酸及乙酰水楊酸的分子量較小（僅為經(jīng)典抑制劑BMS309403的1/3），且親水羧基與疏水苯環(huán)之間僅有一根碳-碳鍵相連（圖2）。已報道的FABP4-小分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示，配體結(jié)合空腔的親水位點與疏水位點之間距離為3-4根碳-碳鍵的長度。因此FABP4的兩個極性相反的結(jié)合位點對水楊酸及乙酰水楊酸小分子的結(jié)合存在競爭。

復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示，在FABP4配體結(jié)合空腔中，SA （圖4（a））和ASA （圖4（b））兩種小分子的電子密度圖清晰可見。與已知小分子配體不同，SA及ASA的羧基與FABP4蛋白Arg126和Tyr128側(cè)鏈之間分別需要通過一個及兩個結(jié)構(gòu)水分子的“中繼”，形成較弱氫鍵相互作用。而在疏水結(jié)合區(qū)域，殘基Phe16側(cè)鏈苯環(huán)的CH幾乎垂直指向水楊酸芳環(huán)平面，其中C-H-苯環(huán)中心的距離為0.37-0.40 nm之間（圖5），該結(jié)構(gòu)所測定的幾何距離參數(shù)表明殘基Phe16側(cè)鏈苯環(huán)的CH與水楊酸苯環(huán)π電子云之間存在C-H-π相互作用［22］。這一相互作用被認為是一種非經(jīng)典的氫鍵相互作用，并發(fā)現(xiàn)廣泛存在于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中［23］。同時，帶正電荷的殘基Arg126的側(cè)鏈胍基團與Phe16側(cè)鏈苯環(huán)幾乎平行，平面之間的距離為0.33-0.40 nm，這一幾何距離參數(shù)表明兩者之間存在陽離子-π相互作用。它們之間的陽離子-π相互作用將使得Phe16側(cè)鏈苯環(huán)上的CH氫原子的親電性進一步增強，從而增強了Phe16-水楊酸苯環(huán)之間的C-H-π相互作用。

圖5 FABP4殘基Arg126、Phe16與水楊酸苯環(huán)的幾何距離關(guān)系Fig.5 Geometrical distance relationship between Arg126，Phe16 residues of FABP4 and benzyl ring of SA.

雖然水楊酸分子帶電荷的羰基也能夠與FABP4的親水配體結(jié)合位點相互作用，破壞結(jié)構(gòu)水的有序性造成熵增效應(yīng)，Phe16-水楊酸苯環(huán)之間的C-H-π相互作用能夠提供有效的焓增。以上兩個因素合作的結(jié)果使得水楊酸小分子更應(yīng)該結(jié)合在疏水結(jié)合位點，而不是通常認為的親水結(jié)合位點，由此認為FABP4配體結(jié)合空腔的疏水位點提供結(jié)合能力貢獻更大。本研究中的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)對這一猜想給出有力的實驗證明。該結(jié)果可以為進一步設(shè)計高選擇性的FABP4抑制劑提供新的途徑。

3 結(jié)語

本文利用經(jīng)典藥物阿司匹林（乙酰水楊酸）及其水解物水楊酸作為片段分子，成功地制備了脂肪酸結(jié)合蛋白FABP4與小分子片段的復(fù)合物晶體并解析了復(fù)合物晶體的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，F(xiàn)ABP4疏水結(jié)合位點殘基Phe16苯環(huán)C-H與水楊酸苯環(huán)平面之間存在較強的C-H-π非經(jīng)典氫鍵相互作用，在乙酰水楊酸的競爭結(jié)合過程中比親水位點的靜電相互作用更具有優(yōu)先性。這一發(fā)現(xiàn)為設(shè)計高選擇性FABP4抑制劑提供了新的途徑。

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Crystallography study of the complexes of human fatty acid binding protein 4 with aspirin and its derivative

HUANG Pei1，2LI Minjun1ZUO Gang1GUO Haojie1，2ZHOU Huan1XIE Muyun1YU Feng1XU Chunyan1HE Jianhua1
1
（Shanghai Institute of Applied Physics， Chinese Academy of Sciences， Zhangjiang Campus， Shanghai 201204， China）2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Background: Fatty acid binding protein 4 （FABP4）， as fatty acid chaperone， plays center roles in lipid transport， lipolysis and liposynthesis， and it has been proved to be involved in the lipid signaling and inflammatory responses. Inhibitors of FABP4 are promising treatments for the diabetes and atherosclerosis. Purpose: The aim is to reveal the structural conformation of aspirin and salicylic acid binding to the FABP4， and to explore the novel structural features for the design of high-selective FABP4 inhibitors. Methods: Single crystal X-ray diffraction is applied to solve the structure of the ligand-protein complexes. Results: We have determined the crystal structures of FABP4 in complex with aspirin and its derivative， and from which a special C-H-π interaction between the residues Phe16， Arg126 and the benzyl ring of aspirin has been defined. Conclusion: The complex structures of FABP4 bound with aspirin and its derivative show that the edge-to-face C-H-π interaction between the residues Phe16， Arg126 and the benzyl ring of aspirin is a critical intermolecular force between the ligand-FABP4 interactions， which enables us to consciously apply these interactions in hit and lead optimization in rational structure based drug design.

FABP4， Protein crystallography， C-H-π interaction

HUANG Pei， female， born in 1990， graduated from Northwestern University in 2013， master student， focusing on macromolecular

HE Jianhua， E-mail: hejh@sinap.ac.cn； LI Minjun， E-mail: liminjun@sinap.ac.cn

TL99

10.11889/j.0253-3219.2016.hjs.39.080101

國家自然科學(xué)基金（No.31100528、No.31371260）資助

黃佩，女，1990年出生，2013年畢業(yè)于西北大學(xué)，現(xiàn)為碩士研究生，研究方向為生物大分子晶體學(xué)

何建華，E-mail: hejh@sinap.ac.cn；李敏軍，Email: liminjun@sinap.ac.cn

Supported by National Natural Science Foundation of China （No.31100528， No.31371260）

crystallography

2016-04-18，

2016-04-28