miR-20a-5p通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖

公方曉　孫仁華　徐云祥　呼邦傳浙江省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江杭州　310014

論著

miR-20a-5p通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖

公方曉孫仁華徐云祥呼邦傳
浙江省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江杭州310014

目的觀察miR-20a-5p對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響，并驗(yàn)證其對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）的靶向調(diào)控作用。 方法使用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將微小RNA（miRNA）轉(zhuǎn)染入人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，實(shí)驗(yàn)分為3組，miR-20a-5p組轉(zhuǎn)染miR-20a-5p，對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miRNA，空白組未做任何轉(zhuǎn)染。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的吸光度值，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組的細(xì)胞周期變化。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞cyclin D1的蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因，內(nèi)含cyclin D1的3'端非翻譯區(qū)（3'UTR），雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-20a-5p對(duì)3'UTR的直接結(jié)合作用。 結(jié)果MiR-20a-5p組在轉(zhuǎn)染后48～120 h的吸光度值均低于對(duì)照組和空白組（P＜0.05），另外兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染后72 h，miR-20a-5p組處于G1期的比例為（63.89± 3.61）%，高于另外兩組（P＜0.05），而另外兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染后48 h，miR-20a-5p組的cyclin D1蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。與陰性對(duì)照miRNA相比，miR-20a-5p能抑制熒光素酶的活性（P＜0.05）。結(jié)論miR-20a-5p能抑制腎小管上皮細(xì)胞的增殖，并將細(xì)胞阻滯在G1期，其可能機(jī)制是miR-20a-5p抑制cyclin D1的表達(dá)，cyclin D1是miR-20a-5p的直接靶基因。

細(xì)胞周期蛋白D1；細(xì)胞增殖；腎小管；微RNAs

［Abstract］Objective To observe the effect ofmiR-20a-5p's on the proliferation of human renal tubular epithelial cells and to verify its targeted regulation of cyclin D1.M ethods miRNAswere transfected into HK-2 cells（human renal tubular epithelial cell）by LipofectamineTM2000.Cellswere divided into three groups，themiR-20a-5p group transfected with miR-20a-5p，the negative control group transfected with negative control miRNA and the blank control group transfected with nomiRNAs.The absorbances of cells in each group after transfection were evaluated by Cell Counting Kit-8（CCK-8），the cell cycles of each group were assayed by flow cytometry.The protein expression of cyclin D1 in each group after transfection was detected via Western blot.A firefly luciferase reporter vector containing 3'UTR of cyclin D1 was created and the Dual-Luciferase Reporter Assay System was used to test the direct combination ofmiR-20a-5p and 3'UTR.Results The absorbances ofmiR-20a-5p group were lower than those of negative control group and blank control group at 48-120 h after transfection（P＜0.05），and there was no statistical difference between the other two groups（P＞0.05）.The percentage of G1stage inmiR-20a-5p group was（63.89±3.61）%at 72 h after transfection，higher than those of the other two groups（P＜0.05），and there was no statistical difference between the other two groups（P＞0.05）.The protein expression of cyclin D1 inmiR-20a-5p group was lower than that of the other two groups at 48 h after transfection（P＜0.05）.Compared with negative controlmiRNA，miR-20a-5p repressed the luciferase activity（P＜0.05）. Conclusion miR-20a-5p can inhibit the proliferation of human renal tubular epithelial cells and cause a delay in the G1-stage.Themechanism may bemiR-20a-5p can repress expression of cyclin D1 and cyclin D1 is the direct target gene ofmiR-20a-5p.

［Key words］Cyclin D1；Cell proliferation；Kidney tubules；microRNAs

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是重癥患者中的一種常見合并癥，在ICU中的發(fā)病率約20%～60%，住院死亡率常超過25%，死亡率較高［1，2］。根據(jù)改善全球腎臟病預(yù)后組織（KDIGO）2012年臨床實(shí)踐指南［3］，AKI的定義為：48 h內(nèi)血清肌酐上升≥26.5μmol/L；或7 d內(nèi)血清肌酐上升至≥1.5倍基線水平；或連續(xù)6 h尿量＜0.5mL/（kg·h）。AKI的病理生理過程中，腎小管上皮細(xì)胞損傷是重要的病理性變化。細(xì)胞損傷后必然會(huì)帶來細(xì)胞周期的激活和自身細(xì)胞的增殖修復(fù)。近年來，針對(duì)AKI的腎小管細(xì)胞損傷修復(fù)及細(xì)胞周期變化的研究是一大熱點(diǎn)［4-7］。miRNA是一類負(fù)性調(diào)控信使RNA翻譯的小RNA，其與包括AKI在內(nèi)的幾乎所有疾病的發(fā)生發(fā)展均有密切關(guān)系。本研究旨在探討miR-20a-5p對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，并揭示其對(duì)cyclin D1的靶向調(diào)控作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1一般材料

所用miRNA均由美國(guó)Dharmacon公司合成：hsamiR-20a-5p（5'-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3'），陰性對(duì)照miRNA（5'-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3'）。人腎小管上皮細(xì)胞HK-2及人胚胎腎細(xì)胞293T購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC）。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（內(nèi)含碘化丙啶染色液、RNA酶）購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所。小鼠抗人cyclin D1抗體 （sc-20044）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。SDS-PAGE電泳凝膠配制試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所。熒光素酶報(bào)告基因載體pMIR-REPORT購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HK-2、293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱。每1～2天予以常規(guī)換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%培養(yǎng)瓶時(shí)予胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HK-2細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，整個(gè)轉(zhuǎn)染過程按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組，轉(zhuǎn)染miR-20a-5p的細(xì)胞為miR-20a-5p組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miRNA的細(xì)胞為對(duì)照組，不轉(zhuǎn)染miRNA的細(xì)胞為空白組。將脂質(zhì)體與miRNA充分混合于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，最終加入細(xì)胞孔后的miRNA濃度為50 nmol/L。轉(zhuǎn)染6 h后PBS清洗細(xì)胞，于常規(guī)培養(yǎng)液條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3CCK-8實(shí)驗(yàn) 將HK-2細(xì)胞以2000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔使用100μL培養(yǎng)液。按照前述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分組情況相同。分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)時(shí)每孔加入10 μLCCK-8溶液，搖勻后繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。以加入相同量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有細(xì)胞的孔作為校正參考。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞周期差異將HK-2細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染方法及分組同前。轉(zhuǎn)染后72 h用胰酶將各孔細(xì)胞消化下來，轉(zhuǎn)移到離心管中。1000 rpm離心5min，去除上清培養(yǎng)液，以預(yù)冷PBS清洗后再次離心，每管加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃固定12 h。再次清洗離心后去除上清液，每管加入碘化丙啶和RNA酶混合液混勻，37℃避光溫浴30min，后于流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光。使用流式儀自帶軟件分析DNA含量。

1.2.5Wes ternblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后cyclin D1蛋白表達(dá)情況 6孔板接種HK-2細(xì)胞，分組及轉(zhuǎn)染方式同前。轉(zhuǎn)染后48 h，使用RIPA裂解細(xì)胞，離心后移除上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書配好分離膠及濃縮膠。將測(cè)好濃度的蛋白與上樣緩沖液混合后煮沸變性5 min，以每孔道20μg蛋白于12%SDS-PAGE凝膠中電泳。電泳條件為60 V恒壓下30min，后100 V恒壓下至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為350mA 2 h。封閉液在室溫下對(duì)PVDF膜封閉1 h，洗膜后加入cyclin D1抗體或β-actin抗體，4℃震蕩搖勻過夜。洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體室溫孵育2 h，再次洗膜后加入ECL試劑，在Bio-Rad凝膠成像儀下檢測(cè)發(fā)光情況。用Quantity-one軟件進(jìn)行灰度分析，與內(nèi)參（β-actin）的發(fā)光情況比較，得出cyclin D1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)查找Targetscan、DIANA microT等網(wǎng)站，明確cyclin D1能與miR-20a-5p相結(jié)合的3'UTR，設(shè)計(jì)引物，內(nèi)含Spe I及Mlu I酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收得目的片段。上游引物為5'-GGACTAGTCTGTTGTAAGAATAGGCATTAA-3'，下游引物為5'-CGACGCGTTCATCCTGGCAATGTGAGAAT-3'。設(shè)計(jì)合成一對(duì)與miR-20a-5p完全互補(bǔ)的引物，內(nèi)含有Spe I及Mlu I酶切位點(diǎn)，經(jīng)過退火程序后得到陽(yáng)性片段。上游引物為5'-GGACTAGTCTACCTGCACTATAAGCACTTTA-3'，下游引物為5'-CGACGCGTTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3'。將上述兩種片段分別行純化、雙酶切后連接入pMIRREPORT熒光素酶載體。將載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒后將雙酶切正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，最終得到含有3'UTR的熒光素酶報(bào)告基因和含有陽(yáng)性序列的熒光素酶報(bào)告基因。

轉(zhuǎn)染前將293T細(xì)胞以4×105個(gè)/孔接種于24孔板，將熒光素酶報(bào)告基因、海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL-TK、miRNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行雙熒光檢測(cè)，用PLB裂解液裂解細(xì)胞，然后加入LAR II，于發(fā)光儀檢測(cè)得到熒光值M1。加入Stop&Glo檢測(cè)液，啟動(dòng)海腎熒光素酶檢測(cè)反應(yīng)，測(cè)得熒光值為M2，以M1/M2的值表示報(bào)告基因的熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多組資料比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD法，兩組資料比較使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CCK-8法檢測(cè)m iR-20a-5p對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后24 h，miR-20a-5p組、對(duì)照組、空白組的吸光度值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染后48～120 h，三組吸光度值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-20a-5p組的吸光度值均低于另外兩組（P＜0.05），而另外兩組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1），miR-20a-5p在轉(zhuǎn)染后48～120 h抑制了HK-2的細(xì)胞增殖（圖1）。

表1　轉(zhuǎn)染后48～120 h各組細(xì)胞吸光度值比較（±s）

表1　轉(zhuǎn)染后48～120 h各組細(xì)胞吸光度值比較（±s）

組別　各時(shí)間點(diǎn)吸光度值24 h　48 h　72 h　96 h　120 h miR-20a-5p組對(duì)照組空白組F值P值0.41±0.02 0.39±0.04 0.40±0.03 0.571 ＞0.05 0.55±0.04 0.80±0.07 0.75±0.04 31.200 ＜0.05 0.81±0.02 1.10±0.06 1.06±0.03 67.966 ＜0.05 1.17±0.03 1.74±0.04 1.69±0.07 186.598 ＜0.05 1.61±0.06 1.96±0.06 2.02±0.04 85.806 ＜0.05

2.2流式細(xì)胞術(shù)揭示m iR-20a-5p對(duì)細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染后72 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞處于G1期的比例具有差異，miR-20a-5p組、對(duì)照組、空白組的G1期細(xì)胞比例分別為（63.89±3.61）%、（44.18± 4.04）%、（46.08±2.49）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.988，P＜0.05）。miR-20a-5p組的G1期比例高于另外兩組（P＜0.05），而另外兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明miR-20a-5p能使HK-2細(xì)胞阻滯于G1期。

圖1　m iR-20a-5p組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48～120 h的吸光度值低于對(duì)照組和空白組

2.3Western blot發(fā)現(xiàn)m iR-20a-5p抑制cylcin D1的蛋白表達(dá)

使用β-actin作為內(nèi)參蛋白，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后48 h，miR-20a-5p抑制了cyclin D1蛋白的表達(dá)。miR-20a-5p組、對(duì)照組、空白組的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.12±0.03）、（0.50±0.16）、（0.46±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.280，P＜0.05）。miR-20a-5p組的蛋白相對(duì)表達(dá)量低于另外兩組（P＜0.05），另外兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2　m iR-20a-5p在轉(zhuǎn)染后48 h抑制cyclin D1的蛋白表達(dá)

2.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)揭示m iR-20a-5p與cyclin D1信使RNA3’UTR的結(jié)合作用

設(shè)計(jì)與miR-20a-5p完全互補(bǔ)結(jié)合的陽(yáng)性片段，構(gòu)建含有陽(yáng)性片段的熒光素酶報(bào)告基因（陽(yáng)性載體），同時(shí)將含有miR-20a-5p結(jié)合序列的cyclin D1的3'UTR構(gòu)建為熒光素酶報(bào)告基因。每次轉(zhuǎn)染時(shí)均使用海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染，以其熒光值作為內(nèi)參校正。

miR-20a-5p、陰性對(duì)照miRNA分別與cyclin D1報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染，miR-20a-5p組的相對(duì)熒光素酶活性低于另一組，兩組的相對(duì)熒光素酶活性分別為（125.46±10.29）、（355.33±30.74），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-12.283，P＜0.05）（圖3）。miR-20a-5p、陰性對(duì)照miRNA分別與陽(yáng)性載體共轉(zhuǎn)染時(shí)，miR-20a-5p組的相對(duì)熒光素酶活性也低于對(duì)照組，兩組的相對(duì)熒光素酶活性分別為（57.34±5.38）、（339.99±17.56），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-26.655，P＜0.05）（圖3）。由于陽(yáng)性片段能與miR-20a-5p完全結(jié)合，且兩者共轉(zhuǎn)染時(shí)熒光素酶活性低于對(duì)照miRNA，說明miR-20a-5p與熒光素酶報(bào)告基因結(jié)合可以抑制其熒光素酶活性。所以，miR-20a-5p能抑制cyclin D1報(bào)告基因的熒光素酶活性，說明其與cyclin D1的3'UTR可以直接結(jié)合。結(jié)果表明，cyclin D1是miR-20a-5p的直接靶基因。

圖3　m iR-20a-5p能抑制陽(yáng)性片段載體及cyclin D1報(bào)告基因的熒光素酶活性（*P＜0.05）

3　討論

在臨床實(shí)踐中，AKI的病因主要有缺血、心臟大手術(shù)、藥物損害、膿毒癥［8-10］。AKI的病理生理過程較為復(fù)雜，包括腎臟灌注壓下降、腎小球?yàn)V過率（GFR）下降、微循環(huán)障礙、內(nèi)皮細(xì)胞損傷等，但如果病因不能去除的話，AKI最終會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的損傷、壞死或凋亡［11-13］。目前有研究提示發(fā)生AKI時(shí)，正常的處于靜止期的上皮細(xì)胞可重新進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行分裂增殖，而非一些干細(xì)胞重新增殖分化成新的細(xì)胞［14，15］。從此機(jī)制來看，腎小管細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期增殖，對(duì)AKI的恢復(fù)具有治療意義。但近來的一些研究對(duì)這一看法提出了挑戰(zhàn)。Pabla等［16］在順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4/6（CDK4/6）明顯激活，CDK6表達(dá)增加；CDK6抑制劑palbociclib和ribociclib能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，但同時(shí)減輕AKI，改善AKI小鼠的生存預(yù)后。CDK抑制因子p21能與幾乎所有的Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，包括cyclin D-CDK4/6、cylin E-CDK2，過表達(dá)p21能抑制他們的活性，造成細(xì)胞周期阻滯在G1期。Price等［17］發(fā)現(xiàn)敲除p21基因的AKI小鼠其形態(tài)學(xué)損傷更嚴(yán)重，AKI病情進(jìn)展更迅速，死亡率更高。抑制細(xì)胞周期能改善AKI的具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

微小RNA（miRNA）是一種22個(gè)核苷酸左右的小RNA，其不具有翻譯功能，而是調(diào)控信使RNA的翻譯。miRNA與信使RNA的3'端非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，依靠一些酶類造成信使RNA降解或抑制其翻譯成蛋白質(zhì)［18-20］。miRNA在很多疾病中的表達(dá)發(fā)生變化，異常表達(dá)的miRNA通過調(diào)控不同的靶基因?qū)膊〉陌l(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。本研究將miR-20a-5p轉(zhuǎn)染入正常人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后2～5 d，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。隨后我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p使細(xì)胞處于G1期的比例明顯增加。說明miR-20a-5p通過細(xì)胞阻滯于G1期來抑制HK-2的生長(zhǎng)。為了探討其中的機(jī)制，我們查找Targetscan、DIANAmicroT等靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)cyclin D1是miR-20a-5p的潛在靶基因。我們使用Western blot證實(shí)miR-20a-5p可以抑制cyclin D1的蛋白表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-20a-5p能直接與cyclin D1的3'UTR相結(jié)合。說明miR-20a-5p能與cyclin D1的mRNA直接結(jié)合，cyclin D1是miR-20a-5p的靶基因。

cyclin D1受到生長(zhǎng)因子刺激在G1期早期就開始合成，其與CDK4/6結(jié)合，激活它們的活性，進(jìn)而磷酸化Rb蛋白，磷酸化的Rb蛋白能使轉(zhuǎn)錄因子E2F釋放出來，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期［21，22］。cyclin D1對(duì)細(xì)胞周期存在正向推動(dòng)作用，本研究證實(shí)miR-20a-5p能在腎小管細(xì)胞中抑制cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)展。因此我們的研究為miR-20a-5p在AKI治療中的應(yīng)用前景提供了一定依據(jù)，當(dāng)然，這還需進(jìn)一步深入研究。另外Wang等［23］發(fā)現(xiàn)在缺血所致AKI小鼠模型中，miR-20a-5p在發(fā)生AKI的腎臟中表達(dá)下降，并能影響腎小管細(xì)胞的自噬。Zhou等［24］發(fā)現(xiàn)在大鼠發(fā)生AKI時(shí)，其腎臟中cyclin D1的表達(dá)是上升的。我們的研究說明cyclin D1是miR-20a-5p的靶基因，所以cyclin D1過表達(dá)可能與miR-20a-5p的低表達(dá)相關(guān)，提示miR-20a-5p 與cyclin D1對(duì)AKI的進(jìn)展具有一定的作用。

綜上所述，miR-20a-5p能將腎小管上皮細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞的增殖復(fù)制。其機(jī)制為miR-20a-5p抑制cyclin D1表達(dá)，而cyclin D1被證實(shí)為miR-20a-5p的直接靶基因。

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miR-20a-5p inhibits proliferation of renal tubular epithelial cells by targeting cyclin D1

GONG FangxiaoSUN RenhuaXU YunxiangHU Bangchuan
Department of Intensive Care Unit，Zhejiang Provincial People's Hospital，Hangzhou310014，China

R737.11

A

1673-9701（2016）20-0001-05

浙江省科學(xué)技術(shù)廳省級(jí)重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

（2011R50018-09）

2016-04-06）