葉黃素持續(xù)補(bǔ)充對機(jī)體葉黃素水平及抗氧化能力影響研究

馬婷婷，滕　倩，梁　惠，汪求真，張華琦，馬愛國

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究所，山東青島　266021)

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葉黃素持續(xù)補(bǔ)充對機(jī)體葉黃素水平及抗氧化能力影響研究

馬婷婷，滕倩，梁惠，汪求真，張華琦，馬愛國

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究所，山東青島266021)

目的：探討葉黃素持續(xù)補(bǔ)充對機(jī)體血漿葉黃素濃度、血漿氧化應(yīng)激水平及氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)水平的影響。方法：20名健康青年志愿者，隨機(jī)分為2組，分別為葉黃素組和正常對照組，葉黃素組每天補(bǔ)充葉黃素20mg，連續(xù)補(bǔ)充20d，正常對照組未給予任何補(bǔ)充。試驗(yàn)前及首次口服后的12、24、72、144、240、480、720h分別留取清晨空腹靜脈血5mL，分離血漿。HPLC檢測血漿葉黃素濃度，測定血漿總超氧化物歧化酶(T-SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量、Ox-LDL濃度。結(jié)果：葉黃素組血漿葉黃素濃度呈穩(wěn)定上升趨勢，GSH-Px及T-SOD活性呈持續(xù)性上升趨勢，MDA含量呈持續(xù)性下降趨勢。葉黃素組血漿葉黃素濃度在口服72、144、240、480h后分別升高59%、115%、164%、214%(P均<0.05)，且女性血漿葉黃素濃度在口服240h后顯著高于男性(P<0.05)；血漿GSH-Px活性在補(bǔ)充20d后升高42%(P<0.05)，MDA含量下降23%(P<0.05)。結(jié)論：每天補(bǔ)充葉黃素20mg，持續(xù)補(bǔ)充20d能有效提高機(jī)體血漿葉黃素濃度及機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力。

葉黃素；血漿；抗氧化；氧化型低密度脂蛋白

葉黃素是一種含紫羅酮環(huán)的二羥基類胡蘿卜素，存在于深綠色葉類蔬菜及紅橙色水果中，具有猝滅單線態(tài)氧、捕獲活性氧自由基并阻止其對生物膜侵害的抗氧化功能。人體自身不能合成葉黃素，葉黃素需要經(jīng)由膳食等攝入，研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素每日平均攝入量為7.8～10.2mg[1，2]，但因?yàn)槿~黃素極低的生物利用度以及多種影響葉黃素吸收的因素[3]，進(jìn)入血液中的葉黃素含量極少，平均為0.37μmol/L[1]。在西方國家，葉黃素作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑已在食品生產(chǎn)與加工中得到開發(fā)和應(yīng)用。自由基可以由日常生活中的多種途徑產(chǎn)生，比如，人體正常新陳代謝、大量體育運(yùn)動(dòng)、吸煙、膳食脂肪、煙熏火烤肉、射線、農(nóng)藥、塑料用品、油漆等[4]，過多的自由基對機(jī)體造成較大的損傷，引起脂質(zhì)過氧化、衰老[5]等。脂質(zhì)過氧化等氧化應(yīng)激反應(yīng)與多種慢性病的發(fā)病密切相關(guān)，如心血管疾病、癌癥等[6]。流行病學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究表明，食用富含葉黃素的食物可以降低慢性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7，8]，提示葉黃素在抗脂質(zhì)過氧化等方面可能起到重要作用。本研究以健康成年人為研究對象，以較高劑量葉黃素補(bǔ)充劑進(jìn)行干預(yù)，觀察并評價(jià)血漿葉黃素濃度及機(jī)體氧化應(yīng)激水平的連續(xù)性變化趨勢，研究葉黃素在機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化方面的影響，為人群合理補(bǔ)充葉黃素提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

葉黃素膠囊(美國Vitacost公司)；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(5mg，90%，購于美國ChromaDex 公司)；甲醇、乙腈(均HPLC級(jí))及BHT(美國Sigma公司)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)試劑盒(美國Cloud-Clone 公司)。

低溫離心機(jī)(美國Sigma公司，30-30K型)；I型快速混勻器(常州國華電氣有限公司)；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；722s分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；ELx808吸收光酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)。

1.2志愿者納入及分組

招募某高校青壯年志愿者20名，其中男性9名、女性11名，年齡20～30歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)消化系統(tǒng)疾病患者；(2)低血糖、甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病等慢性代謝性疾病患者；(3)近期服用過任何營養(yǎng)補(bǔ)充劑及藥物者；(4)超重者：體重指數(shù)BMI≥28；(5)孕婦及哺乳期婦女。20名志愿者男女分組后，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對照組及葉黃素組，每組10人。

該試驗(yàn)獲得青島市疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學(xué)倫理專家委員會(huì)批準(zhǔn)(ChiCTR-OO-14004816)，志愿者均于試驗(yàn)前填寫知情同意書。試驗(yàn)期間由專業(yè)人員定期定量發(fā)放葉黃素補(bǔ)充劑，每日電話提醒志愿者服用補(bǔ)充劑并填寫膳食記錄表，隨時(shí)記錄漏服情況及原因，指導(dǎo)受試者忌食葉黃素含量較高的食物，以避免造成干擾。

1.3試驗(yàn)流程

葉黃素組每日口服葉黃素膠囊2粒(10mg/粒)，口服20d，停止口服后觀察10d；正常對照組不進(jìn)行葉黃素的任何額外補(bǔ)充。2組于口服前以及首次口服后的12、24、72、144、240、480、720h抽取清晨空腹靜脈血5mL，肝素鈉抗凝，要求志愿者于每次取血前1d的21：00后禁食，不禁水。全血靜置30min后，3 500r/min離心10min分離血漿，EP管分裝，錫紙包裹，-80℃凍存，待檢測。取血、離心、分裝、凍存、檢測等過程全程避光。

1.4指標(biāo)測定

血漿葉黃素濃度：(1)凍存的血漿樣品于4℃溶解，甲醇去蛋白法提取血漿中的葉黃素[9]，取上清液于裝有內(nèi)襯管的棕色進(jìn)樣瓶中待上機(jī)測定；(2)高效液相色譜法測定血漿葉黃素濃度：色譜柱C18(250mm×4.60mm×5μm)，流動(dòng)相為甲醇：乙腈= 65∶35，流速0.8mL/min，檢測波長446nm，進(jìn)樣量20μL，柱溫25℃[9]。血漿T-SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量及Ox-LDL濃度：按各試劑盒說明書操作。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。2組不同時(shí)間點(diǎn)血漿葉黃素濃度采用多元方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用LSD方法；2組干預(yù)前后MDA含量、T-SOD及GSH-Px 活性、Ox-LDL濃度的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異有顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1志愿者基本情況

志愿者基本情況見表1，2組志愿者在性別、年齡、BMI等方面均無顯著性差異(P>0.05)。

2.2葉黃素補(bǔ)充后血漿葉黃素濃度的連續(xù)性變化

2組志愿者不同時(shí)間點(diǎn)血漿葉黃素濃度見表2。與正常對照組相比，口服144、240、480h后，血漿葉黃素濃度顯著升高(P均<0.01)，且不同時(shí)間點(diǎn)葉黃素組血漿葉黃素濃度升高百分率均顯著高于正常對照組(P均<0.05)；與補(bǔ)充前(0h)相比，葉黃素組血漿葉黃素濃度在口服膠囊72、144、240、480h后分別升高59%、115%、164%、214%(P均<0.05)。隨著服用天數(shù)的增加，葉黃素組血漿葉黃素濃度總體呈穩(wěn)定上升趨勢，正常對照組基本無變化(附圖)。2組男女志愿者不同時(shí)間點(diǎn)血漿葉黃素濃度見表3。葉黃素組女性血漿葉黃素濃度在口服10d后顯著高于男性(P<0.05)。

表1　志愿者基本情況

表2　葉黃素補(bǔ)充后兩組不同時(shí)間點(diǎn)血漿葉黃素濃度

注：與同一時(shí)間點(diǎn)對照組相比，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；與0h相比，aP<0.05、aaP<0.01、aaaP<0.001。

表3　2組男女不同時(shí)間點(diǎn)血漿葉黃素濃度

注：與葉黃素組男性相比，*P<0.05。

附圖　兩組不同時(shí)間點(diǎn)血漿葉黃素濃度變化趨勢

2.3補(bǔ)充葉黃素對人體氧化應(yīng)激水平的影響

2組不同時(shí)間點(diǎn)氧化應(yīng)激水平的變化見表4。隨著服用天數(shù)的增加，葉黃素組血漿GSH-Px活性及T-SOD活性均呈持續(xù)性上升趨勢，MDA含量呈持續(xù)性下降趨勢。與正常對照組相比，葉黃素組口服葉黃素20d后血漿GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著下降(P<0.05)；與補(bǔ)充前(0h)相比，葉黃素組血漿GSH-Px活性在補(bǔ)充10、20d后分別升高42.20%，42.34%(P<0.01)，MDA含量下降23%(P<0.05)，T-SOD活性無顯著性差異(P>0.05)。

表4　2組不同時(shí)間點(diǎn)氧化應(yīng)激水平的變化

注：與同一時(shí)間點(diǎn)對照組相比，*P<0.05；與0h比較，aP<0.05、aaP<0.01。

2.4補(bǔ)充葉黃素對人體血漿氧化型低密度脂蛋白濃度的影響

葉黃素補(bǔ)充前后2組血漿氧化型低密度脂蛋白濃度見表5，與補(bǔ)充前相比，葉黃素組在補(bǔ)充葉黃素后血漿氧化型低密度脂蛋白濃度降低18%，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表5　葉黃素補(bǔ)充前后2組血漿氧化型低密度脂蛋白濃度的變化

3　討論

人體自身無法合成葉黃素，必須通過膳食補(bǔ)充；但膳食葉黃素來源有限，隨著年齡的增加，葉黃素在人體組織及細(xì)胞內(nèi)的水平可能逐漸減少。血漿葉黃素主要反應(yīng)機(jī)體近期的葉黃素?cái)z入情況[10]，研究發(fā)現(xiàn)，血漿葉黃素濃度隨一定口服劑量及口服時(shí)間的增加而升高[11-14]。本研究與上述研究結(jié)果相一致，志愿者每天補(bǔ)充葉黃素20mg，連續(xù)補(bǔ)充20d，血漿葉黃素濃度呈穩(wěn)定上升趨勢，補(bǔ)充72、144、240、480h后分別升高59%、115%、164%、214%(P均<0.05)，停止葉黃素補(bǔ)充后持續(xù)觀察10d，血漿葉黃素濃度基本降至本底水平。LeMa等[12]研究發(fā)現(xiàn)，每天分別補(bǔ)充葉黃素6、12mg，持續(xù)補(bǔ)充18w，血漿濃度分別為補(bǔ)充前的1.8、2.3倍。不同研究之間血漿葉黃素濃度升高的倍數(shù)差異可能受劑量、補(bǔ)充劑純度、受試者葉黃素吸收代謝率、地區(qū)飲食差異等因素影響。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素組補(bǔ)充葉黃素240h后，女性血漿葉黃素濃度顯著高于男性(P<0.05)，這一結(jié)果與Broekmans等[11]研究發(fā)現(xiàn)的女性血清葉黃素濃度顯著高于男性相一致，這可能與一定水平的脂類促進(jìn)葉黃素吸收有關(guān)[15]，而女性體內(nèi)脂類平均水平高于男性。

在細(xì)胞和細(xì)胞膜中，葉黃素是脂類過氧化反應(yīng)的斷鏈抗氧化劑，能與脂類結(jié)合而有效抑制脂質(zhì)過氧化，抵御自由基在人體內(nèi)造成細(xì)胞與器官衰老損傷。有研究[16]報(bào)道，隨著2型糖尿病患者血清葉黃素水平的增加，血清MDA含量降低，血清SOD與GSH-Px的活性提高。劉春泉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，成人每天每kg體重補(bǔ)充葉黃素25mg，持續(xù)補(bǔ)充90d，GSH-Px活性升高11.3%。本研究發(fā)現(xiàn)，健康成年人持續(xù)補(bǔ)充葉黃素20d，血漿GSH-Px活性及T-SOD活性均呈持續(xù)性上升趨勢，MDA含量呈持續(xù)性下降趨勢；與補(bǔ)充前相比，葉黃素組血漿GSH-Px活性在補(bǔ)充20d后升高42.34%(P<0.01)，MDA含量降低23%(P<0.05)，T-SOD活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。葉黃素具有較強(qiáng)的還原性和淬滅自由基的能力，葉黃素清除自由基的機(jī)制主要有3種：電子轉(zhuǎn)移、氫轉(zhuǎn)移和自由基加成反應(yīng)，類胡蘿卜素能更有效地清除羥自由基，而超氧自由基清除能力與之相比較弱[18]。因此，本研究中T-SOD活力雖有上升，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)是由低密度脂蛋白(LDL)經(jīng)自由基等作用氧化修飾而來，近年來，大量研究認(rèn)為，氧化型低密度脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化[19]、冠心病[20]、糖尿病腎病[21]等慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，口服葉黃素膠囊20d后，葉黃素組血漿氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)濃度下降18%，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，與Carroll等[22]研究結(jié)果相一致，Linseisen等[23]也研究發(fā)現(xiàn)，單次口服抗氧化劑混合物(維生素E及類胡蘿卜素)有保護(hù)膽固醇不被氧化修飾的潛能。這一結(jié)果提示，葉黃素對于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等疾病可能具有重要意義，目前關(guān)于正常人群中葉黃素與氧化型低密度脂蛋白關(guān)系的研究甚少，健康人群補(bǔ)充葉黃素對體內(nèi)氧化型低密度脂蛋白的具體影響有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，每天補(bǔ)充葉黃素20mg，持續(xù)補(bǔ)充20d能有效提高機(jī)體血漿葉黃素濃度及機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力?！?/p>

[1]張福東，朱怡萍，蔡美琴.上海某社區(qū)居民葉黃素膳食攝入量與血清含量的相關(guān)性分析[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2012，29(9)：563-565.

[2]王子昕，林曉明.北京社區(qū)居民夏秋季節(jié)膳食葉黃素、玉米黃素?cái)z入量分析[J].中國食物與營養(yǎng)，2010，3：77-80.

[3]PatrickBorel，etal.Interindividualvariabilityofluteinbioavailabilityinhealthymen：characterization，geneticvariantsinvolved，andrelationwithfastingplasmaluteinconcentration[J].AmJClinNutr，2014，100：168-175.

[4]金曉紅.環(huán)境中的自由基與人體健康[J].化學(xué)世界，2002，43(5)：277-279.

[5]呂慧玲.自由基與人類衰老[J].科技資訊，2011，(8)：252-253.

[6]BenzieIF.Evolutionofantioxidantdefencemechanisms[J].Europeanjournalofnutrition，2000，39(2)：53-61.

[7]LiuS，LeeIM，AjaniU，etal.Intakeofvegetablesrichincarotenoidsandriskofcoronaryheartdiseaseinmen：ThePhysicians’HealthStudy[J].InternationalJournalofEpidemiology，2001，30(1)：130-135.

[8]TanakaT，ShnimizuM，MoriwakiH.Cancerchemopreventionbycarotenoids[J].Molecules(Basel，Switzerland)，2012，17(3)：3202-3242.

[9]趙彥會(huì)，等.血漿樣品中葉黃素的快速測定[J].衛(wèi)生研究，2015，44(1)：124-126.

[10]馬愛國，鄭櫻.葉黃素[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，6：531-534.

[11]BroekmansWM，BerendachotTT，etal.Macularpigmentdensityinrelationtoserumandadiposetissueconcentrationsofluteinandserumconcentrationsofzeaxanthin[J].AmJClinNutr，2002，76：595-603.

[12]MaL，etal.SerumluteinanditsdynamicchangesduringsupplementationwithluteininChinesesubjects[J].AsiaPacJClinNutr，2009，18(3)：318-25.

[13]Yang-MuHuang，etal.EffectofSupplementalLuteinandZeaxanthinonSerum，MacularPigmentationandVisualPerformanceinPatientswithEarlyAge-RelatedMacularDegeneration[J].BioMedResearchInternational，2014.http：//dx.doi.org/10.1155/2015/564738.

[14]張福東，朱怡萍，蔡美琴.上海某社區(qū)居民葉黃素膳食攝入量與血清含量的相關(guān)性分析[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2012，29(9)：563-565.

[15]GleizeB，etal.EffectoftypeofTAGfattyacidsonluteinandzeaxanthinbioavailability[J].BritJNutr，2013，110(1)：1-10.doi：10.1017/S0007114512004813.

[16]章清，沈新南，李永烶，等.2型糖尿病患者血清葉黃素與體內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)的關(guān)系[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，37(3)：343-346.

[17]劉春泉，等.葉黃素軟膠囊抗氧化功能人體試食試驗(yàn)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，5：237-239.

[18]Trevithick-SuttonCC，F(xiàn)ooteCS，CollinsM，etal.Theretinalcarotenoidszeaxanthinandluteinscavengesuperoxideandhydroxylradicals：achemiluminescenceandESRstudy[J].MolecularVision，2006，12：11-27.

[19]王建禮，等.氧化型低密度脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(9)：1307-1310.

[20]李貴星，李萍.冠心病患者血清氧化型低密度脂蛋白及血液抗氧化狀態(tài)分析[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2004，35(5)：690-692.

[21]何穎，肖常青.氧化型低密度脂蛋白與糖尿病腎病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(4)：620-622.

[22]CarrollYL，CorridanBM&MorrisseyPA.Lipoproteincarotenoidprofilesandthesusceptibilityoflowdensitylipoproteintooxidativemodificationinhealthyelderlyvolunteers[J].Eur.J.Clin.Nutr，2000，54：500-507.

[23]LinseisenJ，etal.Effectofasingleoraldoseofantioxidantmixture(vitaminE，carotenoids)ontheformationofcholesteroloxidationproductsafterexvivoLDLoxidationinhumans[J].EuropeanJournalofMedicalResearch，1998，3(1-2)：5-12.

(責(zé)任編輯李婷婷)

Effect of Continuous Supplement of Lutein onLutein Level and Antioxidant Capacity of Body

MA Ting-ting，TENG Qian，LIANG Hui，WANG Qiu-zhen，ZHANG Hua-qi，MA Ai-guo

(Institute of Human Nutrition，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266021，China)

lutein；plasma；antioxidant；oxidizedlowdensitylipoprotein(OLDL)

國家科技支撐項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2012BAD33B01-2)。

馬婷婷(1991—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與疾病。

馬愛國(1956—)，男，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)與疾病。