HPLC梯度洗脫法同時測定小兒暑感寧糖漿中的香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚及厚樸酚

沈 健，張誠賢（.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州 33000；.湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 33000）

HPLC梯度洗脫法同時測定小兒暑感寧糖漿中的香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚及厚樸酚

沈 健1，張誠賢2
（1.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州 313000；2.湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000）

目的：建立用高效液相色譜法（HPLC）同時測定小兒暑感寧糖漿中的香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚及厚樸酚含量的分析方法。方法：采用HPLC法，色譜柱：Eclipse XDB-Cl8柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.05%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；香荊芥酚、麝香草酚檢測波長為λ1= 274 nm，和厚樸酚、厚樸酚檢測波長為λ2= 294 nm。結(jié)果：香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚及厚樸酚線性范圍分別在6.35 ～ 127.00 μg·mL-1（r = 0.999 3）、4.74 ～ 94.80 μg·mL-1（r = 0.999 1）、4.35 ～ 87.00 μg·mL-1（r = 0.999 7）、5.19 ～ 103.80 μg·mL-1（r = 0.999 4）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度、重現(xiàn)性實驗中各組分RSD值均小于2.0%；4種成分的平均加樣回收率（n = 9）及RSD分別為98.18%（1.15%）、96.94% （1.44%）、99.03%（0.92%）、97.24%（0.79%）。結(jié)論：本文建立的HPLC法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可同時測定小兒暑感寧糖漿中的香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚及厚樸酚含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供理論參考。

高效液相色譜法；小兒暑感寧糖漿；香荊芥酚；麝香草酚；和厚樸酚；厚樸酚

小兒暑感寧糖漿是由香薷、厚樸、佩蘭、扁豆花、黃芩、黃連、青蒿等十三種藥材組成，為中藥復(fù)方制劑，具有清暑解表、退熱的功效，用于小兒暑季外感發(fā)燒、高熱不退、頭痛少汗、咽喉腫痛、食欲不振、二便不暢的治療。該制劑收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊，原小兒暑感寧糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對性狀、相對密度作了規(guī)定［1］，鑒別項僅對部分藥材作了定性研究，僅以此指標(biāo)已不能完全有效控制小兒暑感寧糖漿的質(zhì)量。另外，對該制劑中的香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚和厚樸酚四種成分同時定量研究也未見相關(guān)報道，本文采用高效液相梯度洗脫法對該制劑中香薷藥材中的香荊芥酚、麝香草酚，厚樸藥材中的和厚樸酚、厚樸酚進行同時測定，為有效評價小兒暑感寧糖漿的質(zhì)量控制提供理論參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），2487型紫外檢測器；KQ-500DE型醫(yī)用超聲波清洗機（北京市醫(yī)療設(shè)備二廠）；ESJ182-4十萬分之一電子天平（上海力衡儀器儀表有限公司）。

香荊芥酚對照品（含量以99.7%計，批號111691-201103），麝香草酚對照品（含量以99.9%計，批號100508-200902），厚樸酚（含量以98.8%計，批號110729-201513），和厚樸酚對照品（含量以100.0%計，批號110730-201313）均由中國食品藥品檢定研究院提供；小兒暑感寧糖漿（規(guī)格：100 mL，批號為2015001、2015007、2015022）均購于太極集團四川南充制藥有限公司；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

Eclipse XDB-Cl8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.05%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 11 min，48.0%A；11 ～ 26 min，48.0%A→66.0%A；26 ～ 41 min，66.0%A→78.0%A；41 ～ 50 min，78.0%A→48.0%A）［2-8］；檢測波長（0 ～26 min，λ1= 274 nm［9］，26 ～ 50 min，λ2= 294 nm［10-12］）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。在此系統(tǒng)條件下各組分分離效果良好，理論塔板數(shù)不低于3500，相鄰峰之間分離度均大于1.5。

2.2溶液的配制

2.2.1混合對照品溶液的制備 分別精密稱取香荊芥酚對照品12.70 mg、麝香草酚對照品9.48 mg、和厚樸酚對照品8.70 mg、厚樸酚對照品10.38 mg，分別加甲醇溶解并稀釋，制成香荊芥酚濃度為0.635 mg·mL-1、麝香草酚濃度為0.474 mg·mL-1、和厚樸酚濃度為0.435 mg·mL-1、厚樸酚濃度為0.519 mg·mL-1的單一成分對照品儲備液。分別吸取上述各對照品儲備液1.0、2.5、4.0、5.0 mL，置于50 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，制成香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚、厚樸酚分別為0.012 7 mg·mL-1、0.023 7 mg·mL-1、0.034 8 mg·mL-1、0.051 9 mg·mL-1的對照品混合溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密量取小兒暑感寧糖漿4.0 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，密塞，超聲處理5 min，取出，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的制備 按照衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊WS3-B-1282-93小兒暑感寧糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方工藝，分別制備香薷空白樣品和厚樸空白樣品。制備后的空白樣品按照“2.2.2”項下方法，分別制備香薷空白溶液和厚樸空白溶液。

2.3專屬性實驗

精密量取所配制供試品溶液、混合對照品溶液、香薷空白溶液和厚樸空白溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，出峰順序依次為：香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚、厚樸酚，混合對照品溶液、供試品溶液測得各組分保留時間基本一致，而香薷空白溶液色譜圖未見香荊芥酚和麝香草酚色譜吸收峰；厚樸空白溶液色譜圖未見和厚樸酚及厚樸酚吸收峰，表明處方中其他成分對所測成分無干擾。詳見圖1。

圖1　HPLC色譜圖A -對照品，B -供試品，C -香薷空白溶液，D -厚樸空白溶液；1 -香荊芥酚，2 -麝香草酚，3 -和厚樸酚，4 -厚樸酚Fig 1 HPLC chromatogramsA - reference substance， B - sample， C - moslae herba negative control， D - magnoliae officinalis cortex negative control； 1 - carvacrol，2 - thymol， 3 - honokiol， 4 - magnolol

2.4線性關(guān)系的考察

分別精密量取對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度攪勻，制成對照品混合溶液。以峰面積值（y）為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行回歸計算，回歸方程分別為香荊芥酚：y = 4.995 7×105x + 326.83；麝香草酚：y = 9.041 2×105x + 217.5；和厚樸酚：y = 1.307 6×106x - 435.2；厚樸酚：y = 1.727 1×106x + 572.9。香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚及厚樸酚分別在6.35 ～ 127.00 μg·mL-1（r = 0.999 3）、4.74 ～ 94.80 μg·mL-1（r = 0.999 1）、4.35 ～ 87.00 μg·mL-1（r = 0.999 7）、5.19 ～ 103.80 μg·mL-1（r = 0.999 4）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5精密度實驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.78%、0.86%、1.02%、0.99%。

2.6重復(fù)性實驗

分別精密量取同一批號樣品6份，按供試品溶液制備方法進行測定，香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.96%、0.83%、1.13%、0.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實驗

取同一批小兒暑感寧糖漿的供試品溶液，按供試品溶液制備方法進行測定，分別在0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀進行測定，計算香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚、厚樸酚的RSD值，分別為0.88%、1.09%、0.97%、0.68%，結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8加樣回收率實驗

取適量已知含量的小兒暑感寧糖漿（香荊芥酚為0.173 mg·mL-1、麝香草酚為0.288 mg·mL-1、和厚樸酚為0.429 mg·mL-1、厚樸酚為0.641 mg·mL-1）樣品6份，精密量取2.0 mL，置50 mL容量瓶中，精密加入混合對照品溶液20 mL、25 mL、30 mL各3份，用甲醇稀釋至刻度，按“2.2.2”項下方法操作，搖勻，取續(xù)濾液，過濾，制得加樣供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算各組分回收率，詳見表1。

2.9樣品測定

按“2.2.2”項下方法，取3個批號的小兒暑感寧糖漿樣品，制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚、厚樸酚含量，詳見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果. mg·mL-1，n = 3Tab 2 Content determination results of sample. mg·mL-1， n = 3

表1　香荊芥酚、麝香草酚、和厚樸酚及厚樸酚的加樣回收率結(jié)果Tab 1 Recovery test results of carvacrol， thymol， honokiol and magnolol

3 討論

3.1檢測條件的選擇及優(yōu)化

筆者分別采用甲醇（A）-水（B）、甲醇（A）-0.05%冰醋酸（B）、乙腈（A）-0.05%冰醋酸（B）為流動相進行實驗，對比分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇（A）-0.05%冰醋酸（B）為流動相，在不同品牌的色譜柱上均獲得較好的分離，最終確定甲醇（A）-0.05%冰醋酸（B）為流動相進行梯度洗脫。

3.2HPLC同時測定小兒暑感寧糖漿4種成分含量的方法

小兒暑感寧糖漿是由多種中藥組成的復(fù)方制劑，原部頒標(biāo)準(zhǔn)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，只對部分藥材作了定性研究，本實驗通過對測定方法的考察，建立了高重復(fù)性、快速的小兒暑感寧糖漿4種成分含量的測定方法，且線性、精密度、重復(fù)性和回收率均良好，洗脫時間僅為50 min同時測定小兒暑感寧糖漿4種成分，提高了工作效率，也降低了測定成本。本研究采用HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法，從而實現(xiàn)對4個成分的同時測定，為小兒暑感寧糖漿的質(zhì)量控制填補了方法手段，為控制小兒暑感寧糖漿質(zhì)量水平和藥品標(biāo)準(zhǔn)的繼續(xù)提高提供了理論和數(shù)據(jù)支持。

［1］ 國家藥典委員會.衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊（WS3-B-1282-93）［S］.1993：13.

［2］ 劉穎新，劉利利，孔興欣，等.HPLC法測定香薷散不同煎液中香荊芥酚和麝香草酚的含量及體外抗菌作用比較［J］.藥物分析雜志，2014，34（6）：1006-1010.

［3］ 孟超，吳豐，馬林，等.厚樸類中藥厚樸酚及和厚樸酚含量測定［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19（6）：1024-1026.

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［10］ 謝友良，曾惠芳，林吉，等.HPLC測定黃芩正氣膠囊中橙皮苷、黃芩苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量［J］.中成藥，2006，28 （1）：34-36.

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［12］ 方小平，乙引，余正文，等.高效液相色譜法測定厚樸中7種代謝產(chǎn)物含量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（24）：13054-13057.

Simultaneous determination of carvacrol， thymol， honokiol and magnolol in Xiao'er shuganning syrup by HPLC with gradient elution

SHEN Jian1， ZHANG Cheng-xian2
（1. Huzhou Central Hospital， Huzhou 313000， China； 2. Huzhou Institute for Food and Drug Control， Huzhou 313000， China）

Objective: To establish the HPLC method for simultaneous determination of carvacrol， thymol， honokiol and magnolol in Xiao'er shuganning syrup. Methods: The Eclipse XDB-Cl8column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） was used， with a mobile phase consisted of methanol （mobile phase A） and 0.05% glacial acetic acid solution （mobile phase B） for gradient elution. The column temperature was 30 ℃. The flow rate was 1.0 mL·min-1. The injection volume was 20 μL. Carvacrol and thymol were detected at 274 nm， honokiol and magnolol were detected at 294 nm. Results: Carvacrol， thymol， honokiol and magnolol had good linearities at 6.35 - 127.00 μg·mL-1（r = 0.999 3）， 4.74 - 94.80 μg·mL-1（r = 0.999 1）， 4.35 - 87.00 μg·mL-1（r = 0.999 7 ）， 5.19 - 103.80 μg·mL-1（r = 0.999 4）， respectively. In precision and reproducibility test， the RSD results of 4 components were less than 2.0%； the average recovery and their RSD results were 98.18% （1.15%）， 96.94% （1.44%）， 99.03% （0.92%）， 97.24% （0.79%）， respectively. Conclusion: The HPLC method is simple and reliable with a good repeatability， which can simultaneously determine the contents of carvacrol，thymol， honokiol and magnolol in Xiao'er shuganning syrup. This method can be used to evaluate the quality of this preparation.

HPLC； Xiao'er shuganning syrup； Carvacrol； Thymol； Honokiol； Magnolol

R917

A

1672 - 8157（2016）04 - 0217 - 04

沈健，男，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究工作。E-mail：shenjian1929@163.com

2016-03-07

2016-05-25）