葛根素衍生物對局灶性腦缺血再灌注的保護作用及對caspase-3表達的影響

張宏偉，張 帆，董 志，朱 毅（.聊城市人民醫(yī)院臨床藥學室，山東 聊城 5000；.重慶醫(yī)科大學藥學院生化與分子藥理研究室，重慶 400006；.海南省藥品檢驗所海南省藥物質(zhì)量研究重點實驗室，海南 ?？?5706）

·實驗研究·

葛根素衍生物對局灶性腦缺血再灌注的保護作用及對caspase-3表達的影響

張宏偉1，2，張 帆1，董 志2，朱 毅3
（1.聊城市人民醫(yī)院臨床藥學室，山東 聊城 252000；2.重慶醫(yī)科大學藥學院生化與分子藥理研究室，重慶 400006；3.海南省藥品檢驗所海南省藥物質(zhì)量研究重點實驗室，海南 ?？?570216）

目的：觀察葛根素衍生物（G20）對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠是否具有保護作用，并探討其作用機制，其保護作用是否與caspase-3的表達具有相關(guān)性。方法：以Longa發(fā)明的線栓法制作局灶性腦缺血再灌注模型，大鼠被隨機分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組、G（25.0 mg·kg-1）組、G20（12.5、25.0、50.0 mg·kg-1）組，給藥組于缺血后1.5 h及6 h兩次尾靜脈給藥。通過評價大鼠缺血后神經(jīng)行為學、腦梗死面積及腦含水量的變化，HE染色觀察腦組織神經(jīng)元病理學改變，以觀察G20是否具有腦缺血再灌注損傷保護作用；并以原位末端標記法檢測大腦神經(jīng)元凋亡數(shù)目的改變及免疫組化法檢測其caspase-3的表達來探討其作用機制。結(jié)果：G20能改善腦缺血后4 h、24 h的神經(jīng)肌肉運動和前庭運動功能，減少腦缺血再灌注后腦梗死面積及降低腦含水量，減輕腦組織的病理形態(tài)學改變，與G組比較，未見大鼠尿液變紅等不良反應(yīng)。G20明顯減少了腦組織凋亡細胞的數(shù)目，減少了caspase-3的表達。結(jié)論：G20對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能是通過抑制caspase-3的表達發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡作用。

葛根素；葛根素衍生物；局灶性腦缺血再灌注；凋亡；Caspase-3

葛根素注射液為血管擴張藥，有擴張冠狀動脈和腦血管、降低心肌耗氧量，改善微循環(huán)和抗血小板聚集的作用，但其相關(guān)的不良反應(yīng)報道也越來越多（如溶血等）［1］，葛根素等中藥及方劑也是腦缺血損傷治療藥物的研究熱點［2］。有關(guān)學者將葛根素結(jié)構(gòu)進行改造，生成了一系列的衍生物，G20就是其中之一。鄢良春等［3］已證明G20能較好的降低心肌缺血再灌注損傷的作用，本文通過線栓法制作了大鼠的局灶性腦缺血再灌注模型，以觀察G20是否具有神經(jīng)保護作用。caspase-3在Caspase家族中具有中心地位，其活化后可以激活核因子及DNA修復(fù)酶等，導致DNA裂解、染色體濃縮和凋亡小體形成等，最終引起細胞凋亡。有研究［4］表明，急性腦缺血中大腦內(nèi)皮細胞DNA被切成片段之前，caspase-3被快速激活。本研究重點觀察G20是否可以減輕大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白的表達，是否具有抗凋亡作用。

1 材料

1.1主要儀器

恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）；IEC CENTRA-7R低溫離心機（賽默飛世爾科技公司）；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司）。

1.2主要試劑

G（葛根素，海南斯達制藥有限公司，批號0304070）；G20（軍事醫(yī)學科學院藥理及毒理研究所藥物化學研究室合成，純度＞ 90%）；TTC（上?；瘜W試劑公司，批號20031212）；TUNEL試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；caspase-3抗體試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3動物

SD大鼠，280 ～ 320 g，雄性，81只，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號為SCSK-（軍）-2002-001，飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境內(nèi)，日常飼喂以60Co照射消毒飼料及飲用消毒用水，室溫20 ～ 25 ℃，濕度40% ～ 70%，12 h照明，12 h黑暗。實驗經(jīng)過北京市實驗動物福利倫理審查分會許可。

2 方法與分組

2.1模型制作

參照Longa等［5］研究中右側(cè)大腦中動脈的缺血再灌注模型方法，并進行改良［6］。模型組大鼠術(shù)前12 h禁食，允許自由飲水。以水合氯醛進行腹腔注射全身麻醉后，取頸部正中切口，結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，于頸總動脈開口插入線栓（直徑0.26 ～ 0.28 mm，長度5 cm），經(jīng)動脈分叉處至頸內(nèi)動脈1.9 ～ 2.2 cm（假手術(shù)組為1.5 ～ 1.7 cm）稍感阻力停止，實現(xiàn)了右側(cè)大腦中動脈的缺血，栓塞90 min后退出線栓使大腦中動脈再通，實現(xiàn)大腦中動脈的缺血后再灌注。

2.2分組

大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、G（25.0 mg·kg-1）組、G20（12.5、25.0、50.0 mg·kg-1）組，每組至少8只；給藥組于缺血后1.5 h及6 h兩次尾靜脈給藥。

2.3神經(jīng)學評價方法

根據(jù)相關(guān)研究［7］的行為學評價標準改制，缺血后4 h及24 h進行評定兩種功能：神經(jīng)肌肉功能，前庭運動功能。

2.4腦組織染色及梗死面積

缺血24 h后，取腦除去嗅球、小腦和低位腦干，稱重（G1）后置入- 20 ℃冰箱20 min后，冠狀切為5片，置1% TTC中37 ℃溫孵30 min。10%甲醛固定、拍照，將染色后的白色組織分離稱重（G2），梗死面積（%）=壞死腦組織的重量（G2）/腦重量（G1）×100%。

2.5腦含水量

將上述大鼠的左右腦分別稱重后，置110 ℃烤箱中烤干至恒重（G3），計算干濕比。腦含水量（%）=［腦濕重（G1） -干重（G3）］/腦濕重（G1）×100%。

2.6病理切片

另取假手術(shù)組、模型組、G（25.0 mg·kg-1）及G20 （25.0 mg·kg-1，為前期實驗證實效果較好的一個劑量）組大鼠各6只，開胸暴露心臟，在升主動脈處插管灌以4%多聚甲醛，取出大腦，于視交叉后4 mm處取4 mm厚的冠狀切片，將其進行固定，一片做HE染色，一片做細胞凋亡檢測，另一片做caspase-3檢測。

2.7凋亡細胞計數(shù)及caspase-3

將上述腦切片，利用寡核苷酸末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）技術(shù)，檢測細胞核內(nèi)的原位標記的DNA特征性片段，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞，在高倍視野（40×10）下隨機觀察大鼠右側(cè)腦組織的六個視野，計數(shù)神經(jīng)元細胞中陽性細胞數(shù)。利用SABC免疫組化方法檢測大鼠右側(cè)腦組織神經(jīng)元胞漿caspase-3陽性細胞的原位表達，caspase-3陽性細胞胞漿呈棕黃色。

2.8藥品不良反應(yīng)

在實驗過程中，密切觀察各組大鼠是否有尿血現(xiàn)象的發(fā)生。

2.9統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1神經(jīng)行為學

3.1.1神經(jīng)肌肉運動功能評分 除假手術(shù)組外，腦缺血再灌注后4 h提鼠尾可見大鼠左前肢內(nèi)收，左前肢肌張力下降，左肩阻力明顯下降，行走時向左轉(zhuǎn)圈，提示神經(jīng)肌肉運動功能的損傷。由表1所示，用藥組較模型組大鼠的神經(jīng)肌肉運動功能評分降低，其中G （25.0 mg·kg-1）及G20（25.0 mg·kg-1）明顯減低腦缺血后4 h及24 h的神經(jīng)肌肉運動功能評分，與模型組比較有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

表1　G20對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)肌肉運動功能評分的影響.Tab 1 Influence of G20 on neuromuscular function scale in rats subjected to cerebral ischemia and reperfusion.

表1　G20對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)肌肉運動功能評分的影響.Tab 1 Influence of G20 on neuromuscular function scale in rats subjected to cerebral ischemia and reperfusion.

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with model group，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

?

3.1.2前庭運動功能評分 除假手術(shù)組外，腦缺血再灌注后4 h大鼠在平衡木上不能站穩(wěn)，一般的左前肢偏離平衡木，嚴重的會掉下平衡木，均有前庭運動功能的損傷。由表2所示，與模型組比較，用藥后評分均有降低，其中G（25.0 mg·kg-1）及G20（25.0 mg·kg-1）明顯降低腦缺血后4 h及24 h的前庭運動功能評分，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。

表2　G20對腦缺血再灌注大鼠前庭運動功能評分的影響.Tab 2 Influence of G20 on vestibular motor function scales in rats subjected to cerebral ischemia and reperfusion.

表2　G20對腦缺血再灌注大鼠前庭運動功能評分的影響.Tab 2 Influence of G20 on vestibular motor function scales in rats subjected to cerebral ischemia and reperfusion.

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05Note: compared with model group，*P ＜ 0.05

?

3.2腦梗死面積

由圖1所示，除假手術(shù)組外，各組腦缺血再灌注后腦組織經(jīng)TTC染色均有明顯的蒼白色區(qū)域，表明模型制作成功。用藥后蒼白區(qū)域面積均有減少，其中G20（25.0 mg·kg-1）及G（25.0 mg·kg-1）明顯減少腦梗死面積，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。

圖1　TTC染色的大鼠腦冠狀切面

3.3腦含水量

由表3所示，除假手術(shù)組外，各組腦缺血再灌注后腦含水量均明顯增大，表明缺血再灌后均有腦水腫形成。用藥后含水量均有減少，尤以G（25.0 mg·kg-1）及G20（25.0 mg·kg-1）降低腦含水量明顯，與模型組比較有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

Tab 3 Influence of G20 on the content of brain edema in rats subjected to cerebral ischemia and reperfusion.

注：與假手術(shù)組比較，##P ＜ 0.01；與模型組比較，*P ＜ 0.05Note: compared with sham-operation group，##P ＜ 0.01； compared with model group，*P ＜ 0.05

3.4病理組織學

假手術(shù)組：細胞形態(tài)正常，核仁清楚，神經(jīng)細胞胞體有突起伸出，間質(zhì)內(nèi)未見出血、壞死及水腫。模型組：右側(cè)大腦缺血范圍內(nèi)，可見皮質(zhì)及紋狀體區(qū)有片狀壞死，細胞水腫明顯，細胞外間隙增寬，細胞核固縮，核仁消失。G20（25.0 mg·kg-1）及G（25.0 mg·kg-1）組：缺血區(qū)水腫較缺血組明顯減輕，只有少量灶狀壞死，胞漿及核較清晰，細胞周圍間隙增寬不明顯，細胞核固縮減輕，還可見核仁等結(jié)構(gòu)，詳見圖2。

圖2　G20對腦缺血再灌注大鼠腦組織病理形態(tài)學的影響A -假手術(shù)組，B -模型組，C - G組（25.0 mg·kg-1），D - G20組（25.0 mg·kg-1）（ HE ×200）Fig 2 The effect of G20 on the pathomorphology of rat brain after cerebral ischemia and reperfusionA - sham-operation group， B - model group， C - G group （25.0 mg·kg-1）， D - G20 group （25.0 mg·kg-1） （HE ×200）

3.5神經(jīng)細胞凋亡

由圖3所示：假手術(shù)組幾乎沒有凋亡細胞形成。模型組有較多的凋亡細胞，細胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀。G20（25 mg·kg-1）組凋亡細胞數(shù)量減少，有較少的細胞染色質(zhì)的濃縮，與模型組比較，有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

3.6Caspase-3蛋白

由圖4所示：假手術(shù)組大鼠腦組織的caspase-3陽性細胞較少，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織的caspase-3陽性較多，其表達主要位于神經(jīng)元胞質(zhì)及部分突起，一部分位于核內(nèi)。G20（25.0 mg·kg-1）及G（25.0 mg·kg-1）與模型組比較，缺血側(cè)腦組織的caspase-3陽性表達較少。

3.7藥品不良反應(yīng)

G組大鼠在用藥過程中有2/8（25%）大鼠出現(xiàn)尿液變紅的現(xiàn)象；G20組大鼠未出現(xiàn)尿液變紅的現(xiàn)象。

4 討論

4.1新藥研究的必要性

現(xiàn)有的神經(jīng)保護藥物米帕明、阿司匹林等報道有抗腦缺血再灌注損傷作用［8］，但大多療效不佳、副作用較多，臨床迫切需要一種既能減輕再灌注損傷，副作用又少的藥物。

圖3　G20對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡數(shù)目的影響A - 假手術(shù)組，B - 模型組，C - G組（25.0 mg·kg-1），D - G20組（25.0 mg·kg-1）（TUNEL×400）Fig 3 The effect of G20 on the number of neuronal apoptosis in rats after cerebral ischemia and reperfusionA - sham-operation group， B - model group， C - G group （25.0 mg·kg-1）， D - G20 group （25.0 mg·kg-1） （TUNEL×400）

圖4　G20對腦缺血再灌注大鼠腦組織caspase-3表達的影響A - 假手術(shù)組，B - 模型組，C - G組（25.0 mg·kg-1），D - G20組（25.0 mg·kg-1）（SABC×200）Fig 4 The effect of G20 on the expression of caspase-3 in cerebral ischemia reperfusion brain tissue in ratsA - sham-operation group， B - model group， C - G group （25.0 mg·kg-1）， D - G20 group （25.0 mg·kg-1） （SABC×200）

4.2模型的制作

本實驗選取最常用的局灶性腦缺血再灌注損傷模型，操作方法簡單，手術(shù)時間從動物麻醉至造模成功一般只需在20 min內(nèi)即可完成，本實驗的造模成功率為80%左右，神經(jīng)缺損較明顯，梗死灶部位比較恒定，與陳衛(wèi)偉等［9］造模成功率相似。實驗過程中通過觀察腦缺血后4 h及24 h的大鼠神經(jīng)行為學、腦梗死面積、腦含水量及病理形態(tài)學改變，一方面證明了模型制作的成功，另一方面證實了G20可明顯減輕腦缺血再灌注損傷。

4.3腦缺血再灌注損傷機制

腦缺血再灌注損傷機制較為復(fù)雜，主要與自由基過度形成、興奮性氨基酸毒性作用、細胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)等多種機制有關(guān)［10］。近年來研究表明，神經(jīng)細胞凋亡與腦缺血性損傷有著密切關(guān)系，細胞凋亡可能受相關(guān)凋亡基因調(diào)控［11］。葛根素的保護機制非常復(fù)雜，已經(jīng)較多報道［12］，如能上調(diào)大鼠海馬梗死灶周圍Bcl-2的表達，抑制Bax的表達減輕大鼠海馬區(qū)缺血再灌注損傷［13］。本實驗證實G與G20均可減少缺血區(qū)凋亡細胞的數(shù)目，從而起到神經(jīng)保護作用。

Caspase家族在細胞凋亡的分子機制中居中心地位，Li等［14］研究表明，干預(yù)caspase-3的激活，可有效抑制凋亡的發(fā)生。Nadia等［15］也證實己酮可可堿可以減輕腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)細胞凋亡，減少caspase-3的表達。Hu等［16］研究證實川芎內(nèi)酯也通過下調(diào)caspase-3發(fā)揮腦保護性作用。本實驗?zāi)X缺血再灌注損傷后大鼠凋亡細胞數(shù)目及caspase-3的表達較假手術(shù)組明顯增加，G20組減少了大鼠凋亡細胞數(shù)目及caspase-3的表達，究竟G20是否是通過減少caspase-3的表達來減少細胞凋亡的，還需要進一步的研究加以證實。

4.4藥品不良反應(yīng)的觀察結(jié)果

本實驗觀察到了葛根素可引起大鼠尿液變紅這一現(xiàn)象，但未對G及G20進行溶血性實驗比較，以進一步驗證G20較G產(chǎn)生溶血反應(yīng)少，是本實驗存在的局限性。

綜上所述，G20對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護性作用，并且可能通過減少caspase-3的表達減輕細胞凋亡，未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象，其具體作用機制將進行更深入的研究。

［1］ 黃敏娟，賀煜星，丁選勝.不同輸液配伍葛根素注射液對溶血的影響［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2015，35（5）：425-429.

［2］ 陳小飛，王永安.氨基酸及其受體在腦缺血中的作用及相關(guān)藥物應(yīng)用［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2010，7（2）：116-119.

［3］ 鄢良春，王林，呂秋軍，等.葛根素衍生物抗心肌缺血再灌注損傷的活性篩選［J］.中國藥房，2008，19（3）：172-174.

［4］ Zehendner CM， Librizzi L， de Curtis M， et al. Caspase-3 contributes to ZO-1 and Cl-5 tight-junction disruption in rapid anoxic neurovascular unit damage［J］. PLoS One， 2011， 6（2）: e16760.

［5］ Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989， 20（1）: 84-91.

［6］ 張榮媛，張宏偉，尚愛加.大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型制備及行為學評價標準的改進［J］.軍醫(yī)進修學院學報，2008，29 （5）：422-423.

［7］ Petullo D， Masonic K， Lincoln C， et al. Model development and behavioral assessment of focal cerebral ischemia in rats［J］. Life Sci， 1999， 64（13）: 1099-1108.

［8］ 王立英，楊世杰.腦缺血再灌注損傷機制及其藥物治療方法的研究進展［J］.吉林大學學報，2012，38（6）：1227-1231.

［9］ 陳衛(wèi)偉，楊留才，潘施文，等.線栓法制備SD大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（50）：9377-9380.

［10］ 王光勝，耿德勤.腦缺血/再灌注損傷機制研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2011，17（24）：3753-3756.

［11］ 陳東麗，陳旭東，夏翠英.天麻對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細胞凋亡的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（3）：148-150.

［12］ 黃雄峰，汪建民.葛根素的神經(jīng)保護作用機制研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21（4）：224-230.

［13］ 丁小明，廖丹瓊.葛根素減輕大鼠海馬區(qū)缺血/再灌注損傷［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2016，36（4）：534-536.

［14］ Li Q， Li Z， Xu XY， et al. Neuroprotective properties of picroside Ⅱ in a rat model of focal cerebral ischemia［J］. Int J Mol Sci，2010， 11（11）: 4580-4590.

［15］ Nadia Sharifi Z， Movassaghi S， Mohamadzadeh F， et al. Reduction in ischemic brain injury following the administration of pentoxifylline after transient global ischemia-reperfusion in a rat model［J］. Med J Islam Repub Iran， 2015， 29: 193.

［16］ Hu Y， Duan M， Liang S， et al. SenkyunolideⅠ protects rat brain against focal cerebral ischemia-reperfusion injury by upregulating p-Erk1/2， Nrf2/HO-1 and inhibiting caspase-3［J］. Brain Res， 2015， 1605: 39-48.

Neuroprotective effects of puerarin derivative on focal cerebral ischemia and reperfusion and its effect on expression of caspase-3 in rats

ZHANG Hong-wei1，2， ZHANG Fan1， DONG Zhi2， ZHU Yi3
（1. Department of Clinical Pharmacy， Liaocheng City People's Hospital，Liaocheng 252000， China； 2. Teaching and Research Section of Biochemical and Molecular Pharmacology， College of Pharmacy， Chongqing Medical University， Chongqing 400006， China； 3. Hainan Provincial Key Laboratory for Pharmaceutical Quality Research， Hainan Provincial Institute for Drug Control， Haikou 570216， China）

Objective: To observe the protection effect of puerarin derivative （G20） on focal cerebral ischemia and reperfusion injury in rats， and explore whether its mechanism is associated with the expression of caspase-3. Methods: Model of focal cerebral ischemia and reperfusion was induced using an intraluminal monofilament blockade by Longa. The rats were randomly divided into six groups， which were the sham-operation group， the model group， G group （puerarin 25.0 mg·kg-1）， G20 groups （12.5，25.0， 50.0 mg·kg-1）. The rats in drug groups were administrated drugs in 1.5 h and 6 h after ischemia by tail vein. The neurological deficits were evaluated with neuroethology， the infarction size and brain edema after ischemia， respectively. The pathology of cerebral tissue was evaluated after ischemia by HE dyeing for observing the protective effect of G20. Neuronal apoptosis by TUNEL and the expression of caspase-3 by SABC were used for researching the mechanism. Results: G20 obviously improved movement of neuromuscular and vestibular function in 4 h and 24 h after ischemia， and obviously reduced the infarction size and brain edema，improved pathological morphology of rat brain after cerebral ischemia and reperfusion. Compared with G group， no adverse reaction such as red urine was found in G20 group. G20 decreased neuronal apoptosis and down-regulated the expression of caspase-3 of rats brain after cerebral ischemia and reperfusion. Conclusion: G20 had the protective effect on brain tissue damaged by focal ischemia and reperfusion in rats. The mechanism of G20 may be related to the inhibition of apoptosis by down-regulating the expression of caspase-3.

Puerarin； Puerarin derivative； Focal cerebral ischemia and reperfusion； Apoptosis； Caspase-3

R96

A

1672 - 8157（2016）04 - 0206 - 05

國家自然科學基金面上項目（81173066）

董志，男，教授，博士生導師，主要從事神經(jīng)藥理方面的研究。E-mail：zhidong073@hotmail.com

張宏偉，女，主管藥師，主要從事臨床藥學工作。E-mail：zhhwchq@163.com

2016-04-01

2016-06-17）