大株紅景天注射液對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用*

王亞東，Patrick Asare Fordjour，李　瀾，魏　靜，樊官偉（天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193）

大株紅景天注射液對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用*

王亞東，Patrick Asare Fordjour，李瀾，魏靜，樊官偉
（天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193）

［目的］觀察大株紅景天注射液抗心肌缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，并探討其抗心肌缺氧/復(fù)氧可能的機(jī)制。［方法］原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白對照組；缺氧/復(fù)氧組；缺氧/復(fù)氧分別加大株紅景天注射液5、10、20 mL/L組。加藥孵育12 h后，缺氧培養(yǎng)9 h，隨后常氧培養(yǎng)2 h。噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞增殖，CMH2DCF-DA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）的生成量，JC-1熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位，以及測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD活力及其基因表達(dá)量。［結(jié)果］大株紅景天注射液增加了缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的活力，減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的降低，同時(shí)增加了心肌細(xì)胞內(nèi)SOD的活力及其基因表達(dá)量。［結(jié)論］大株紅景天注射液對缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

大株紅景天注射液；缺氧/復(fù)氧；原代心肌細(xì)胞；氧化應(yīng)激

流行病學(xué)調(diào)查顯示，心血管疾病在全球范圍內(nèi)已成為現(xiàn)今威脅人類健康的主要原因之一［1-2］。在中國每年約300萬人死于心腦血管疾病，占每年總死亡病因的51%［3］。研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病的發(fā)生發(fā)展與活性氧簇（ROS）關(guān)系密切［4-5］。ROS在細(xì)胞內(nèi)過量蓄積，是由于機(jī)體受到氧化性刺激導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基的消除與產(chǎn)生打破了原有平衡［6］。近年來很多報(bào)道稱，紅景天在心血管保護(hù)方面有很強(qiáng)的作用，能有效減小心肌缺血再灌注損傷、減少心肌梗死面積、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用［7-8］。大株紅景天注射液的主要成分為紅景天，其在臨床上常用于治療冠心病穩(wěn)定型勞累性心絞痛。本研究擬采用缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型，探討大株紅景天注射液對缺氧/復(fù)氧損傷的原代心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑出生1～3 d健康SD大鼠，雌雄不限（中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），大株紅景天注射液（通化玉圣藥業(yè)有限公司），胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶（Solarbio公司），Ⅱ型膠原酶（Sigma公司），DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco公司），CMH2DCFDA探針（Invitrogen公司），JC-1探針（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究院）。

1.2主要儀器缺氧培養(yǎng)室（Thermo Forma公司），二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（Thermo 3111），Ti-U倒置熒光顯微鏡（日本尼康），Osterode離心機(jī)（德國Thermo Fisher），多功能讀板機(jī)（ThermoFlexstation3）。

1.3原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)無菌條件下取出生后1～3 d SD乳鼠心臟若干，采用0.06%胰酶和0.1%Ⅱ型膠原酶在37℃恒溫?fù)u床中震蕩消化5～6次，并收集上清液，最后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基以終止。終止后的消化液用200目篩過濾去除未消化組織塊，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用全培基將細(xì)胞沉淀充分而輕柔地吹打成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，放入37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同，采用差速貼壁90 min，接種至75 mL培養(yǎng)瓶中，24 h后更換培養(yǎng)液，同時(shí)小心洗去除未貼壁細(xì)胞，再經(jīng)24～48 h，待心肌細(xì)胞大部分伸展開連成一片，同步搏動(dòng)時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組將培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組：1）空白對照組。2）模型組（H/R組）：缺氧9 h，復(fù)氧2 h。3）藥物組：在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為5、10、20 mL/L藥物預(yù)孵育12 h后，缺氧9 h，復(fù)氧2 h。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1細(xì)胞活力檢測取生長狀態(tài)良好的原代心肌細(xì)胞，用含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化，制成2.5×108個(gè)/L的細(xì)胞懸液，均勻接種到96孔板，每孔100 μL。24 h后，隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)復(fù)孔。正常組和模型組加入100 μL DMEM/F12基礎(chǔ)培基，各給藥組加入等體積終濃度分別為5、10、20 mL/L的藥物。12 h后，換成條件培養(yǎng)基，正常組常氧條件下培養(yǎng)，模型組及給藥組H/R處理，噻唑藍(lán)法（MTT）檢測細(xì)胞活力。

1.5.2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測取生長狀態(tài)良好的原代心肌細(xì)胞，用含EDTA的胰酶消化，制成2.5× 108個(gè)/L的細(xì)胞懸液，均勻接種到96孔板，每孔100μL。24 h后，隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)復(fù)孔。加入不同濃度含有藥物（5、10、20 mL/L）的培養(yǎng)基（正常對照組和雙氧水（H2O2）模型組加入無血清DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基）誘導(dǎo)12 h后，各組按條件處理。棄去各孔培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次后，各孔加入100 μL CMH2DCFH-DA工作液，37℃CO2培養(yǎng)箱避光孵育30 min后，棄去工作液，用PBS清洗兩次，每次5 min。每孔加入100 μL Hanks后上機(jī)檢測，設(shè)定激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.5.3細(xì)胞線粒體膜電位的檢測同上述方法處理后的細(xì)胞，每孔加入100 μL JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，上機(jī)檢測。JC-1單體的最大激發(fā)波長為515 nm，最大發(fā)射波長為529 nm；JC-1聚合物的最大激發(fā)波長為585 nm，最大發(fā)射波長為590 nm。F=F（585/590）/F（515/529）。

1.5.4細(xì)胞內(nèi)SOD活性檢測具體方法參照超氧化物歧化酶測定試劑盒說明書操作。

1.5.5細(xì)胞內(nèi)SOD基因表達(dá)的檢測取生長狀態(tài)良好的原代心肌細(xì)胞，用含EDTA的胰酶消化，制成2.5×108個(gè)/L的細(xì)胞懸液，均勻接種到6孔板，每孔2 mL。24 h后，隨機(jī)分為5組，正常組和模型組加入100 μL DMEM/F12基礎(chǔ)培基，各給藥組加入等體積終濃度分別為5、10、20 mL/L的藥物。12 h后，換成條件培養(yǎng)基，正常組常氧條件下培養(yǎng)，模型組及給藥組H/R處理。加入Trizol裂解液，按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。RT-PCR操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較若工齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大株紅景天注射液對原代心肌細(xì)胞活力的影響

2.1.1大株紅景天注射液對正常原代心肌細(xì)胞活力的影響與空白對照組相比，大株紅景天注射液各劑量組給24 h后，對正常細(xì)胞活力無明顯影響。結(jié)果見表1。

表1　大株紅景天注射液對正常原代心肌細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.1 The effects of sofren injection on normal cell viability（±s）

表1　大株紅景天注射液對正常原代心肌細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.1 The effects of sofren injection on normal cell viability（±s）

組別OD（A 450）空白對照組0.390±0.009大株紅景天注射液低劑量組0.393±0.017大株紅景天注射液中劑量組0.389±0.008大株紅景天注射液高劑量組0.390±0.015動(dòng)物數(shù)6666濃度（mL/L）-05 10 20

2.1.2大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞活力的影響與空白對照組相比，H/R損傷后，細(xì)胞活力明顯下降；而給予大株紅景天注射液后，中、高劑量組與模型組相比細(xì)胞活力明顯改善。結(jié)果見表2。

表2　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.2The effects of sofren injection on cell viability with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

表2　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.2The effects of sofren injection on cell viability with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別OD（A 450）空白對照組0.360±0.027**模型組（H/R組）0.274±0.015##*大株紅景天注射液低劑量組0.279±0.008**大株紅景天注射液中劑量組0.308±0.026**大株紅景天注射液高劑量組0.337±0.019**動(dòng)物數(shù)濃度（mL/L）66666 --0 5 10 20

2.2大株紅景天注射液對原代心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響H/R損傷原代心肌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯增加，大株紅景天注射液各劑量組與模型組比較，中、高劑量組抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的效果明顯。結(jié)果見表3。

2.3大株紅景天注射液對原代心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響H/R損傷后與空白對照組相比，原代心肌細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低；與模型組相比，大株紅景天注射液中、高組可明顯抑制細(xì)胞線粒體膜電位的降低，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。結(jié)果見表4。

表3　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響（±s）Tab.3The effects of sofren injection on ROS generation with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

表3　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的影響（±s）Tab.3The effects of sofren injection on ROS generation with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)濃度（mL/L）OD（A488/525）空白對照組模型組（H/R組）大株紅景天注射液低劑量組大株紅景天注射液中劑量組大株紅景天注射液高劑量組66666 -1452.33±069.42** -2291.67±211.58##* 052165.17±538.91** 101794.33±160.90** 201294.00±120.13**

表4　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s）Tab.4The effects of sofren injection on mitochondrial membrane potential with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

表4　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響（±s）Tab.4The effects of sofren injection on mitochondrial membrane potential with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

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2.4大株紅景天注射液對細(xì)胞內(nèi)SOD水平的影響與空白對照組相比，H/R損傷后原代心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活性減少；與模型組相比，大株紅景天注射液中、高劑量組可明顯增加SOD活性，且高劑量組效果更明顯。呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。結(jié)果見表5。

2.5大株紅景天注射液對細(xì)胞內(nèi)SOD基因表達(dá)水平的影響與空白對照組相比，H/R損傷后原代心肌細(xì)胞內(nèi)SOD基因表達(dá)量減少；與模型組相比，大株紅景天注射液組可明顯增加SOD基因表達(dá)，且高劑量組效果更明顯。呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。結(jié)果見表6。

3　討論

近年來隨著對心臟疾病的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷是導(dǎo)致心臟急性或慢性損傷的重要病理生理過程［9-10］。心肌缺血缺氧時(shí)，首先會(huì)引起能量代謝紊亂，三磷酸腺苷（ATP）生成減少，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能異常、線粒體膜電位降低、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)生成大量氧自由基，而起到清除作用的SOD，導(dǎo)致氧自由基的大量堆積，再灌注或復(fù)氧時(shí)損傷進(jìn)一步加重，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［11-12］。氧自由基是人體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物，但當(dāng)其生成速度超過機(jī)體清除能力時(shí)，便會(huì)對細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等幾乎所有的生物分子造成破壞［13］。

表5　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響（±s）Tab.5The effects of sofren injection on SOD vitality with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

表5　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響（±s）Tab.5The effects of sofren injection on SOD vitality with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

組別空白對照組模型組（H/R組）大株紅景天注射液低劑量組大株紅景天注射液中劑量組大株紅景天注射液高劑量組動(dòng)物數(shù)66666濃度（mL/L）SOD（kU/L）-15.529±0.787** -09.469±0.682##* 0512.003±0.839** 1012.432±0.262** 2014.764±0.266**

表6　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞內(nèi)SOD基因表達(dá)的影響（±s）Tab.6The effects of sofren injection on SOD gene expression with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

表6　大株紅景天注射液對H/R損傷的原代心肌細(xì)胞內(nèi)SOD基因表達(dá)的影響（±s）Tab.6The effects of sofren injection on SOD gene expression with hypoxia-reoxygenation injury（±s）

注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)濃度（mL/L）空白對照組模型組（H/R組）大株紅景天注射液低劑量組大株紅景天注射液中劑量組大株紅景天注射液高劑量組66666 SOD mRNA expression level -1.005±0.117** -0.666±0.014#* 050.861±0.074** 100.867±0.039** 201.017±0.126**

體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞造成缺氧/復(fù)氧模型是目前最為常用的模擬心肌缺血再灌注的細(xì)胞模型之一［14］，細(xì)胞模型可以排除動(dòng)物模型中神經(jīng)、體液等因素的影響，直觀可靠的觀察藥物對細(xì)胞的作用，具有特異性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)［15］。因此本實(shí)驗(yàn)選擇乳鼠原代心肌細(xì)胞作為研究對象，缺氧9 h、復(fù)氧2 h作為模型，以便能更好的觀察藥物對心肌缺氧損傷的保護(hù)作用。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，原代心肌細(xì)胞受到H/R損傷時(shí)，與正常組相比細(xì)胞活力明顯下降，使用CMH2DCF-DA熒光探針直接檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，可以看到細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量明顯增加，說明細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷后細(xì)胞內(nèi)有大量氧自由基的堆積。給予大株紅景天注射液預(yù)處理組ROS生成量明顯減少，同時(shí)細(xì)胞活力明顯提高，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。提示大株紅景天注射液可能減少氧自由基的生成直接清除氧自由基，從而保護(hù)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除自由基，維持細(xì)胞的正常功能，SOD活力的高低可以反應(yīng)機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力。大株紅景天注射液預(yù)處理組與H/R損傷組相比SOD活力明顯升高且SOD基因表達(dá)量增加，提示大株紅景天注射液還可能通過增加SOD的活性和表達(dá)，間接清除氧自由基。研究證明可以抑制細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶類的藥物均能增加細(xì)胞凋亡［16-17］。大株紅景天注射液可通過清除氧自由基而增加細(xì)胞的抗氧化能力，阻斷氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其抗氧化的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞受到H/R損傷后，線粒體膜電位明顯下降，而大株紅景天注射液預(yù)處理組可以明顯抑制膜電位的下降，說明大株紅景天注射液可以抑制由于氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的線粒體的損傷，維持線粒體的正常功能，這可能也是大株紅景天注射液保護(hù)心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制之一。

綜上所述，大株紅景天注射液對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用，但是此作用發(fā)揮的具體通路還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（本文編輯：馬英，滕曉東）

Protective effects and mechanisms of sofren injection on primary cardiomyocytes hypoxia-reoxygenation injury

WANG Ya-dong，Patrick Asare Fordjour，LI Lan，WEI Jing，F(xiàn)AN Guan-wei
（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the effect of sofren injection on primary cardiomyocytes damaged by hypoxia-reoxygenation and to research signal pathways involved in the mechanism of sofren injection.［Methods］The cell viability was measured by MTT.Primarily cultured cardiomyocytes were pretreated with different concentrations of sofren injection，cultured in hypoxia for 9 h and reoxygenation for 2 h.The cell viability was measured by MTT.The ROS generation and mitochondrial membrane potential in the cell were measured by CMH2DCF-DAandJC-1fluorescentprobe，thevitalityandgeneexpressionofsuperoxidedismutase（SOD）.［Results］Comparedwithhypoxiareoxygenation group，pretreated with different concentrations of sofren injection significantly attenuated model-induced cell viability and mitochondrial membrane potential loss，dramatically decreased the ROS generation.The SOD vitality and gene expression were increased by sofren injection.［Conclusion］Sofren injection can protect rat cardiomyocytes from the injury induced by hypoxia-reoxygenation.

sofren injection；hypoxia-reoxygenation；primary cardiomyocyte；oxidative stress

R543

A

1672-1519（2016）03-0160-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.03.09

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012CB5 18404）；國家自然基金資助項(xiàng)目（81273993）。

王亞東（1991-），女，碩士研究生，主要從事心血管藥理學(xué)方向研究。

樊官偉，E-mail：fgw1005@hotmail.com。

（2015-08-13）