阿魏酸印跡聚合物微球的合成及特異吸附性能

羅孟君（益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南益陽413000）

阿魏酸印跡聚合物微球的合成及特異吸附性能

羅孟君
（益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南益陽413000）

擬制備阿魏酸分子印跡聚合物微球，考察聚合物的特異吸附性能。以阿魏酸為模板分子，丙烯酰胺（AM）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，2，2′-偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，采用沉淀聚合法合成分子印跡微球，采用靜態(tài)吸附及掃描電鏡（SEM）方法對微球進(jìn)行表征。制得的印跡聚合物微球的形貌和吸附性能較好，對阿魏酸與肉桂酸的選擇性分離因子α為1.97。分子印跡聚合物微球?qū)Π⑽核岱肿佑刑禺愋晕胶妥R別能力。

沉淀聚合法；分子印跡聚合物；阿魏酸

分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technology，MIT）是將印跡分子與單體、交聯(lián)劑在溶液中進(jìn)行聚合得到高分子聚合物，然后通過物理或化學(xué)的方法除去聚合物中的印跡分子，得到在空間和結(jié)合位點上與印跡分子完全匹配的聚合物的技術(shù)［1-4］。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）具有特異性識別性能，有“塑料抗體”的稱號，它具有高選擇性、經(jīng)濟(jì)性、重復(fù)使用周期長、化學(xué)性能穩(wěn)定、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點，近年來廣泛應(yīng)用于色譜分離、生物酶模擬、分離材料、人工受體、仿生傳感器檢測和臨床藥物分析等領(lǐng)域［5-8］。

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是一種功能性酚酸［9］，在阿魏、當(dāng)歸、升麻、川芎等常用中藥植物中與細(xì)胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián)構(gòu)成細(xì)胞壁的一部分而廣泛存在。它具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎活性，可用于心血管疾病的治療［10-11］。作為一種廣泛存在且具有強(qiáng)大機(jī)體保護(hù)作用的活性分子，阿魏酸在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域的用途越來越廣泛。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對阿魏酸的來源、在生物體內(nèi)的合成機(jī)制及化學(xué)合成方法進(jìn)行了大量的研究探索［12-14］，希望找到一種穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)的獲取阿魏酸的途徑。

本論文報道以阿魏酸為模板分子，丙烯酰胺（AM）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，2，2'-偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，乙腈為致孔劑，采用沉淀聚合法合成了對阿魏酸分子有特異性吸附、識別性能的MIP微球，通過平衡吸附實驗和Scatchard分析，對該分子印跡聚合物的結(jié)合作用和選擇性能進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司產(chǎn)品；肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司產(chǎn)品；甲基丙烯酸（純度99%），美國Sigma公司產(chǎn)品；丙烯酰胺（純度99%），美國Sigma公司產(chǎn)品；乙二醇二甲基丙烯酸酯（純度98%），科密歐公司產(chǎn)品；偶氮二異丁腈（化學(xué)純），上海阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純），科密歐公司產(chǎn)品。

HH-4型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司制造；UV-2450型紫外分光光度計，日本島津公司制造；SEM Hitachi S-4300型掃描電子顯微鏡，日本日立公司制造；AX-200型電子天平，日本Shimadzu Philippines公司制造；ASAP2020型比表面和孔徑分布測定儀，美國Micromeritics Instruments公司制造。

1.2分子印跡聚合物微球的制備

1.2.1功能單體的考察室溫下，以乙腈作為溶劑配制一定濃度的阿魏酸溶液，分別與甲基丙烯酸、丙烯酰胺溶液混合，形成復(fù)合物。利用紫外分光光度計，分別對甲基丙烯酸、丙烯酰胺與模板分子形成的配合物吸收值進(jìn)行測定，選出最佳功能單體。

1.2.2功能單體用量的考察為篩選出制備阿魏酸分子印記微球工藝中模板分子與功能單體的最佳配比組合，分別按照模板分子與功能單體的物質(zhì)的量配比為1∶0、1∶2、1∶4、1∶6的不同組合進(jìn)行檢測，將移取后的兩種物質(zhì)共同溶于一定體積的乙腈中，定容后分別對各溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，根據(jù)吸收峰的比較結(jié)果選定最佳配比值。

1.2.3阿魏酸分子印跡聚合物微球的制備準(zhǔn)確稱取0.1 mmol阿魏酸溶于一定量20 mL乙腈中，加入0.4 mmol功能單體AM，于室溫下振蕩30 min，置于冰箱中過夜，使阿魏酸與AM充分作用，然后加入2 mmol交聯(lián)劑EGDMA及10 mg引發(fā)劑AIBN，混合均勻后，通氮氣10 min除氧，密封，將混合液置于恒溫水浴箱，60℃熱聚合24 h。聚合產(chǎn)物離心獲得沉淀，用甲醇與乙酸的混合溶液（體積比8∶2）洗掉模板分子與未參與聚合的反應(yīng)物，直至洗凈，再用甲醇洗去過量的乙酸，于烘箱中45℃真空干燥，所得聚合物為MIP。同時按同樣方法不加阿魏酸制備空白聚合物（NIP）。

1.3吸附性能測定

1.3.1分析方法

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取8 mg阿魏酸放入小燒杯中，加入少許乙腈，待完全溶解后移入500 mL容量瓶中定容。搖勻后得到質(zhì)量濃度為16 mg/L的阿魏酸儲備液。根據(jù)儲備液分別配制質(zhì)量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L的阿魏酸溶液。肉桂酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液依上述步驟同樣配制。

2）最大吸收波長的確定：將質(zhì)量濃度為4 mg/L的阿魏酸和肉桂酸溶液分別進(jìn)行紫外全波長掃描，得光譜圖，據(jù)此選擇測定所用波長對。測定阿魏酸的波長對為：λ1=271 nm作為測量波長，λ2=255 nm作為參比波長；肉桂酸的波長對為：λ3=292 nm作為測量波長，λ4=325 nm作為參比波長。

3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：用阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列在波長λ1和λ2處分別測定，可得吸光度差值ΔA1與質(zhì)量濃度C1（mg/L）間的線性關(guān)系；用肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列在波長λ3和λ4處分別測定，可得吸光度差值ΔA2與質(zhì)量濃度C2（mg/L）間的線性關(guān)系。

1.3.2聚合物吸附性能的測定將100.0 mg阿魏酸MIP微球放入40 mL的磨口錐形瓶中，分別加入不同濃度的阿魏酸乙腈溶液，室溫振蕩吸附24 h，離心分離后取上層清液，用方法1.3.1測定阿魏酸濃度，平行實驗3次，根據(jù)吸附前后濃度變化計算聚合物的吸附量Q（μmol/g）；繪制出吸附量Q與不同濃度關(guān)系的靜態(tài)等溫吸附曲線。同時考察NIP微

球的吸附性能。

式（1）中：C0為吸附前溶液中阿魏酸的濃度（mmol/ L）；C為吸附后溶液中阿魏酸的濃度（mmol/L）；m為稱取的分子印跡聚合物的質(zhì)量（mg）；V為阿魏酸溶液的體積（mL）。

1.3.3吸附動力學(xué)測定分別稱取100 mg的MIP 和NIP微球至50 mL的磨口錐形瓶中，分別加入25 mL濃度為2.5 mmol/L的阿魏酸乙腈溶液，然后將其放入恒溫振蕩器中室溫振蕩。每隔20 min取20 μL溶液進(jìn)行色譜分析，測定溶液中阿魏酸濃度，從而分析其吸附動力學(xué)性質(zhì)。

1.3.4MIP微球的選擇性考察為了觀察MIP微球的選擇性識別性能，選用阿魏酸的結(jié)構(gòu)類似物肉桂酸作為競爭底物，在濃度為2.5 mmol/L的乙腈溶液中進(jìn)行平衡吸附實驗，測定達(dá)到平衡時溶液中的目標(biāo)分子濃度，并計算出阿魏酸與肉桂酸的分離因子（α）及分離系數(shù)（KD），

式（2）中：cp（mmol/L）表示聚合物結(jié)合底物的濃度，cs（mmol/L）表示溶液中底物的平衡濃度。α為2種不同底物的分離系數(shù)之比。

1.4聚合物形貌表征分析

利用Hitachi S-4300 SEM掃描電子顯微鏡對聚合物微球的表面結(jié)構(gòu)和粒徑進(jìn)行分析；利用ASAP2020型比表面和孔徑分布測定儀對MIP與NIP的比表面積及孔徑參數(shù)進(jìn)行測定。

2　結(jié)果與討論

2.1阿魏酸分子印跡聚合物的制備

2.1.1功能單體的選擇分子印跡聚合物的特異吸附性能體現(xiàn)在其對印跡分子的選擇性識別能力。通過在相同溶劑與用量條件下，針對兩種常用的功能單體與模板分子通過氫鍵作用形成的配合物在相關(guān)波長范圍吸光度值的減小情況，對兩種功能單體進(jìn)行比較，篩選出效果最優(yōu)的功能單體。功能單體的選擇通常是通過紫外吸收曲線來測定的，因為模板分子與功能單體進(jìn)行自組裝時主要通過氫鍵進(jìn)行作用，氫鍵的形成對分子軌道的能量有影響，它使基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷產(chǎn)生能級差，由此使不同組合的復(fù)合物在色譜峰上的位置發(fā)生變化，氫鍵作用越強(qiáng)，產(chǎn)生的差異越大，這能更好地說明模板分子與功能單體的結(jié)合能力，如圖1所示。

圖1　阿魏酸與功能單體之間的作用Fig.1　Interaction between FA and functional monomers

2.1.2模板分子與功能單體用量比率的選擇通過紫外吸收曲線測定功能單體與模板分子的比率，按阿魏酸與AM物質(zhì)的量比分別為1∶0、1∶2、1∶4、1∶6的量進(jìn)行稱取，均溶于25 mL乙腈中作用，紫外光譜分析見圖2。

圖2　不同比率的阿魏酸與丙烯酰胺吸收光譜Fig.2　Absorption spectra of FA with different proportion of AM in acetonitrile

從圖2可以看出，隨著模板分子與功能單體比率的增加，吸光度值逐漸減低。FA與AM物質(zhì)的量比率由1∶2到1∶4時紫外吸收值的變化趨勢相對較大，說明此時FA與AM結(jié)合位點較多；當(dāng)物質(zhì)的量比率由1∶4到1∶6時，紫外吸收值降低得不多，為避免AM過量而發(fā)生自身締合，本實驗選擇FA與AM的物質(zhì)的量比率為1∶4。

2.2MIP與NIP對阿魏酸吸附性能的考察

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線按照1.3.1方法，分別對阿魏酸與肉桂酸進(jìn)行紫外檢測，根據(jù)吸光度差值與質(zhì)量濃度的關(guān)系，分別得到阿魏酸與肉桂酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3、圖4）。

圖3　阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of FA

圖4　肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of CA

其中阿魏酸回歸方程為

肉桂酸回歸方程為

2.2.2吸附量的考察分別考察了MIP與NIP對不同濃度阿魏酸溶液的吸附性能，繪制出了相應(yīng)的等溫吸附曲線，吸附詳情見圖5?？芍?，在0.2～5.0 mmol/L范圍內(nèi)，吸附量與溶液濃度成正相關(guān)性。同時，印跡聚合物的吸附量明顯大于非印跡聚合物，這是由于印跡聚合物中有預(yù)定的孔穴，內(nèi)部官能團(tuán)能與模板分子作用，而非印跡聚合物中則沒有這種孔穴，其對阿魏酸的吸附為非特異性吸附。

父親用這些錢，做了一頂紗帳，掛在床上，擋住了蚊蟲的進(jìn)攻。這是我們家第一頂蚊帳。做好后的第一晚，父親讓我和弟弟睡在里面，說我是功臣。嘻嘻！

圖5　MIP與NIP的等溫吸附曲線Fig.5　Adsorption isotherm of FA MIP and NMIP

2.2.3Scatchard分析以Scatchard模型對聚合物的結(jié)核性能進(jìn)行評價：

式（5）中：Kd為結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)，Qmax為結(jié)合位點的最大表觀結(jié)合量（μmol/g），Cmat為吸附達(dá)到平衡后阿魏酸的平衡濃度（mmol/L），Q為聚合物對阿魏酸的吸附量（μmol/g）。

以Q/Cmat對Q作圖，由圖6可見，對于MIP來說，Q/Cmat對Q不是線性關(guān)系，說明MIP對阿魏酸的結(jié)合位點是不等價的，但其Scatchard曲線可以分為線性關(guān)系良好的兩段，由此推測MIP有兩類不同的吸附。而NIP的Scatchard曲線是線性關(guān)系，說明只存在一種類型的吸附。通過對圖6中MIP的兩段直線的截距和斜率計算得到：Kd1=0.518 mmol/L，Kd2= 13.137 mmol/L，結(jié)合位點最大表征結(jié)合量Qmax1= 1.918 μmol/g，Qmax2=17.905 μmol/g；通過對NIP的Scatchard曲線截距和斜率計算得到：Kd3= 3.175 mmol/L，結(jié)合位點最大表征結(jié)合量Qmax3= 4.44 μmol/g。由此可知，印跡聚合物具有很大的特異性吸附，而空白聚合物則沒有特異性吸附。

圖6　scatchard曲線Fig.6　Scatchard plotanalysis of the binding affinity

2.2.4MIP與NIP微球的吸附動力學(xué)對MIP與NIP微球進(jìn)行吸附動力學(xué)測定，結(jié)果如圖7所示。

圖7　吸附動力學(xué)曲線Fig.7　Kinetics of adsorption of MIP and NIP

由圖7可知，隨著時間增長，MIP對阿魏酸的吸附量逐漸增大，當(dāng)吸附時間達(dá)到100 min，吸附接近飽和。NIP對阿魏酸吸附量不大，隨著時間增長，也呈增大的趨勢。

2.3MIP微球?qū)Φ孜锏奈竭x擇性考察

以與阿魏酸結(jié)構(gòu)類似的N-甲基-阿魏酸作為競爭底物，在濃度5.0 mmol/L的乙腈溶液中進(jìn)行平衡吸附實驗。實驗結(jié)果如表1所示。

表1　聚合物微球的選擇性Table 1　Selectivity of MIP Micro-Spheres

由表1可知，與NIP微球相比，MIP微球?qū)Π⑽核峋哂休^好的選擇性。

2.4MIP與NIP掃描電鏡分析

用掃描電子顯微鏡（SEM）分別觀測兩種微球的形貌，其中MIP微球粒徑約2 μm，NIP微球粒徑約3 μm。由圖8可看出，實驗中制備的MIP與NIP形態(tài)均一，除NIP粒徑較MIP大外，彼此間無明顯差異，這可能是制備過程中由于印記分子阿魏酸的存在，使得聚合物的空間排列發(fā)生了改變。

圖8　MIP與NIP的掃描電鏡圖Fig.8　SEM photographs of MIP and NIP

2.5MIP與NIP的比表面積與孔徑特征

表2列出了MIP與NIP顆粒的氮氣吸附實驗結(jié)果，可見MIP與NIP顆粒的比表面積與孔徑參數(shù)。

表2　MIP與NIP的部分結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 2　Structure parameters of MIP and NIP

3　結(jié)語

采用沉淀聚合法制備了阿魏酸分子印跡聚合物微球，并對其制備方法進(jìn)行了初步優(yōu)化。吸附性能考察實驗說明，印記聚合物對阿魏酸分子能選擇性吸附，MIP吸附性能較NIP強(qiáng)。吸附選擇性實驗結(jié)果表明，相對于與阿魏酸結(jié)構(gòu)相似的肉桂酸，實驗中所制備的MIP微球?qū)Π⑽核嵊休^強(qiáng)的選擇結(jié)合特性，MIP與NIP對阿魏酸的最大表觀結(jié)合量分別為17.905 μmol/g與3.175 mmol/L。該方法簡單易行，聚合物微球顆粒在2μm左右，為天然產(chǎn)物中阿魏酸的分離提純提供了一種新的有效途徑。

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Preparation of Molecularly Imprinted Polymer Microspheres and Their Recognition Properties for Ferulic Acid

LUO Mengjun
（Yiyang Medical College，Yiyang 413000，China）

The ferulic acid molecular imprinted polymer（MIP）microspheres were synthesized and the recognition properties of MIP for ferulic acid were studied.Ferulic acid and ethyleneglycol dimethacrylate（EGDMA）were used as the template and cross-linker to synthesize the Ferulic acid MIP microspheres，respectively.The microspheres were inerratic microspheres，which characterized by static adsorption and scanning electron microscopy（SEM）.The MIP microspheres showed that the high adsorption capacity and the partition cinnamic acid of the microspheres adsorbing ferulic acid was 1.97.Ferulic acid MIP microspheres had the bilirubin specific adsorption and identification ability to the ferulic acid molecules.

precipitation polymerization，molecular imprinted polymer，ferulic acid

TQ 050.43

A

1673—1689（2016）03—0290—06

2014-11-27

國家自然科學(xué)基金項目（21275049）；湖南省教育廳科研項目（14C1126）。

羅孟君（1977—），女，湖南益陽人，理學(xué)碩士，副教授，主要從事天然植物功能成分提取與應(yīng)用研究。

E-mail：luomengjun78@sina.com