復方龍芩草微乳提取液體外抗H1N1流感病毒的作用研究*

劉曉艷，劉　帥，李　妍，顧立剛，劉曉婷，杜　紅（.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京000；.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥防治病毒性疾病教育部重點實驗室，北京0009）

·中藥研究·

復方龍芩草微乳提取液體外抗H1N1流感病毒的作用研究*

劉曉艷1，劉帥1，李妍1，顧立剛2，劉曉婷2，杜紅1
（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京100102；2.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥防治病毒性疾病教育部重點實驗室，北京100029）

［目的］考察生物相容性微乳及復方龍芩草微乳提取液體外抗H1N1流感病毒的效果。［方法］運用四甲基偶氮唑藍比色法（MTT）檢測微乳和復方龍芩草微乳提取液對A549細胞的最大無毒濃度（TC0）及半數抑制濃度（TC50），采用細胞病變效應（CPE）法表示藥物對病毒感染細胞的作用，MTT法檢測細胞病變抑制率（ER）。采用Probit回歸法計算受試藥物在體外抗H1N1流感病毒的半數抑制濃度（IC50）和治療指數（TI）。［結果］微乳在一定程度上抑制H1N1流感病毒對細胞的感染作用，IC50為769.178 mg/L（以含微乳量計），TI為9.078；復方龍芩草微乳提取液具有顯著的抗H1N1流感病毒的效果，當濃度為1 250 mg/L（以含微乳量計）時，抗病毒效率達到91.37%，IC50為314.808 mg/L，TI為20.889。［結論］復方龍芩草微乳提取液體外抗H1N1流感病毒的效果顯著，微乳具有一定的抗流感病毒的效果，在復方龍芩草微乳提取液中或許起到輔助作用。

微乳；復方龍芩草；微乳提取液；H1N1；流感病毒

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞和病毒人肺腺癌細胞（A549）由中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院提供。甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株，由中國中醫(yī)科學院中醫(yī)所提供，-75℃冷藏。使用時接種于9 d齡雞胚尿囊腔，35℃培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳代2次收集尿囊液，測定的血凝滴度為2-7。

1.1.2藥品與試劑地龍、黃芩均購自安國市神禾中藥材飲片有限公司，經北京中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室王晶娟副教授鑒定，地龍為鉅蚓科動物通俗環(huán)毛蚓（Pheretima vulgaris Chen）的干燥體，黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根。甘草購自安國市祎澳中藥飲片有限公司，經鑒定為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的根。

McCoy’s 5A培養(yǎng)基（gibco公司，美國）；胎牛血清（gibco公司，美國）；0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）（北京普博欣生物科技有限公司），四甲基偶氮唑藍（MTT）和二甲亞砜（DMSO）（Sigma公司，美國）；三聯(lián)溶解液：含十二烷基硫酸鈉（SDS）10g，異丁醇5 mL，10 mol/L鹽酸（HCl）0.1 mL。細胞培養(yǎng)液：含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合物的McCoy’s 5A培養(yǎng)基。細胞維持液：含2%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合物的McCoy’s 5A培養(yǎng)基；膽固醇（美國SIGMA公司，批號MKBD9436V）；PC50卵磷脂（上海太偉藥業(yè)，批號20120301）；豬膽鹽（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，批號20120420）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（德國巴斯夫公司，批號512882）；肉豆蔻酸異丙酯（美國SIGMA公司，批號172472）；磷酸奧司他韋膠囊（達菲，瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏公司，批號B1354）。

1.1.3儀器細胞培養(yǎng)箱（BINDER WMK-02型）；熒光倒置顯微鏡；光學顯微鏡；超凈工作臺（北京碧都凈化設備有限公司）；SHB-111型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；RO10型磁力攪拌器（德國IKA公司）；水浴箱（北京醫(yī)療設備廠）。

1.2方法

1.2.1生物相容性微乳的制備精密稱取0.25 g膽固醇，溶于5.4 mL肉豆蔻酸異丙酯中，混勻后作為油相；稱取18 g卵磷脂及等量的聚氧乙烯氫化蓖麻油，加入8倍量的95%乙醇溶解，加入油相后，再加入320 mL質量濃度為56.25 g/L的豬膽鹽水溶液，磁力攪拌均勻即得黃色均勻透明的微乳。

1.2.2復方龍芩草微乳提取液的制備將復方龍芩草中地龍、黃芩、甘草分別粉碎，過6目篩，按照比例（1∶2∶1）精密稱取40 g復方龍芩草置入500 mL燒杯中，加入200 mL微乳液，室溫下避光放置24 h，再將浸潤過的藥粉裝入滲漉桶，在水浴溫度保持37℃的條件下以3～5 mL/min的流速滲漉，收集滲漉液，即得龍芩草微乳提取液。

葉曉曉去找?guī)讉€叔叔姑姑借錢。第一輪借錢，給自己的兄長看病，叔叔姑姑們沒有多說，倒是第二輪借學費，他們頗有微詞了：“讀書有什么用？你看你爸爸，讀的書比我們多，硬是一點人情世故都不通，都讀苕了！”

1.2.3藥物對細胞毒性實驗將A549細胞復蘇，傳代3～4次待細胞生長良好后用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化細胞，用細胞培養(yǎng)液調整細胞濃度為1.5×108個/L，充分混勻后接種于96孔板中，100 μL/孔，放在35℃、5%的二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中孵育數小時使細胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶底層。用細胞維持液將微乳（以微乳含量計，初始濃度為1kg/L）、復方龍芩草微乳提取液（以微乳含量計，初始濃度為1 kg/L）和達菲分別連續(xù)10倍遞次稀釋，將各個濃度加入96孔板中，100μL/孔，每個濃度平行6個復孔，同時設正常細胞對照組。在35℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察細胞形態(tài)，從細胞形態(tài)較好，死亡較少的前一個濃度開始對倍稀釋，將各個濃度加入96孔板中，100 μL/孔，每個濃度平行6個復孔，同時設正常細胞對照組。相同條件下培養(yǎng)48 h觀察細胞形態(tài)，加入MTT（終濃度為0.5 g/L），培養(yǎng)4h后加入SDS，100μL/孔。再培養(yǎng)12h于570nm波長處測定細胞吸光度A，根據公式：細胞存活率%=實驗組吸光度值（A）/細胞對照組吸光度值（A）×100%計算細胞存活率。采用SPSS 20.0軟件中Probit回歸計算藥物半數中毒濃度（TC50）。

1.2.4H1N1流感病毒半數細胞培養(yǎng)物感染量（TCID50）的測定用無血清McCoy’s 5A培養(yǎng)基對流感病毒H1N1進行連續(xù)10倍遞次稀釋，將各個濃度的病毒液接種到長滿單層細胞的96孔板中，每個濃度6個復孔，100 μL/孔，同時設正常細胞對照。37℃吸附2 h后以維持液代替病毒液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，記錄病變程度和孔數，以細胞對照無明顯病變，病毒感染細胞病變率達50%及以上的細胞孔為病變孔，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.2.5藥物對病毒致細胞病變作用的影響取已長成單層細胞的96孔培養(yǎng)板，吸出培養(yǎng)液，每孔加磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，接種100TCID50的病毒液，100μL/孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中作用2 h后吸出病毒液，依次加入最大無毒濃度以下10個相應稀釋度的空白微乳和復方龍芩草微乳提取液，設達菲為陽性藥物對照組，正常細胞對照組和病毒對照組，每濃度4個復孔，100 μL/孔。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞病變情況，該實驗驗證2次。細胞病變表示為：0%～25%（+），25%～50%（++），50%～75%（+++），75%～100%（++++），當病毒對照組細胞病變?yōu)?+++時記錄實驗結果。

1.2.6藥物抗病毒有效率檢測取已長成單層細胞的培養(yǎng)板，吸除培養(yǎng)液，加入100 TCID50的病毒液，100 μL/孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h后，吸除病毒液，加入最大無毒濃度以下對倍稀釋的空白微乳和復方龍芩草微乳提取液，設達菲為陽性藥物對照組，正常細胞對照組和病毒對照組，每濃度4個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入MTT（終濃度為0.5 mg/mL），用酶標儀在570 nm波長下測定吸光度A值（A570）。計算藥物抗病毒效率（ER），ER%=（藥物組平均A值-病毒對照組平均A值）/（細胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值）×100%。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件的Probit回歸法計算空白微乳、復方龍芩草微乳提取液對細胞的半數抑制濃度（IC50），并按照藥物的治療指數（TI）公式：TI=TC50/IC50計算藥物的治療指數，以上實驗均重復3次以上，以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1藥物對細胞毒性作用空白微乳作用于A549細胞后，使細胞變圓，大部分從培養(yǎng)瓶底層脫落下來，折光性增加，在稀釋100倍的濃度下細胞的形態(tài)有較大變化，形態(tài)改變、折光率增加的數量減少，與正常細胞組對比有一定的差異。當稀釋1 000倍時，與正常細胞相比，形態(tài)幾乎沒有變化，細胞均貼壁，僅有很少部分因培養(yǎng)瓶底層長滿細胞無貼壁空間而處于懸浮狀態(tài)；復方龍芩草微乳提取液在稀釋1 000倍的藥物濃度作用下，細胞的形態(tài)、貼壁狀態(tài)等與陰性對照組無顯著差異，受試藥物100倍稀釋濃度的對倍遞次稀釋濃度對細胞的毒性作用結果見表1。

表1　微乳及龍芩草復方微乳提取液對細胞毒性作用（對倍稀釋）Tab.1The toxicity of microemulsion and microemulsion extract of compound Longqincao on A549 cells（fold dilution）

空白微乳和復方龍芩草微乳提取液的TC0均為稀釋800倍后的濃度，相當于1 250 mg/L（以含微乳量計）；空白微乳的TC50為6 982.869 mg/L（以含微乳量計），微乳提取液的TC50為6 575.969 mg/L（以含微乳量計），相當于含生藥1 315.194 mg/L，說明微乳提取了復方龍芩草后，提取液對細胞的毒性并未顯著增加。

2.2病毒感染性測定通過觀察加入病毒后A549細胞的病變狀態(tài)，以Reed-Muench法計算H1N1流感病毒的TCID50為10-3.778/0.1 mL。

2.3藥物對病毒致細胞病變作用的影響當空白微乳的濃度在1 250 mg/L時，細胞的存活率高于病毒感染組。細胞的形態(tài)沒有發(fā)生明顯的變化，藥物的細胞病變抑制率（ER）為67.57%，對部分細胞起到抑制病變的作用。當濃度逐次減小，細胞形態(tài)發(fā)生改變，由梭形轉變?yōu)楠M長或其他無規(guī)則形狀，細胞的破碎、折光率增加、變圓的病變程度越來越明顯，存在一定的濃度依賴關系。

復方龍芩草微乳提取液的濃度在625～1250mg/L時，細胞的存活率明顯高于病毒感染組。藥物的ER＞60%，藥物的濃度依次減少，細胞變圓，破碎，不貼壁等現象逐漸增強，當濃度為312.5 mg/L時，細胞的形態(tài)呈現不規(guī)則狹長或分支狀，其原因有待進一步探討。當濃度為1 250 mg/L時，細胞病變效應（CPE）最小，ER達到91.37%，細胞僅有輕微的變圓、不貼壁等現象，對病毒致細胞病變的保護作用最強，優(yōu)于陽性對照藥物達菲。結果如表2。

表2　微乳及復方龍芩草微乳提取液對H1N1病毒CPE的影響及ER±s，n=4）Tab.2Influences of blank microemulsion and microemulsion extract of cmpound Longqincao on CPE of H1N1 and their antiviral ER±s，n=4）

注：空白微乳與病毒對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；微乳提取液與病毒對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；微乳提取液與空白微乳比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別微乳提取液11 250.000+++67.573±2.628△△91.373±1.055##** 2625.000+++++46.240±3.267△△67.019±1.604##** 3312.500++++++36.970±2.645△△44.366±3.991##* 4156.250++++++27.588±0.973△38.028±6.478#* 578.125++++++++20.439±3.71922.887±4.693##** 639.063++++++++13.179±1.10822.183±1.484達菲0.750++89.970±0.32689.329±4.846濃度（以含微乳量計）（mg/L）CPEER（%）空白微乳微乳提取液空白微乳

由表2可知，在156.25～1 250 mg/L的濃度范圍內，空白微乳和復方龍芩草微乳提取液與病毒對照組相比，具有顯著的統(tǒng)計學差異，說明空白微乳和復方龍芩草微乳提取液均有抗H1N1流感病毒的效果。復方龍芩草微乳提取液和空白微乳相比，在低濃度時，二者對病毒致細胞病變抑制率的差異并不明顯，但隨著濃度的增加，抗病毒效率差異逐漸明顯，在濃度為625 mg/L和1 250 mg/L時，復方龍芩草微乳提取液具有很好的抗病毒效果，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），可見復方龍芩草中主要有效成分經微乳提取后發(fā)揮出了應有的抗H1N1流感病毒的效果，空白微乳則起到了不容忽視的輔助作用。

2.4藥物的抗病毒有效率根據MTT的測定結果，運用SPSS 20.0軟件的Probit回歸法計算微乳、復方龍芩草微乳提取液對細胞的半數抑制濃度（IC50）和治療指數（TI）。結算結果見表3。

表3　微乳、復方龍芩草微乳提取液的IC50及TITab.3IC50and TI of blank microemulsion and microemulsion extract of cmpound Longqincao

3　討論

甲型流感病毒易受地理因素、環(huán)境差異等影響，使亞型病毒株突破自身的基因約束和種屬的屏障作用而發(fā)生突變并造成異種傳播，使得甲型流行性感冒的嚴重程度不同，癥狀也因人而異，一些藥物對甲型流感病毒的干預作用也變得相對困難，因此從中醫(yī)藥的角度出發(fā)，尋找能夠發(fā)揮抗流感病毒效果的藥物前體或潛在藥物是解決上述問題的途徑之一。

本實驗所制的生物相容性微乳以細胞膜的重要組成部分，膽酸、激素的合成原料膽固醇，生命體的基礎物質卵磷脂、膽鹽等作為表面活性劑及助表面活性劑，無論是空白微乳還是復方龍芩草微乳提取液，在稀釋800倍（濃度1 250 mg/L，在稀釋液中的含量為0.125%）的情況下對細胞幾乎沒有毒性，而Tween-80在燈盞花素注射液中的含量為0.8%，配成等同于注射液中的濃度稀釋512倍（含量為0.0016%）時對L929細胞仍有較大的毒性，稀釋1 024倍（含量為0.000 8%）時對細胞基本無毒性［13］，PEG-400在40 mL/L時對Caco-2細胞基本沒有抑制作用，在80 mL/L時仍表現一定的毒性［14］，可見由內源性物質膽固醇、卵磷脂等組成的生物相容性微乳對細胞的毒性明顯小于Tween-80和PEG-400，在新型藥物載體的輔料篩選和制備方面能夠發(fā)揮較好的安全性，可以解決其他含有吐溫類表面活性劑微乳的潛在安全隱患問題。相同濃度的空白微乳和復方龍芩草微乳提取液對細胞病變的作用并無太大差異，可見所提取的復方龍芩草藥效物質組對細胞的存活率（安全性）可能沒有顯著的影響。

復方龍芩草微乳提取液具有較為顯著的抗H1N1流感病毒的效果，在最大無毒濃度下對流感病毒致細胞病變的抑制率達到91.37%，TI為20.889，效果與達菲相似。生物相容性微乳在一定程度上也能夠發(fā)揮抑制病毒致細胞的病變作用，抑制率為67.57%，TI為9.078，據文獻報道，膽固醇作為細胞膜的組成部分，可以通過改變病毒粒子與細胞膜的相互作用、維持細胞生物膜的流動性抑制病毒進入細胞［15］，而去除細胞膜膽固醇后使病毒從感染細胞中釋放增加，但病毒粒子的感染性降低［16］。卵磷脂可以通過降低石英對細胞的毒性作用達到保護肺泡巨噬細胞的目的［17］，膽鹽對不同細胞具有增殖作用［18-19］。生物相容性微乳能夠發(fā)揮一定的抗流感病毒的活性，可能和這些物質的特性相關。與空白微乳相比，龍芩草微乳提取液表現出顯著的抗H1N1流感病毒的優(yōu)勢，隨著劑量的提高，差異愈加顯著，當濃度為625～1 250 mg/L時，差異最明顯。由此可見，復方龍芩草微乳提取液的抗病毒效果應該是微乳與龍芩草復方協(xié)同作用的結果，微乳在提取液中起到一定的輔助作用，但是否增加了龍芩草復方藥效物質的富集及療效發(fā)揮，還有待進一步研究闡明。

綜上所述，本實驗室自制的生物相容性微乳在一定程度上可以發(fā)揮抗H1N1流感病毒的效果，復方龍芩草微乳提取液體外抗H1N1流感病毒的效果顯著，在病毒侵入細胞的過程中，發(fā)揮抗病毒的具體環(huán)節(jié)和機制有待進一步的研究。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Study on the anti-influenza virus H1N1 activity of microemulsion extract of cmpound Longqincao in vitro

LIU Xiao-yan1，LIU Shuai1，LI Yan1，GU Li-gang2，LIU Xiao-ting2，DU Hong1（
1．School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2.Educational Ministry Key Laboratory of Preventing and Treating Viral Diseases with Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

［Objective］To study the antiviral effects of biocompatible microemulsion and microemulsion extract of cmpound Longqincao on H1N1 influenza virus in vitro.［Methods］The maximum non-toxic concentration（TC0）and median toxic concentration（TC50）of biocompatible microemulsion and microemulsion extract of cmpound Longqincao on A549 cells were detected by using methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）.The influences of these drugs on virus-infected cells were observed by cytopathic effect（CPE），the cytopathic inhibition rate（ER）was detected by using MTT.The median inhibitory concentration（IC50）and therapeutic index（TI）of these two drugs on viral infection were calculated by the Probit regression.［Results］Microemulsion had inhibitory effect on the pathogenic effect of influenza virus，IC50was 769.178 mg/L（Calculated with microemulsion）and TI was 9.078.When the concentration of microemulsion extract of cmpound Longqincao was 1 250 mg/L，The antiviral rate was 91.37%.IC50was 314.808 mg/L（Calculated with microemulsion）and TI was 20.889.It had a significant effect on protecting A549 cells from intrusion.［Conclusion］The microemulsion extract of cmpound Longqincao played a good role in anti-H1N1 influenza virus，the microemulsion also had antiviral effect，and maybe played a supporting role to a certain extent.

microemulsion；compound Longqincao；microemulsion extract；H1N1；influenza virus

R283.6

A

1672-1519（2016）03-0172-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.03.12

國家自然科學基金項目（81102815）；教育部博士點新教師基金項目（20110013120017）。

劉曉艷（1989-），女，碩士研究生，主要研究方向為中藥炮制。

杜紅，E-mail：duhong@vip.163.com。

（2015-11-03）