丹紅、參麥和參附3種注射液抗氧化能力的研究*

代向東，胡曉慧，閆海峰，王　怡

·中藥研究·

丹紅、參麥和參附3種注射液抗氧化能力的研究*

代向東，胡曉慧，閆海峰，王怡

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

［目的］探討丹紅、參麥和參附3種注射液的抗氧化活性強(qiáng)弱。［方法］采用1，1二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、鐵離子還原法、總抗氧化能力試劑盒法3種方法測(cè)定丹紅、參麥和參附3種注射液的抗氧化能力。［結(jié)果］丹紅、參麥和參附3種注射液均具有DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力和抗氧化能力。［結(jié)論］3種注射液均具有抗氧化能力，其強(qiáng)弱順序?yàn)椋旱ぜt注射液＞參麥注射液＞參附注射液。

抗氧化；丹紅注射液；參麥注射液；參附注射液

丹紅注射液主要含有從丹參、紅花提取的有效化學(xué)成分，臨床常用于防治心腦血管疾病［1-3］，比如冠心病、心絞痛、心肌梗死，缺血性腦病、腦血栓等。參麥注射液主要含有從人參、麥門冬、五味子提取的有效化學(xué)成分，臨床上對(duì)于冠心病的防治應(yīng)用廣泛，現(xiàn)代研究表明其具有強(qiáng)心，調(diào)節(jié)血壓，改善腦、肺、腎、消化系統(tǒng)功能，提高機(jī)體免疫力，對(duì)惡性腫瘤的化療有增效、減毒等作用［4-5］。參附注射液主要含有從紅參和附片提取的有效化學(xué)成分，研究表明其能改善腦缺血以及抗自由基氧化神經(jīng)元的作用［6-7］。有研究表明，丹紅、參麥、參附3種注射液均具有抗氧化活性［8-10］并對(duì)心腦血管疾病均有防治作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、鐵離子還原法、總抗氧化能力檢測(cè)法測(cè)定了3種注射液的抗氧化能力強(qiáng)弱。

1　試劑與儀器

1.1主要試劑丹紅注射液（菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)14041001），參麥注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)1402244），參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)14061001），抗壞血酸（天津市北方醫(yī)學(xué)化學(xué)試劑廠，批號(hào)20120207），DPPH（Sigma公司，批號(hào)STBB0827V），鐵氰化鉀［K3Fe（CN）6，天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠，批號(hào)20130318］，三氯乙酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20150320），氯化鐵（天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠，批號(hào)20140929），總抗氧化試劑盒（天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠，批號(hào)S0119）。

1.2主要儀器分析天平（Mettle Toledo公司），酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）。

2　方法

2.1DPPH法測(cè)定自由基清除能力將不同濃度的樣品溶液100 μL加入到96孔板中，再向其中加入100 μL 0.16 g/L的DPPH甲醇溶液，混勻。丹紅、參麥及參附3種注射液均具有顏色，為了消除顏色對(duì)該體系的影響，將100 μL甲醇與100 μL不同濃度的樣本溶液混勻，作為空白對(duì)照；再將100 μL甲醇與100 μL DPPH溶液混勻，作為陰性對(duì)照。在37℃條件下，反應(yīng)50min，測(cè)定517nm波長(zhǎng)的OD值。

2.23種注射液對(duì)鐵離子還原能力的測(cè)定還原力的測(cè)定，實(shí)質(zhì)上是檢驗(yàn)物質(zhì)是否為良好的電子供應(yīng)者的過(guò)程。還原能力比較強(qiáng)的物質(zhì)供應(yīng)的電子除可以還原氧化性物質(zhì)外，也可與自由基發(fā)生反應(yīng)，使自由基成為穩(wěn)定的物質(zhì)。

2.2.1沒(méi)食子酸（GAE）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取PBS，GAE標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用甲醇配成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取等量標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.2）和鐵氰化鉀（1%，W/V），于50℃下混勻，水浴20 min。加入三氯乙酸（10%，W/V）后，取上清液用水稀釋1倍，加入氯化鐵溶液（0.1%，W/V），靜置30 min后，在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，以甲醇溶液代替GAE作為空白溶液，每份樣品平行操作3次。以GAE的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制GAE的標(biāo)準(zhǔn)曲線= 0.004 9X+0.084 4（r2＝0.994 9）。

2.2.2GAE當(dāng)量的計(jì)算分別取等量丹紅、參麥、參附3種注射液于EP管中，按照“2.2.1”項(xiàng)操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用回歸方程求出供試品溶液中折合GAE的濃度，即GAE當(dāng)量。空白組用超純水代替氯化鐵溶液（0.1%，X/V）。

2.3總抗氧化能力試劑盒法測(cè)定3種注射液的抗氧化能力總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒，即Total Antioxidant Capacity Assay Kit，簡(jiǎn)稱 T-AOC Assay Kit，是一種采用2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）作為顯色劑，可以對(duì)各種抗氧化物（antioxidant）溶液的總抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。

2.3.1水溶性維生素E（Trolox）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別配制成1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15 mmol/L的溶液。在96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中，加入200 μL ABTS工作液，再加入10 μL各種濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，輕輕混勻。6 min后，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，以Trolox的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2Trolox當(dāng)量的計(jì)算96孔板每個(gè)檢測(cè)孔中加入200μLABTS工作液。空白對(duì)照孔中加入10μL PBS溶液，樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各種樣品，輕輕混勻。6 min后，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1丹紅、參麥、參附3種注射液清除DPPH自由基能力比較通過(guò)DPPH自由基清除法，以半抑制濃度（IC50）值為指標(biāo)，測(cè)定丹紅、參麥、參附3種注射液的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹紅、參麥、參附3種注射液均具有較好的抗氧化活性，其中以丹紅的抗氧化活性為最好，參麥注射液介于丹紅與參附注射液之間。見(jiàn)圖1。

圖1　丹紅、參麥、參附3種注射液IC50的比較Fig.1　Comparison of IC50of Danhong，Shenmai and Shenfu injections

3.2丹紅、參麥、參附3種注射液對(duì)鐵離子的還原能力測(cè)定通過(guò)測(cè)定3種注射液對(duì)鐵離子的還原能力，得知丹紅、參麥及參附3種注射液均具有良好的鐵離子還原能力，其還原能力測(cè)定順序?yàn)榈ぜt注射液＞參麥注射液＞參附注射液。見(jiàn)圖2。

圖2　丹紅、參麥、參附3種注射液GAE當(dāng)量比較Fig.2　Comparison of the GAE of Danhong，Shenmai and Shenfu injections

3.3丹紅、參麥、參附3種注射液的總抗氧化能力測(cè)定通過(guò)總抗氧化能力試劑盒法，測(cè)定3種注射液的抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹紅、參麥、參附3種注射液均具有抗氧化能力，其抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)榈ぜt注射液＞參麥注射液＞參附注射液。見(jiàn)圖3。

4　討論

近些年來(lái)，大量研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能異常的重要原因之一［11］，因此研究抗氧化的病生理機(jī)制及防治是關(guān)鍵。氧化應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損或氧自由基生成過(guò)多，進(jìn)而氧自由基使機(jī)體組織與細(xì)胞受到損害的一種反應(yīng)。氧化應(yīng)激與各種病理生理機(jī)制相互作用，共同促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［12］。因此，抗氧化治療能有效地保護(hù)、改善心肌和血管的結(jié)構(gòu)和功能，為臨床治療心血管疾病開辟了新的思路和方法。研究證實(shí)，尋找天然、安全的生物抗氧化劑逐漸成為研究熱點(diǎn)［13-14］。中國(guó)中藥資源極其豐富，是天然抗氧化劑的重要來(lái)源，并且中草藥的抗氧化性已經(jīng)引起了充分的重視［15-16］。本實(shí)驗(yàn)中，采用DPPH自由基清除能力測(cè)定法、鐵離子還原能力法、總抗氧化能力試劑盒法3種方法，測(cè)定丹紅、參麥和參附3種注射液抗氧化能力的強(qiáng)弱，其中以丹紅注射液的抗氧化活性最好，參麥注射液居于丹紅注射液與參附注射液之間，抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)榈ぜt注射液＞參麥注射液＞參附注射液。

圖3　丹紅、參麥、參附3種注射液抗氧化能力比較Fig.3　Comparison of antioxidant activities of Danhong，Shenmai and Shenfu injections

［1］高薇，石燕燕，索冬梅.倍通丹紅注射液治療不穩(wěn)定型心絞痛的臨床療效觀察［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2009，36（2）:235-236.

［2］王艷秋.丹紅注射液治療冠心病臨床療效觀察［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008，3（2）:62-63.

［3］王雪瑞.丹紅注射液治療急性腦梗死的臨床觀察［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008，3（2）:57-58.

［4］林麗娜，張圣恭，王萬(wàn)鐵，等.參麥注射液對(duì)兔肺缺血/再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2007，14（6）: 361-363.

［5］曾島，吳娟環(huán)，黃岸佳，等.參麥注射液對(duì)膿毒血癥臨床療效研究［J］.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2013，33（S1）:118-119，121.

［6］Yang LJ，Wang J，Tian ZF，et al.Shenfu injection attenuates neonatal hypoxic-ischemic brain damage in rat［J］.Neurol Sci，2013，34:1571-1574.

［7］Yuan J，Cheng Y，Qin D.Clinical study of Shenfu injection on the post-operative cognitive dysfunction in senile patient receiving the orthopedic surgeries after general anesthesia［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2011，31（11）:1466-1470.

［8］Liu HT，Wang YF，Olaleye O，et al.Characterization of in vivo antioxidant constituents and dual-standard quality assessment of Danhong injection［J］.Biomed Chromatogr，2013，27（5）:655-663.

［9］廖力夫，周昕.丹參素抑制過(guò)亞硝酸根引發(fā)的魯米諾發(fā)光和蛋白質(zhì)酪氨酸硝化［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2002，19（2）:132-134.

［10］蔣旭宏，黃小民.紅花注射液對(duì)急性肝損傷大鼠抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（4）:832-834.

［11］Powell SR，Hall D.Use of salicylate as a probe for hydroxyl radical formation in isolat ed ischemic rat hearts［J］.Free Radical Biol Med，1990，9（2）:133-141.

［12］Yamomoto H，Hirose K，Hayasaki Y，et al.Mechanism of enhanced lipid peroxidation in the liver of Long-Evans cinnamon（LEC）rats［J］. Archives of toxicology，1999，73（8-9）:457-464.

［13］張尊聽，賀云，劉謙光，等.分光光度法測(cè)定太白山20種中草藥的抗氧化活性［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2002，21（2）:50-52.

［14］王和才，胡秋輝.DPPH法測(cè)定紫紅薯提取物清除自由基的能力［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（1）:132-135.

［15］勾明玥，劉梁，張春枝.采用DPPH法測(cè)定26種植物的抗氧化活性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（3）:148-150.

［16］李紅，張?jiān)?應(yīng)用DPPH法測(cè)定蘋果提取物的抗氧化能力［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，36（1）:35-38.

（本文編輯：高杉，于春泉）

Study on the antioxidant activities of Danhong，Shenmai and Shenfu injection

DAI Xiang-dong，HU Xiao-hui，YAN Hai-feng，WANG Yi
（Tianjin State Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］This study aims to explore the antioxidant activites of Danhong，Shenmai and Shenfu injection.［Methods］Three methods，DPPH free radical scavenging，iron ion reduction method，total antioxidant capacity reagent box method，were used to determine the antioxidant capacity of three kinds of injection.［Results］Three injections were all of DPPH free radical scavenging，iron ion reduction and antioxidant capacity.［Conclusion］Three kinds of injection have antioxidant ability，the order is:Danhong injection＞Shenmai injection＞Shenfu injection.

antioxidant；Danhong injection；Shenmai injection；Shenfu injection

R285

A

1672-1519（2016）02-0104-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.02.11

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB518404）。

代向東（1990-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樾难芩幚硌芯俊?/p>

王怡，E-mail:vip_wangyi@126.com。

（2015-10-20）