氫化胡椒堿對光甘草定軟膏透皮滲透性的影響*

王　艷，葉柳青，劉園園，韓宛盈，王麗峰，宋春敬，張艷軍（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津300193）

氫化胡椒堿對光甘草定軟膏透皮滲透性的影響*

王艷，葉柳青，劉園園，韓宛盈，王麗峰，宋春敬，張艷軍
（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津300193）

［目的］研究氫化胡椒堿對光甘草定軟膏體外透皮作用的影響。［方法］通過改良Franz垂直擴(kuò)散池考察光甘草定的透皮吸收性能，以高效液相色譜法測定光甘草定含量，以考察氫化胡椒堿、氮酮、冰片對光甘草定透皮吸收的影響。［結(jié)果］不同促滲劑對光甘草定累積透過量順序?yàn)?.04%氫化胡椒堿組＞0.03%氫化胡椒堿組＞0.02%氫化胡椒堿組＞5%氮酮組＞3%氮酮組＞2%冰片組＞單體組，0.04%氫化胡椒堿組的24 h的累積滲透量最大，為26.51 μg/cm2，其促滲速率的增滲倍數(shù)最大，較單體組提高了5.03倍。［結(jié)論］不同的促滲劑對光甘草定均有促滲作用，并且0.04%氫化胡椒堿為透皮促滲劑對光甘草定體外透皮吸收效果最佳，可促進(jìn)光甘草定快速有效的滲透。

光甘草定；促滲劑；透皮吸收；氫化胡椒堿

光甘草定（Glabridin）是一種中等極性的異黃酮類化合物，目前僅在光果甘草（Glycyrrhiza glabral）中被發(fā)現(xiàn)，其具有廣泛的生物活性，特別是對酪氨酸酶具有非常強(qiáng)的抑制作用，是目前已知的作用最強(qiáng)的天然化合物之一［1-2］，同時，光甘草定還具有清除自由基的作用［1，3］。含量40%的光甘草定提取物被國際化妝品界譽(yù)為“美白黃金”，作為強(qiáng)效美白、祛斑的天然活性成分，已被廣泛添加到高端護(hù)膚化妝產(chǎn)品中。因光甘草定對酪氨酸酶表現(xiàn)出的超強(qiáng)抑制作用，其被列為治療色素沉著性皮膚疾病的候選藥物［4］。

氫化胡椒堿（Tetrahydropiperine），又名四氫胡椒堿，簡稱THP，為類白色晶狀粉末。除具有抗驚厥、抗癲癇、鎮(zhèn)痛、抗蠅蟲作用外，還具有協(xié)助促進(jìn)所需有效成分在皮膚和組織中的滲透吸收的作用［5］。其和傳統(tǒng)促滲劑氮酮（Azone）相比，全天然、量少高效和無刺激的優(yōu)點(diǎn)尤為突出，因而在藥品及化妝品行業(yè)得到廣泛應(yīng)用［6］。極少的添加量（0.01%～0.1%）即能發(fā)揮高效促進(jìn)皮膚對有效成分的吸收和利用的功效。目前推測氫化胡椒堿的促滲機(jī)制為：1）改善脂質(zhì)雙層的流動性，促進(jìn)有效成分分子在脂質(zhì)雙層的擴(kuò)散。2）增強(qiáng)細(xì)胞膜對有效成分的親和能力，從而達(dá)到促滲的效果［7］。

筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)光甘草定的經(jīng)皮吸收效果并不理想，需要通過添加促滲劑或高分子材料對光甘草定進(jìn)行包含來提高其經(jīng)皮滲透的效果［6-7］。氫化胡椒堿作為一個優(yōu)良的促滲劑已在化妝品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，有關(guān)氫化胡椒堿對光甘草定的經(jīng)皮吸收的作用的影響，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究以現(xiàn)代經(jīng)皮吸收給藥為理論依據(jù)，以光甘草定為透皮吸收模型，考察氫化胡椒堿對光甘草定體外經(jīng)皮吸收的影響，以及氫化胡椒堿的促滲作用與常見的幾種促滲劑，如氮酮、冰片的促滲作用的比較。

1　儀器與材料

KQ-300 B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A 1004型萬分之一分析天平（上海精科天平），HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（河南石予華儀器有限公司），TB-P6型改良Franz透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海諧凱科技貿(mào)易有限公司），島津LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

光甘草定提取物（純度為91%，陜西帕尼爾生物科技有限公司），光甘草定對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%以上，天津一方科技有限公司，批號：AZ71G001），乙腈、甲醇、乙醇、冰乙酸、三乙醇胺（天津市康科德科技有限公司），甘油、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、冰片、水溶氮酮、氫化胡椒堿（陜西慈源生物技術(shù)有限公司），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈公司），生理鹽水實(shí)驗(yàn)室自制。

昆明種實(shí)驗(yàn)小鼠，體質(zhì)量（20±3）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（動物合格證號：SIXK京2009-0004）。

2　方法與結(jié)果

2.1光甘草定的測定

2.1.1色譜條件HypersilODS色譜柱（5μm，4.6mm× 200 mm），乙腈-水-冰乙酸（55∶44∶1）為流動相，檢測波長為280 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2對照品溶液制備稱取光甘草定對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)比為55%的乙腈-水溶液溶解并稀釋定容至刻度，制備得到濃度為48.4 mg/L的光甘草定對照品儲備液。

2.1.3專屬性實(shí)驗(yàn)按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備光甘草定的陰性軟膏，并按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備光甘草定陰性軟膏的透皮接收液（A）；光甘草定對照品溶液（B）；按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備光甘草定軟膏，并按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備光甘草定軟膏的透皮接收液（C）。上述3種溶液分別用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法注入高效液相（HPLC）色譜儀測定，HPLC圖譜見圖1。由結(jié)果可知，軟膏中的輔料和空白透皮液等對光甘草定的測定沒有干擾。

圖1　空白軟膏透皮吸收液（A）、光甘草定對照品溶液（B）、光甘草定軟膏透皮接受液（C）的HPLC圖Fig.1HPLC chromatograms of blank ointment sample solution（A），Glabridin reference substances solution（B），transdermal solution after application of Glabridin（C）

2.1.4線性關(guān)系考察等比例量遞減量取光甘草定對照品儲備液置棕色量瓶內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)比為55%的乙腈-水溶液稀釋定容至刻度，分別制備得到濃度為9.68、4.84、2.42、1.21和0.605 mg/L的對照品溶液。分別取上述對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測定，HPLC譜圖見圖1。以光甘草定對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程=25 982X+22 176，r= 0.999 4，光甘草定在0.605～9.68 mg/L峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度實(shí)驗(yàn)取同一對照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法注入高效液相色譜儀測定，連續(xù)6次，記錄峰面積積分值，并連續(xù)6 d分別測定，記錄峰面積積分值，RSD分別為0.20%和1.84%，結(jié)果表明日內(nèi)和日間精密度良好。

2.1.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一時間點(diǎn)的6個不同接收池中的接收液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法注入HPLC色譜儀測定，記錄峰面積積分值，RSD為1.57%，表明重復(fù)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取光甘草定對照品溶液，分別于0、2、4、6、8、10和24 h按“2.1.1”項(xiàng)下方法注入HPLC色譜儀測定，記錄峰面積積分值，RSD為0.73%，表明光甘草定在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8回收率實(shí)驗(yàn)分別在已知質(zhì)量濃度的高、中、低3種接收液中加入高、中、低3種質(zhì)量濃度的光甘草定對照品溶液，每種質(zhì)量濃度的樣品平行取3份，測定質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率，結(jié)果光甘草定低、中、高質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為103.81%、103.67%、101.21%，RSD分別為0.54%、0.19%、0.43%，表明回收率良好。

2.2體外透皮實(shí)驗(yàn)

2.2.1離體鼠皮的制備取小鼠，電動剃須刀刮去鼠毛，8%的硫化鈉水溶液脫去殘留的毛，處死，取下腹部皮膚，除去脂肪和皮下組織，置生理鹽水中于4℃冰箱中備用［6-7］。

2.2.2光甘草定軟膏的制備精密稱取7份光甘草定（5 mg），分別加入三乙醇胺（0.5 g）和甘油（1.5 g）作為水相，硬脂酸（1.8 g）和單硬脂酸甘油酯（0.1 g）作為油相，其中1份加入處方比例2%的冰片，兩份分別加入處方比例3%和5%的氮酮，其余3份分別加入0.02%、0.03%和0.04%的氫化胡椒堿，制備含有不同促滲劑的光甘草定軟膏，見表1。不加樣品及促滲劑的為空白軟膏［8］。

2.2.3實(shí)驗(yàn)方法將處理好的鼠皮角質(zhì)層向上固定于Franz擴(kuò)散池上，在接收池各加入7.5 mL 30%乙醇-生理鹽水，放置于恒溫水浴的智能透皮試驗(yàn)儀中，37℃，200 r/min。平衡1 h，排盡接收池內(nèi)的氣泡后給藥。擴(kuò)散池供給面積上均勻涂上0.5 g光甘草定軟膏，每組平行3次，分別在1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h和24.0 h時間點(diǎn)取接收液1 mL，同時補(bǔ)充同等體積的接收液，將吸取的接收液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，按“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析［6-7］。

2.2.4供試樣品的制備及測定取“2.2.3”項(xiàng)下的樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積積分值，計(jì)算光甘草定的質(zhì)量，代入公式（1）計(jì)算累積透過量（Qn，μg/cm2）。

Cn：第n個時間點(diǎn)吸取液的濃度（mg/L）；Ci：第n-i個時間點(diǎn)吸取液的濃度（mg/L）；V：接收液的總體積即7.5 mL；Vi：每次吸取的液體體積即1 mL；A：接收池的體積即3.141 6 cm2。

2.2.5數(shù)據(jù)計(jì)算及結(jié)果

2.2.5.1經(jīng)皮吸收曲線以Qn（μg/cm2）值為縱坐標(biāo)，時間t（h）值為橫坐標(biāo)，繪制光甘草定經(jīng)皮滲透曲線。選取包括零級動力學(xué)、一級動力學(xué)和Higuchi方程等在內(nèi)的動力學(xué)模型，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，對擬合度R2進(jìn)行比較，確定最佳的釋放藥動學(xué)模型，計(jì)算透皮速率［J，μg/（cm2·h）］。

對數(shù)學(xué)模型擬合結(jié)果R2進(jìn)行分析可知，光甘草定體外透皮釋放符合零級動力學(xué)模型。將Qn對t進(jìn)行零級動力學(xué)方程擬合，各實(shí)驗(yàn)組的體外透皮方程和相關(guān)參數(shù)見表2。

2.2.5.2穩(wěn)態(tài)滲透速率［6-7］以累積滲透量Qn對時間t（h）作圖，藥物滲透達(dá)穩(wěn)態(tài)后，直線部分斜率為透皮速率，即穩(wěn)態(tài)滲透速率（Jss）；藥物滲透系數(shù)（Kp）通過公式（2）計(jì)算。增滲倍數(shù)（ER），通過公式（3）計(jì)算。

表1　光甘草定軟膏處方表Tab.1The prescription of Glabridin ointments g

表2　不同促滲劑對光甘草定軟膏透皮特性的影響Tab.2Regression equations and related parameters on different penetration enhancers

C：接收池中藥物濃度；Kp：加入促滲劑后光甘草定的滲透系數(shù)；Kp0：光甘草定固有的滲透系數(shù)。

2.2.6促滲劑對光甘草定透皮特性的影響將“2.2.2”項(xiàng)下制備的光甘草定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，再按“2.2.4”項(xiàng)下方法分別測定不同樣品中光甘草定的含量，計(jì)算24h的光甘草定累積透過量Qn。

透皮吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：含促滲劑的光甘草定軟膏24 h Qn值均大于單體組，且差異有顯著性（P＜0.01）。對影響顯著的因素再進(jìn)行兩兩比較后，得到結(jié)果：各含促滲劑的光甘草定軟膏的促滲作用由強(qiáng)到弱為：0.04%氫化胡椒堿＞0.03%氫化胡椒堿＞0.02%氫化胡椒堿組、5%氮酮組＞3%氮酮組＞2%冰片組。其中0.04%氫化胡椒堿的24 h的累積滲透量最大，為26.51 μg/cm2。不同促滲劑軟膏的光甘草定體外經(jīng)皮吸收曲線，見圖2。

圖2　不同促滲劑的時間-累積透過量曲線Fig.2Profile of accumulative permeation amount of drugtime on different formulations

3　討論

光甘草定幾乎不溶于水或生理鹽水中。因此在進(jìn)行體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)研究時，需要在生理鹽水中加入適量的有機(jī)溶劑，如丙二醇、乙醇或聚乙二醇等［8］。已有的研究發(fā)現(xiàn)［8-9］，光甘草定在30%乙醇-生理鹽水中溶解度最佳，所以本實(shí)驗(yàn)采用30%乙醇-生理鹽水作為光甘草定體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)的接收液。

滲透劑可以較為顯著的影響藥物的透皮滲透效果，其可改變皮膚角質(zhì)層扁平細(xì)胞的有序疊集結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞從有序排列變成無序排列，角質(zhì)層細(xì)胞間隙的空隙得以增大，最終可使藥物迅速進(jìn)入皮內(nèi)而被吸收［10-11］。本實(shí)驗(yàn)中選取的氫化胡椒堿、氮酮和冰片是化妝品行業(yè)中常用促滲劑，冰片可通過改變角質(zhì)層中脂質(zhì)分子的排列和增加其流動性以達(dá)到促滲的效果［12］；氫化胡椒堿可通過增加脂質(zhì)雙層的流動性，促進(jìn)藥物分子和活性物分子擴(kuò)散通過脂質(zhì)雙層的碳?xì)浠衔锊课?；增加藥物分子和營養(yǎng)物質(zhì)與細(xì)胞膜的親和能力以達(dá)到促滲的效果；氮酮可通過改變脂質(zhì)雙分子層的致密性和增加脂質(zhì)的流動性以達(dá)到促滲的效果，且對細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)無作用，毒性及刺激性?。?3］。三者有相似的促滲透作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些促滲劑對光甘草定的體外經(jīng)皮吸收均具有明顯的促進(jìn)作用，其中氫化胡椒堿促滲效果最明顯。氫化胡椒堿是全天然，無刺激，用量少且促滲作用高效迅速的一種天然促滲劑，在化妝品行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，0.01～0.1%的添加量即能改善和促進(jìn)皮膚對有效成分的吸收和利用。但關(guān)于氫化胡椒堿的促滲作用的研究卻少見報(bào)道。文章對氫化胡椒堿對光甘草定的促滲作用做了初步研究，發(fā)現(xiàn)氫化胡椒堿在添加量僅為0.04%的條件下，24 h內(nèi)累計(jì)透過率可到達(dá)33.32%。比相同條件下，添加量分別為5%氮酮組和2%冰片的促滲效果更顯著。同時，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對光甘草定的促滲效果為0.04%氫化胡椒堿＞0.03%氫化胡椒堿＞0.02%氫化胡椒堿，隨氫化胡椒堿含量的增大，促滲效果也隨之增強(qiáng)。課題組將會在此研究基礎(chǔ)之上，對氫化胡椒堿的最佳添加量及氫化胡椒堿的作用機(jī)制作進(jìn)一步深入探究。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Influence of Tetrahydropiperine on transdermal permeation of Glabridin in ointment

WANG Yan，YE Liu-qing，LIU Yuan-yuan，HAN Wan-ying，WANG Li-feng，SONg Chun-jing，ZHANG Yan-jun
（School of Chinese Materia Medica，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the effect of Tetrahydropiperine on transdermal of Glabridin in ointment.［Methods］Franz vertical diffusion cell was adopted to investigate transdermal performance of glabridin and observe the effect of Tetrahydropiperine（THP），azone，borneol on transdermal permeation of Glabridin.［Results］Effect of enhancers on Glabridin was ranked as follows:0.04%THP＞0.03% THP＞0.02%THP＞5%azone＞3%azone＞2%borneol.When the content of THP was 0.04%，the cumulative permeation of Glabridin was the highest，up to 26.51 μg/cm2.The penetration rate amount with 0.04%THP was 5.03 times than which no permeation enhancer.［Conclusion］These different permeation enhancer have the effect of Glabridin，Glabridin can be permeated quickly and efficiently.

Glabridin；penetration enhancers；transdermal；Tetrahydropiperine

R285.5

A

1672-1519（2016）03-0177-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.03.13

西青區(qū)科技型中小企業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XQKH2013-011）；天津中醫(yī)藥大學(xué)第四屆大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CXJJ2013ALL）。

王艷（1977-），女，碩士，天津中醫(yī)藥大學(xué)，講師，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)和中藥化妝品開發(fā)。

張艷軍，E-mail：zyjsunye@163.com。

（2015-09-16）