長沙地區(qū)產金屬β-內酰胺酶銅綠假單胞菌的分子流行病學特征

鄔靖敏，鄒明祥，李　軍

(1 長沙市第一醫(yī)院，湖南 長沙　410005； 2 中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙　410008)

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·論著·

長沙地區(qū)產金屬β-內酰胺酶銅綠假單胞菌的分子流行病學特征

鄔靖敏1，鄒明祥2，李軍2

(1 長沙市第一醫(yī)院，湖南 長沙410005； 2 中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙410008)

目的了解長沙地區(qū)多重耐藥銅綠假單胞菌(PA)產金屬β-內酰胺酶(MBL)菌株基因型和流行情況。方法收集該地區(qū)7所綜合醫(yī)院臨床分離的PA，對菌株進行鑒定和藥敏試驗，采用EDTA協同試驗、E-test MBL進行MBL表型篩選，聚合酶連反應(PCR)明確其基因型，腸桿菌科基因間重復序列聚合酶鏈反應(ERIC-PCR)進行同源性分析。結果經EDTA協同和E-test MBL初步篩查，81株PA中僅10株為強陽性；PCR結果顯示，18株 PA MBL基因陽性，其中IMP-9型11株，IMP-1型1株和VIM-2型6株，未檢測出SIM、SPM、GIM和NDM-1基因型。ERIC-PCR分型結果顯示，12株產IMP PA存在多個型別，而6株產VIM-2菌株為同一型別。結論長沙地區(qū)多重耐藥PA以IMP-9和VIM-2基因型最常見。

銅綠假單胞菌； 金屬β-內酰胺酶； 金屬酶； 基因型； 腸桿菌科基因間重復序列聚合酶鏈反應

[Chin J Infect Control，2016，15(7)：447-451]

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一種常見的引起醫(yī)院獲得性感染的條件致病菌。金屬β-內酰胺酶(metallo-β-lactamase，MBL)，簡稱金屬酶，是致使PA對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機制之一。產MBL PA檢出日益增加[1]，泛耐藥PA的出現[2]，以及有效酶抑制劑的缺乏[3]，給臨床抗感染治療和醫(yī)院感染防控帶來極大困難。本研究擬對長沙地區(qū)7所綜合醫(yī)院81株多重耐藥PA進行MBL基因檢測，并對產IMP/VIM-2酶菌株進行同源性分析，現將結果報告如下。

1　材料與方法

1.1菌株與來源收集2011年1—6月長沙地區(qū)7所綜合性醫(yī)院臨床分離的非重復多重耐藥PA 81株，其中中南大學湘雅醫(yī)院46株，中南大學湘雅三醫(yī)院14株，瀏陽市人民醫(yī)院7株，長沙市第三醫(yī)院6株，湖南省第二人民醫(yī)院4株，長沙市第一醫(yī)院3株，湖南省人民醫(yī)院1株。標本類型有痰、支氣管分泌物、咽拭子、創(chuàng)面分泌物、血、尿、導管尖端和引流液等。多重耐藥菌PA的判斷標準參照李春輝等[4]翻譯的文獻。產IMP和 VIM-2陽性對照菌株為臨床分離菌株，已通過測序證實。銅綠假單胞菌ATCC 27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2試劑與儀器VITEK-2 GN鑒定板和E-test MBL購自法國生物梅里埃公司。亞胺培南藥敏紙片和M-H培養(yǎng)基干粉購自英國OXOID公司，0.5 mol/L EDTA溶液為自行配制，聚合酶鏈反應(PCR)試劑購自美國OMEGA，D2000 Marker購自天根生化科技，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3MBL表型篩選

1.3.1EDTA協同試驗將0.5麥氏單位待測菌液涂布于MH平板，靜置10 min，待干燥后在平板中間貼亞胺培南藥敏紙片(10 μg/片)和EDTA紙片(0.5 moL/L EDTA溶液 4 μL)，紙片邊緣相距10～15 mm。35℃過夜培養(yǎng)后，若靠近亞胺培南藥敏紙片處出現抑菌圈擴大或“匙孔現象”則為陽性。

1.3.2E-test MBL試驗在涂有0.5麥氏單位菌液的MH平板上貼商品化E-test條，該E-test條兩端分別為亞胺培南(4～256 μg/mL) 和亞胺培南(1～64 μg/mL)+EDTA(320 μg/mL)。35℃過夜培養(yǎng)后，若IP/IPI的MIC比值≥8倍則為陽性。

1.4DNA提取及MBL基因PCR采用煮沸法提取DNA。35℃過夜培養(yǎng)，挑取單個待測菌落置于盛有300 μL無菌雙蒸水的EP管中，95℃煮10 min并置冰上快速冷卻，13 000 r/min低溫離心10 min，上清則為細菌DNA模板，分裝并于-20℃保存?zhèn)溆谩BL基因PCR：根據參考文獻[5-6]設計引物，并用Primer premier 5.0軟件驗證引物。引物序列見下表1。PCR反應體系為25 μL,即2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL，無菌蒸餾水8.5 μL。PCR反應條件：預變性94℃ 2 min；變性94℃ 1 min，退火72℃ 1 min，共30個循環(huán)；最后72℃再延伸5 min。取5 μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳，條件為100 V 40 min。PCR產物測序由北京六合華大基因有限公司完成，將測序結果在GenBank上進行BLAST比對分析。

1.5菌株同源性分析采用腸桿菌科基因間重復序列聚合酶鏈反應(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR)分別對產IMP和VIM-2 PA進行同源性分析。引物序列為ERIC-2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。判定標準為：主要的條帶位置和數量相同則是同一基因型[7]。PCR反應體系是2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物1 μL，DNA模板2 μL，無菌蒸餾水補足至25 μL。PCR反應條件是95℃預變性5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)；最后72℃再延伸3 min。取5 μL PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，100 V電泳40 min。紫外燈下觀察結果，并用凝膠成像系統進行拍照。

2　結果

2.1MBL表型初篩經EDTA協同和E-test MBL初步篩查，81株PA中僅10株為強陽性，見圖1～2。

圖1 　EDTA協同試驗檢測結果

圖2 　E-test MBL試驗檢測結果

2.2MBL基因確證全部菌株提取DNA直接進行MBL基因擴增，結果顯示，18株PA擴增出明顯條帶。經產物測序及BLAST比對，其中IMP-9型11株，IMP-1型1株和VIM-2型6株。未檢測到SIM-1、SPM-1、GIM和NDM-1基因陽性的PA。見圖3。

A:IMP基因；B:VIM-2基因；M：D2000 DNA Marker；1：陽性對照；2：銅綠假單胞菌ATCC 27853；3—5：PCR擴增陽性的臨床樣本

圖3IMP和VIM-2基因擴增產物電泳圖

Figure 3Electrophoresis map of PCR amplification products ofIMPandVIM-2 genes

2.3表型檢測與基因確證相符性EDTA協同試驗MBL表型陽性的10株PA均擴增到MBL基因，而12株產IMP PA中4株表型初篩陰性，6株產VIM-2 PA 4株表型初篩陰性。

2.4產IMP和VIM-2型MBL PA的標本來源產MBL PA菌株分布于長沙地區(qū)多所醫(yī)院，主要分離于重癥監(jiān)護病房(ICU)和燒傷科。詳見表2。

表2　產IMP和VIM-2型MBL PA來源

X1：中南大學湘雅醫(yī)院；X3：中南大學湘雅三醫(yī)院；SR：湖南省人民醫(yī)院；SY：長沙市第一醫(yī)院；SS：長沙市第三醫(yī)院

2.5產酶菌株ERIC-PCR分型12株產IMP PA為多個克隆型，呈現5種型別。其中3、11、13、14、15和 SY7為A型，36 和T26為B型，T15和843為C型，35為D型，T40為E型，片段大小為250～2 000 bp，見圖4。而6株產VIM-2銅綠假單胞菌為同一克隆型。見圖5。

M：D2000 DNA Marker；1—12泳道依次為3、11、13、14、15、35、36、T15、T26、T40、843、SY7號菌株

M：D2000 DNA Marker；1—6泳道依次為23、31、37、38、39、T27號菌株

圖5 產VIM-2 PA的ERIC-PCR電泳圖

Figure 5ERIC-PCR electrophoresis map of VIM-2-producingP.aeruginosa

3　討論

近年來，PA對以亞胺培南為代表的碳青霉烯類抗生素的耐藥率逐年上升，甚至出現泛耐藥菌株，成為臨床棘手的難題。由于細菌存在地域和醫(yī)院間差異，準確地掌握長沙地區(qū)PA產酶菌株的分子流行病學特征對臨床治療和感染控制具有重要的意義。

本組研究結果顯示，長沙地區(qū)產MBL PA菌株以IMP-9和VIM-2基因型為主，與李俏俏[8]報道的臺州地區(qū)的基因型相近。產酶菌株分布于長沙地區(qū)多所醫(yī)院，主要分離于ICU和燒傷科，這可能與患者年齡大、長期臥床、接受機械通氣、留置中心靜脈管、導尿管等侵襲性操作有關[9]。E-test MBL試驗基于EDTA可螯合Zn2+導致MBL失活原理，采用此方法進行MBL表型篩選時，若IP側MIC≤4 μg/mL則無法檢測出具體的MIC值，不適用于檢測亞胺培南中介或敏感的菌株，且E-test MBL試紙條較為昂貴，相比之下，EDTA協同試驗是篩選MBL較為簡單經濟的方法。本研究未檢測到產NDM-1 PA，而國際上已開始有此類菌株的報道[10]。

本研究采用ERIC-PCR進行菌株同源性分析，原因是其具有操作簡單、成本低、分辨效果好、可重復性較好等優(yōu)點，也常用于臨床實驗室分子流行病學初步監(jiān)測；而脈沖場凝膠電泳方法操作復雜、周期長、耗費高，而且還需配備專門的儀器。ERIC-PCR結果顯示，12株產IMP PA為多個克隆型，散在分布于多個醫(yī)院不同病區(qū)，以痰標本來源為主(占75%，9/12)。醫(yī)護人員在診治過程中需高度重視，加強手衛(wèi)生，防止耐藥菌株播散[11]。6株產VIM-2 PA為同一克隆型，有4株分離自中南大學湘雅醫(yī)院，其中2株來自燒傷科，另外2株分別來自于中南大學湘雅三醫(yī)院燒傷科、長沙市第一醫(yī)院ICU。各醫(yī)院尤其是ICU和燒傷科醫(yī)生需高度警惕呼吸道和創(chuàng)面多重耐藥PA感染[12]，感染控制部門應加強早期監(jiān)測，督促臨床科室早期隔離相關病例，防止多重耐藥PA的暴發(fā)流行。

綜上所述，長沙地區(qū)產MBL PA的分離情況不容樂觀，各醫(yī)院需加強此類菌株的耐藥監(jiān)測和實施醫(yī)院感染控制措施。本研究不足之處為菌株主要來源于中南大學湘雅醫(yī)院，其他醫(yī)院菌株收集較少，菌株代表性不足。

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(本文編輯：周鵬程)

Molecular epidemiological characteristics of metallo-β-lactamase-producingPseudomonasaeruginosafrom Changsha

WUJing-min1,ZOUMing-xiang2,LIJun2

(1TheFirstHospitalofChangsha,Changsha410005,China; 2XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China)

ObjectiveTo investigate the genotypes and epidemic of metallo-β-lactamase-(MBL)-producingPseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa) in Changsha. MethodsP.aeruginosaisolated from seven comprehensive hospitals in Changsha were collected and performed identification and antimicrobial susceptibility testing, phenotypes of MBL were detected with EDTA-disk synergy test and E-test, genotypes were determined by polymerase chain reaction (PCR), homology analysis were conducted by enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR). ResultsPreliminary screening by EDTA-disk synergy test and E-test showed that only 10 of 81 isolates were strong positive; PCR result showed that 18 isolates were positive for MBL, 11 of which wereIMP-9-type MBL, 1 wasIMP-1-type,and 6 wereVIM-2-type.SIM,SPM,GIM, andNDM-1-types were not found. ERIC-PCR showed that 12 strains of IMP-producingP.aeruginosahas multiple types, 6 VIM-2-producing strains were of the same type. ConclusionIMP-9 andVIM-2 are main genotypes inP.aeruginosain Changsha．

Pseudomonasaeruginosa; metallo-β-lactamase; metalloenzyme; genotype; enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction

2016-04-11

湖南省發(fā)改委(湘發(fā)改高技[2012]1493號；湘發(fā)改投資[2014]658號)；湖南省自然科學基金(14JJ7003)

鄔靖敏(1987-)，女(漢族)，江西省宜春市人，檢驗技師，主要從事細菌耐藥機制研究。

鄒明祥E-mail：zoumingxiang@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.07.002

R181.3+2R378.99+1

A

1671-9638(2016)07-0447-05