對(duì)稱性肢端角化病皮損中PrxI和CLASP1的表達(dá)

于作忠　程云龍　盛　萍　黎世杰　樊翌明

對(duì)稱性肢端角化病皮損中PrxI和CLASP1的表達(dá)

于作忠#程云龍#盛萍黎世杰樊翌明

目的：檢測(cè)對(duì)稱性肢端角化?。⊿AK）皮損中過氧化物還原酶I（Prx I）和胞質(zhì)鏈接相關(guān)蛋白1（CLASP1）的表達(dá)水平。方法：用RT-PCR和免疫組化方法檢測(cè)9例SAK患者腕部皮損及其周圍皮膚和9名正常人腕部皮膚中的Prx I和CLASP1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果：SAK皮損中Prx I和CLASP1 mRNA水平為（0.94±0.66）和（0.95±0.76），明顯高于皮損周圍（0.51±0.20，0.56±0.31）和正常皮膚（0.45±0.26，0.47±0.33）。SAK皮損中Prx I陽性細(xì)胞彌漫分布于表皮基底層和棘層，而CLASP1陽性染色主要位于棘層，二者的陽性染色范圍及程度明顯高于皮損周圍和正常人皮膚。結(jié)論： SAK皮損中Prx I和CLASP1表達(dá)上調(diào)，可能參與表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和異常分化。

對(duì)稱性肢端角化??； 過氧化物還原酶I； 胞質(zhì)鏈接相關(guān)蛋白1

對(duì)稱性肢端角化?。╯ymmetrical acralkeratoderma，SAK）是我國學(xué)者于2008年首次報(bào)道并命名的皮膚病［1，2］。我們于2010年在國際上首次報(bào)道該病［3］，并總結(jié)了國內(nèi)報(bào)道的138例臨床特點(diǎn)［4］。SAK已被國際皮膚科學(xué)界認(rèn)可是一種新的皮膚?。?］，其他國家未見報(bào)道。SAK病因及發(fā)病機(jī)制所知甚少。我們前期蛋白組學(xué)研究顯示SAK皮損中過氧化物還原酶I（peroxiredoxin I，Prx I）、胞質(zhì)鏈接相關(guān)蛋白1（cytoplasmic linker associated protein 1，CLASP1）表達(dá)上調(diào)。本研究擬用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫組化技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證Prx I和CLASP1在SAK皮損、皮損周圍和正常人皮膚中表達(dá)情況。

1　資料與方法

1.1病例資料 我科門診就診的SAK患者9例，男8例，女1例，年齡20～37歲，平均年齡（25.67±5.94）歲。正常對(duì)照9名，男6名，女3名，年齡15～53歲，平均年齡（27.33±10.59）歲。腕部皮損及其周圍皮膚、正常人腕部皮膚進(jìn)行皮膚活檢，一半用10%中性福爾馬林固定，另一半用液氮保存。

1.2主要試劑 Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Life Technologies公司，鼠抗人CLASP1（D-8）、兔抗人Prx I（D5G12）單克隆抗體分別購自Santa Cruz公司、Cell Signaling Technology公司，即用型免疫組化EliVisionTMplus試劑盒（KIT-9902）、加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒（DAB-2031）購自福州邁新生物技術(shù)公司。1.3 RT-PCR 用Trizol試劑提取標(biāo)本中總RNA，M -MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。人Prx I、CLASP1和GAPDH引物序列采用Primer 3軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成。Prx I上游引物5′-CAACTGCCAAGTGATTGGTG-3′，下游引物5′-TCCCCATGTTTGTCAGTG AA-3′；CLASP1上游引物5′-TGGATCTGTGCAAGCAAAAG-3′，下游引物5′-GGCAAGGCACC AAGTAACAT-3′。PCR反應(yīng)體系為Premix Taq 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加滅菌蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件為:98℃預(yù)變性5 min；98℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，用UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，計(jì)算Prx I、CLASP1與GAPDH mRNA灰度值比值。

1.4免疫組化檢測(cè) 石蠟切片采用檸檬酸鹽高溫高壓法修復(fù)抗原，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶；滴加一抗（Prx I、CLASP1工作濃度分別為1∶200、1∶400），4℃孵育過夜后室溫孵育2 h；EliVisionTMplus試劑盒處理后DAB顯色。用磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。用DP71顯微照相系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)不同視野（×400），觀察染色范圍及染色強(qiáng)度。染色范圍指陽性染色細(xì)胞占各層細(xì)胞比例: 0%（-），1%～25%（+），26%～50%（2+），51%～75%（3+），＞75%～100%（4+）。染色強(qiáng)度指陽性染色顏色:陰性（-），淡黃色（+），棕黃色（2+），深棕色（3+），棕黑色（4+）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 RT-PCR結(jié)果用-x±s表示。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用方差分析及LSD檢驗(yàn)（方差齊）或Dunnett T3檢驗(yàn)（方差不齊）。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測(cè)Prx I、CLASP1 mRNA表達(dá) PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示GAPDH、Prx I、CLASP1擴(kuò)增片段為目的基因片段，依次出現(xiàn)在323 bp、306 bp、342 bp處（圖1）。SAK皮損中Prx I、CLASP1 mRNA表達(dá)均高于皮損周圍及正常皮膚（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳顯示SAK皮損中Prx I、CLASP1 mRNA表達(dá)明顯高于皮損周圍和正常皮膚

表1　SAK皮損、皮損周圍及正常皮膚中Prx I、CLASP1 mRNA表達(dá)

2.2免疫組化檢測(cè)Prx I、CLASP1蛋白表達(dá) Prx I陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)褐色顆粒。SAK皮損中，Prx I染色主要位于表皮基底層及棘層；皮損周圍皮膚中，Prx I表達(dá)于棘層中下部及基底層；正常皮膚中，Prx I僅表達(dá)于基底層（圖2，表2）。小汗腺導(dǎo)管、毛囊和皮脂腺陽性染色較弱（圖2）。

CLASP1陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)染色。SAK皮損中CLASP1呈強(qiáng)陽性染色，主要集中于棘層，部分病例也有基底層和顆粒層著色；皮損周圍及正常皮膚中，亦見棘層染色，但染色范圍及染色強(qiáng)度明顯弱于SAK皮損（圖3，表3）。小汗腺導(dǎo)管可見陽性染色，而毛囊、皮脂腺著色較弱（圖3）

表2　SAK皮損、皮損周圍及正常皮膚中Prx I蛋白表達(dá)

圖2　SAK皮損（a）、皮損周圍皮膚（b）、正常皮膚（c）中Prx I免疫組化染色（×200）

圖3　SAK皮損（a）、皮損周圍皮膚（b）、正常皮膚（c）中CLASP1陽性（免疫組化染色，×200）

表3　SAK皮損、皮損周圍及正常皮膚中CLASP1蛋白表達(dá)

3　討論

哺乳動(dòng)物中Prx家族有6個(gè)亞型，定位于胞質(zhì)、胞核、線粒體、過氧化物酶體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其中Prx I含量最豐富［6］。人類Prx I基因定位在1p34.1，編碼199個(gè)氨基酸的蛋白（分子量約為23 kD）；Prx I主要分布于胞質(zhì)及線粒體、過氧化物酶體等細(xì)胞器，胞核亦有少量分布［7］。大鼠皮膚顯示胞質(zhì)Prx I染色從基底層到顆粒層呈增強(qiáng)趨勢(shì)，毛囊外毛根鞘和皮脂腺也有表達(dá)［8］。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)人類與大鼠皮膚中Prx I表達(dá)模式存在較大差異。SAK皮損中Prx I表達(dá)明顯高于皮損周圍及正常皮膚。皮損中Prx I強(qiáng)陽性細(xì)胞彌漫分布于基底層及棘層，皮損周圍皮膚中Prx I表達(dá)于棘層中下部及基底層，而正常皮膚中Prx I僅在基底層有弱陽性染色。

肝癌、肺癌、食管癌、膀胱癌等實(shí)體腫瘤和白血病中Prx I過表達(dá)［9］。Prx I蛋白既對(duì)紫外線誘導(dǎo)氧化損傷有保護(hù)作用，也抑制UVA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)；Prx I和Prx II在清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的過氧化氫過程中起重要作用，也參與細(xì)胞增殖、分化、NK細(xì)胞活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)、成骨調(diào)節(jié)［10］。Prx I基因缺陷小鼠成纖維細(xì)胞增殖減少，對(duì)DNA氧化損傷的敏感性增加，提示Prx I是老年小鼠重要的抗氧化分子［11］。此外，我們同期的研究發(fā)現(xiàn)SAK皮損中Cullin 3表達(dá)增加，可能導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增加。因此，Prx I高表達(dá)可能通過清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的過氧化氫，減輕Cullin 3過表達(dá)所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而使病變皮膚達(dá)到暫時(shí)性內(nèi)環(huán)境平衡；另一方面，Prx I高表達(dá)可能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致本病皮損的棘層肥厚和角化過度。

CLASPl蛋白屬于著絲點(diǎn)外層成分，主要與胞質(zhì)鏈接蛋白170（cytoplasmic linker protein-170，CLIP-170）相互作用，調(diào)節(jié)紡錘體微管動(dòng)力學(xué)［12］。人CLASP1基因定位在2q14.2，編碼蛋白分子量約150 kD［13］。我們發(fā)現(xiàn)SAK皮損中CLASP1表達(dá)明顯高于皮損周圍及正常皮膚。SAK皮損中CLASP1在棘層胞質(zhì)呈強(qiáng)陽性染色，部分病例也有基底層和顆粒層著色；皮損周圍及正常皮膚中，也可見棘層染色，但染色強(qiáng)度明顯較弱。盡管人類皮膚中CLASP1免疫染色定位未見報(bào)道，但HeLa細(xì)胞中CLASPl蛋白常位于細(xì)胞邊緣［13］與本文結(jié)果相似。微管是由α、β微管蛋白二聚體組成的高度動(dòng)態(tài)化結(jié)構(gòu)，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)、關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及應(yīng)激反應(yīng)［14］。因此，CLASP1表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化，導(dǎo)致SAK皮損的棘層肥厚和角化過度。另外，在正常乳腺皮膚中，激光共焦顯微鏡檢查顯示CLIP-170蛋白與1個(gè)效應(yīng)器聚集于板層小體，并與板層小體中組織蛋白酶D（CTSD）有關(guān)聯(lián)［15］。我們推測(cè)CLASP1蛋白可能也富集于板層小體，與CTSD有一定關(guān)聯(lián)。CTSD在表皮分化階段可激活轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1，下調(diào)外皮蛋白和兜甲蛋白表達(dá)，降低角化細(xì)胞結(jié)合脂質(zhì)能力和皮膚屏障功能，引起皮膚角化過度、脫屑［16］。CTSD也參與銀屑病表皮過度增殖和異常分化過程［17］。我們同期的研究結(jié)果顯示SAK皮損中CTSD表達(dá)增多，推測(cè)CLASP1可能與CTSD起協(xié)同作用，參與表皮過度增殖和異常分化。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)SAK皮損中Prx I、CLASP1表達(dá)上調(diào)，可能參與角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和異常分化。

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（收稿:2015-08-22）

Expression of peroxiredoxin I and cytoplasmic linker associated protein 1 in lesions of symmetrical acrokeratoderma

YU Zuozhong，CHENG Yunlong，SHENG Ping，LI Shijie，F(xiàn)AN Yiming.
Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China
Corresponding author:Fan Yiming，E-mail:ymfan1963@163.com

Objective:To detect the expression of peroxiredoxin I（Prx I）and cytoplasmic linker associated protein 1（CLASP1）in the lesions of symmetrical acrokeratoderma（SAK）.Methods:The level of Prx I and CLASP1 mRNA in lesions and perilesional skin from 9 patients and normal skin from 9 healthy controls was detected by RT-PCR and the level of protein was detected by immunohistochemistry.Results:The expression level of Prx I and CLASP1 mRNA in lesions was（0.94±0.66）and（0.95±0.76），which was higher than those in perilesional skin（0.51±0.20 and 0.56±0.31）and normal skin（0.45±0.26 and 0.47±0.33）. The positive cells of Prx I were predominantly located in the stratum spinosum and basal layers in the skin lesions，while the positive cells of CLASP1 were located in the stratum spinosum.The number of positive cells of Prx I and CLASP1 in lesions were more than those in the perilesional and normal skin.Conclusion:Over-expression of Prx I and CLASP1 may be involved in the hyperproliferation and abnormal differentiation of epidermal keratinocytes in the lesions of SAK.

symmetrical acrokeratoderma；peroxiredoxin I；cytoplasmic linker associated protein

廣東醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新基金（編號(hào):STIF201103）

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，湛江，524001

樊翌明，E-mail:ymfan1963@163.com

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