通痹化濕顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

竇　霞，靳子明，甄小龍（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省中藥炮制及質(zhì)控工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730020）

通痹化濕顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

竇霞1，2，靳子明1，2，甄小龍2*
（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省中藥炮制及質(zhì)控工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730020）

目的 建立通痹化濕顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對制劑中青風(fēng)藤、雞血藤、千年健及威靈仙進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法對處方中青風(fēng)藤所含青藤堿的含量進(jìn)行測定。Waters XTerra RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，以1%三乙胺調(diào)節(jié)pH值至9.0）（58∶42）作為流動相；檢測波長為262 nm。結(jié)果 建立了青風(fēng)藤、雞血藤、千年健及威靈仙具有專屬性的定性鑒別方法；青藤堿含量測定加樣回收率為95.69%，RSD為0.79%。結(jié)論 本方法簡便可靠，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

通痹化濕顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；定性鑒別；青藤堿；含量測定

通痹化濕顆粒是我院風(fēng)濕科專家經(jīng)驗(yàn)方，由青風(fēng)藤、雞血藤、秦艽、絡(luò)石藤、千年健、威靈仙等8味藥組成，具有通經(jīng)活絡(luò)，蠲痹止痛，祛風(fēng)化濕的功效。主要用于治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及其他風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎證屬肝腎不足、風(fēng)濕阻絡(luò)證。本方經(jīng)醫(yī)院臨床多年使用，療效確切，故將其開發(fā)為院內(nèi)制劑。為了提高院內(nèi)制劑質(zhì)量的可控性，分別研究制定方中四味藥材的薄層鑒別和一個含量測定項(xiàng)，用以控制本品的質(zhì)量?，F(xiàn)將其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法報告如下。

1　儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀；MWD型紫外可見檢測器；Waters XTerra RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。青藤堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0774-201206，供含量測定用）；甲醇：色譜純（美國天地公司）；其余試劑均為分析純；通痹化濕顆粒，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院自制（批號：111010）。

2　方法與結(jié)果

2.1通痹化濕顆粒薄層色譜鑒別

2.1.1青風(fēng)藤薄層色譜鑒別［1，2］取本品4 g，研細(xì)，加70%乙醇30 ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液。再取青風(fēng)藤陰性對照樣品，同法制成陰性對照液。另取青藤堿對照品適量，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按薄層色譜法（中國藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液及對照品溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一含有2%氫氧化鈉的硅膠GF254薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶3∶1）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢識。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)。

2.1.2雞血藤薄層色譜鑒別［3］取本品1袋，研細(xì)，加乙醚30 ml冷浸30分鐘，時時振搖，傾出乙醚后，殘?jiān)?5%乙醇50 ml超聲（250 w，40 kHz）處理20分鐘，濾過，濾液蒸干后加水20 ml溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙酸乙酯40 ml提取，回收乙酸乙酯，殘?jiān)右掖?.5 ml使其溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按薄層色譜法（中國藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（9∶4）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈（365 nm）下檢識。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.1.3千年健薄層色譜鑒別 取本品1袋，加水50 ml加熱回流提取30分鐘，放冷，過濾，濾液加乙醚30 ml萃取2次，每次30 ml，取乙醚液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? ml，作為供試品溶液。另取千年健對照藥材1 g，加水30 ml，加熱回流提取1小時，濾過，取濾液10 ml，乙醚萃取3次，每次10 ml，蒸干乙醚，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? ml，作為對照藥材溶液。按薄層色譜法（中國藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.1.4威靈仙薄層色譜鑒別［4］取本品1袋，加水20 ml超聲（250 w，40 kHz）處理30分鐘，過濾，加二氯甲烷萃取3次，每次30 ml，合并萃取液，濃縮至干，用二氯甲烷1 ml溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。另取威靈仙對照藥材1 g，加少量水潤濕30分鐘，加入正丁醇50 ml回流提取3次，每次3小時，過濾，濾液合并，回收正丁醇，加二氯甲烷1 ml溶解殘?jiān)瞥蓪φ账幉娜芤?。按薄層色譜法（中國藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙醚（7∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢識。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2通痹化濕顆粒中青藤堿含量測定［1，5，6］

2.2.1色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑；甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，以1%三乙胺調(diào)節(jié)pH值至9.0）（58∶42）作為流動相；檢測波長為262 nm。理論板數(shù)按青藤堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于5 000。

2.2.2溶液的制備（1）對照品溶液的制備：取青藤堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含136 μg的溶液，即得。

（2）供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下本品，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲（250 W，40 kHz）處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（3）陰性對照品溶液制備：取陰性樣品（缺青風(fēng)藤），按供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性研究 在上述條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各5μl，注入高效液相色譜儀，結(jié)果表明，陰性供試品對青藤堿峰無干擾（見圖1）。青藤堿峰理論塔板數(shù)大于5 000，分離度大于1.5，已達(dá)到基線分離，拖尾因子符合要求。為確保定量分析的準(zhǔn)確性，在系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中青藤堿的理論板數(shù)不得低于5 000。

A.對照品溶液　B.供試品溶液　C.陰性供試品溶液圖1　各溶液高效液相色譜圖

2.2.4線性關(guān)系考察 精密稱取青藤堿對照品13.70 mg，置20 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為685 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。分別精密吸取上述溶液0.5 ml，1.0 ml，2.0 ml，4.0 ml，10 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進(jìn)樣5 μl，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明青藤堿在34.25 μg/ml～685 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=4.859 2X+4.449 1，r=1.000 0。

2.2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品（137μg/ml）溶液5 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得峰面積積分值，計(jì)算RSD=0.80%。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品按正文含量測定項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液5μl，分別于第0、1、2、4、8、12小時進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣6次，測得峰面積積分值，計(jì)算RSD=0.38%。結(jié)果表明青藤堿峰面積在12小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取本品研細(xì)，取6份，每份取約2 g，精密稱定，按正文含量測定項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液5 μl進(jìn)行測定，計(jì)算含量。結(jié)果表明該法測定青藤堿含量重復(fù)性良好，青藤堿平均含量為1.70 mg/g，RSD=0.48%。

2.2.8加樣回收率試驗(yàn) 取本品研細(xì)，分6份，每份約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入851 μg/ml的青藤堿對照品溶液2 ml，揮干溶劑后，再精密加入甲醇25 ml，以下按正文含量測定項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果表明回收率符合要求（95%～105%），該方法回收率良好（結(jié)果見表1）。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9樣品含量測定 取本品3批（批號141010、141101、150103）制劑樣品，按正文含量測定項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各5 μl，注入高效液相色譜儀，測定，計(jì)算，結(jié)果見表2。

3　討論

（1）方中青風(fēng)藤為君藥，故對青風(fēng)藤中的主要有效成分青藤堿做了含量測定，參考藥典方法［1］，對色譜條件做了系統(tǒng)考察，結(jié)果表明甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，以1%三乙胺調(diào)節(jié)pH值至9.0）（58∶42）系統(tǒng)作為流動相可使供試品色譜中青藤堿峰與其他峰能夠達(dá)到很好的分離，且陰性樣品無干擾。又對供試品提取溶劑、提取時間及溶劑用量做了考察。通過對提取效率、供試品溶液的顏色、色譜圖的雜質(zhì)及操作過程是否方便等因素的全面考察，確定了供試品溶液的制備方法。

（2）本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定中，參考藥典方法對制劑中所有藥材進(jìn)行薄層鑒別研究，但因藥味較多，部分藥材鑒別有陰性干擾，藥典方法多不適用，在此基礎(chǔ)上通過多次試驗(yàn)摸索，最終確定了青風(fēng)藤、雞血藤、千年健及威靈仙的最佳薄層鑒別方法，均無陰性干擾，專屬性較強(qiáng)，故列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（3）本項(xiàng)目研究中，對常規(guī)檢查項(xiàng)目按照藥典標(biāo)準(zhǔn)一一做了研究并制定標(biāo)準(zhǔn)。重點(diǎn)研究處方中各藥的定性鑒別和有效成分的含量測定，對處方中一半的藥物做了定性質(zhì)量控制，并引入高效液相色譜法控制制劑的含量，這在院內(nèi)制劑研發(fā)中，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)屬于領(lǐng)先水平。

表2　樣品中青藤堿的含量測定結(jié)果

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］陳勇，鄧家剛，王勤，等.抗痛風(fēng)顆粒中青風(fēng)藤TLC鑒別與青藤堿的含量測定［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，13（6）：11-13.

［3］韋娟.雞血藤薄層鑒別方法改進(jìn)［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3（7）：170.

［4］鐘保恒.威靈仙藥材薄層色譜鑒別方法的改進(jìn)［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2009，12（9）：30-31.

［5］李道中.青藤堿凝膠的制備及凝膠中青藤堿的含量測定［J］.安徽醫(yī)藥，2010（7）：766-767.

［6］張紅，侯敏，段勇民，等.HPLC法測定秦息痛片中青藤堿的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2011（2）：106-107.

（*通訊作者：甄小龍）

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1671-1246（2016）15-0099-03