電子自旋共振技術鑒別輻照茶葉

費 晨葉馨今張海偉梁 進鄭文佳

1（安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院 合肥 230036）2（貴州省茶葉科學研究所 貴陽 550000）

電子自旋共振技術鑒別輻照茶葉

費 晨1葉馨今1張海偉1梁 進1鄭文佳2

1（安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院 合肥 230036）2（貴州省茶葉科學研究所 貴陽 550000）

研究黃山毛峰和祁門紅茶經(jīng)Co-60 γ射線輻照誘導的電子自旋共振（Electron spin resonance， ESR）波譜特征，以及吸收劑量、貯藏時間與茶葉中自由基ESR信號強度的關系，考察利用ESR技術鑒別輻照茶葉的可行性。結果顯示，低吸收劑量能顯著增加茶葉中 ESR信號強度（p＜0.01）；茶葉中自由基的信號強度隨吸收劑量呈多項式關系增長，與貯藏時間呈乘冪函數(shù)關系下降；在常溫貯藏70 d后，信號強度逐漸穩(wěn)定，但依然顯著高于未輻照樣品的信號強度（p＜0.01），據(jù)此表明，使用ESR法可以鑒別輻照與非輻照的茶葉。

電子自旋共振，輻照，自由基，茶葉，檢測

茶葉作為一種傳統(tǒng)的健康飲品，是世界范圍內最受歡迎的飲料之一［1］。但是茶葉在生產(chǎn)加工、運輸及貯藏過程中易被微生物污染或陳化變質，影響茶葉的營養(yǎng)成分和感官品質，使茶葉失去應有的商品價值，造成巨大的經(jīng)濟損失［2］。

食品輻照技術作為安全高效的物理加工方法在茶葉中已經(jīng)達到商業(yè)化應用要求，能殺滅茶葉在生產(chǎn)加工過程中遭受的微生物污染，延長貨架期，降低茶葉的質量安全風險［3-4］。另有研究報道，輻照技術應用于茶葉能夠提高茶葉內含物含量，改善茶葉品質；還能夠顯著降解茶葉中的擬除蟲菊酯等農藥殘留［5］。

隨著國內外茶葉貿易的日益繁盛，以及輻照茶葉商業(yè)化的不斷發(fā)展，為保證輻照茶葉的質量，打破“技術性”貿易壁壘及滿足消費者的知情權，鑒別輻照茶葉的方法研究與相關法規(guī)的制定變得至關重要。

我國僅制定了茶葉輻照殺菌工藝的行業(yè)標準（NY/T1206-2006），鑒別輻照茶葉尚無標準可依［6］。歐盟已經(jīng)批準10項輻照食品的鑒定方法標準，包括熱釋光（Thermolum inescence， TL）法、電子自旋共振（Electron spin resonance， ESR）法、氣相色譜（Gas chromatography， GC）分析法等，這些檢測方法已在國際貿易中普遍使用［7-9］。其中 ESR法作為快速有效檢測輻照食品的方法已越來越多地被世界各國廣泛使用［10］。

ESR檢測方法的原理是食品經(jīng)過電離輻射后，其物質分子受到電離或激發(fā)形成一定數(shù)量的自由基，由于自由基含有未成對電子，具有自旋角動量，能夠產(chǎn)生磁性和自旋磁矩，當用ESR譜儀檢測時自由基將會產(chǎn)生電子自旋共振現(xiàn)象［11］。一般ESR信號強度與吸收劑量呈正相關，因此，可以通過對吸收圖譜的定量分析獲得自由基濃度的相關信息，從而來推斷可能的吸收劑量［12］。此方法現(xiàn)已被廣泛應用于檢測蔬菜、水果、菌菇以及肉類等輻照食品［13-15］，但在輻照茶葉的鑒別分析研究較少。

茶葉是一種富含黃酮類化合物的天然飲品，具有一定清除自由基的能力，但在接受輻照后，依然能產(chǎn)生長壽命自由基［16-17］。本研究以綠茶（黃山毛峰）和紅茶（祁門紅茶）為原料，分析吸收劑量、貯藏時間與茶葉中ESR信號強度的相關性，以期為建立輻照茶葉ESR檢測方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

綠茶（黃山毛峰）與紅茶（祁門紅茶）茶葉樣品由安徽農業(yè)大學茶葉系提供，未經(jīng)輻照處理。

1.2儀器與設備

Co-60 γ射線輻照源（活度 1.0×1016Bq），安徽省農科院輻照中心；JES-FA200型ESR波譜儀，日本電子株式會社；BZF50 型電熱真空干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SQ2119C型多功能食品加工機，上海帥佳電子科技有限公司；80目標準檢驗篩，浙江上虞市公路儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1輻照處理

將綠茶與紅茶分別用聚乙烯自封袋包裝，每個劑量設3個重復。根據(jù)茶葉輻照殺菌工藝農業(yè)行業(yè)標準（NY/T 1206-2006），設定綠茶與紅茶的吸收劑量分別為0、0.5、1、3、5 kGy和0、1、3、5、9 kGy，劑量率均為0.5 kGy/h［6］。

1.3.2樣品處理

受照后的茶葉樣品用多功能食品加工機粉碎，過80目篩，分別收集到自封袋中。于電熱干燥箱中40 ℃干燥處理4 h。室溫下過夜后，樣品分別裝入內徑為3.5 mm的ESR管中，緊密堆積至20 mm高度（約0.1 g），待ESR波譜測定。每樣品每劑量重復測定3次。

1.3.3ESR檢測

ESR波譜儀測定參數(shù)：中心磁場為323.5 m T；掃場寬度為20 m T；微波輻射頻率為9.054 GHz；微波功率為0.998 mW；信號通道調制頻率100 kHz；微波調制幅度（Modulation amplitude， MA） 0.1 m T；掃描時間為60 s；溫度為室溫。

2 結果與分析

2.1輻照前后茶葉的ESR波譜特征

食品中的自由基信號可能來源于纖維素自由基，糖基自由基以及M n2+等金屬離子。茶葉含有豐富的化學物質，自由基的種類豐富，ESR所測的自由基為茶葉中各種自由基總和的信號強度。輻照處理后，植物樣品中的纖維素和多糖等物質在射線作用下能誘導產(chǎn)生長壽自由基。這些自由基中含有未成對電子，具有凈電子自旋角動量，在外加磁場作用下會產(chǎn)生自旋共振吸收現(xiàn)象［18］，因此，可用ESR波譜技術測定。ESR信號強度反映的是共振條件下樣品所吸收的總能量［19］，樣品中自由基含量越大，信號強度越大。從圖1可知，未輻照的綠茶與紅茶樣品在中心磁場區(qū)域（g=2.005±0.001，其中g因子表征磁場共振的位置）均出現(xiàn)了弱的共振吸收峰，說明未輻照的茶葉樣品中含有一定量的自由基。較低劑量輻照處理，如照射綠茶與紅茶至吸收劑量分別為0.5 kGy和1 kGy后，在相同的中心磁場區(qū)域共振吸收峰的振幅顯著增大，說明高能γ射線誘導茶葉機體產(chǎn)生了相對長壽命的自由基。ESR波譜圖中的g值反映的是不成對電子所在分子的特征量，即所測樣品中自由基的特征值。輻照前后檢測到綠茶與紅茶中自由基的g值都沒有發(fā)生變化，表明茶葉中自由基的主要類型并未發(fā)生變化。

使用ESR波譜技術檢測花椒、孜然和核桃等富含纖維素的輻照樣品時，在中心信號附近會出現(xiàn) 2個磁場寬度約為0.006 T相對微弱的對稱峰［19-20］。這2個小峰是輻照誘導產(chǎn)生的纖維素自由基在磁場作用下產(chǎn)生的共振吸收峰。根據(jù)EN 1787-2000和NY/T 2211-2012，纖維素自由基特征峰是權威機構使用 ESR方法鑒定某些農產(chǎn)品是否經(jīng)過輻照的重要依據(jù)之一［21］。如圖2所示，利用ESR光譜檢測輻照綠茶葉和紅茶葉，在中心特征峰的附近未出現(xiàn) 2個對稱小峰，即未檢測到纖維素自由基信號。這與Jae等［7］和 Sem ra 等［22］的研究結果相似，輻照處理僅使非特異性中心特征峰信號強度顯著增加，但未發(fā)現(xiàn)不同于非受照樣品的特征峰。這對利用纖維素自由基峰信號鑒定輻照茶葉帶來了困難，因為在貯藏期間，中心特征峰信號強度通常以非?？斓乃俣冗M行衰變。

2.2茶葉ESR信號強度與吸收劑量相關性

當物質受到電離激發(fā)時處于上下兩能級的電子發(fā)生受激躍遷，有一部分低能級的電子吸收電磁波能量躍遷到高能級，故輻射誘發(fā)的順磁性物質產(chǎn)額與吸收劑量是直接相關的［23］。為進一步研究茶葉的ESR信號強度與吸收劑量之間的關系，在同一劑量率條件下對樣品分別進行梯度劑量的輻照處理，實驗結果如圖3所示。不同吸收劑量的茶葉樣品在同一磁場位置均出現(xiàn)了特征吸收峰，隨著吸收劑量的增加，樣品的自由基信號強度也呈顯著性增加（p＜0.05）。

吸收劑量分別為0.5、1、3、5 kGy和1、3、5、9 kGy的綠茶和紅茶樣品用來構建劑量-ESR信號響應曲線。茶葉樣品的ESR信號強度隨著吸收劑量的變化趨勢見圖4。由圖4可見，茶葉中自由基含量與吸收劑量之間呈顯著正相關關系。一般輻照樣品中自由基信號強度y與吸收劑量x之間呈線性或多項式關系［24］，本研究擬合受照綠茶與受照紅茶的劑量-信號響應方程見表1。曲線擬合所得的線性方程與多項式方程的相關系數(shù)均在0.95以上。多項式方程的相關系數(shù)高于線性方程的相關系數(shù)，說明茶葉 ESR信號強度與吸收劑量之間的關系更符合多項式曲線的變化趨勢。

表1 ESR信號強度與吸收劑量擬合曲線的方程參數(shù)與相關系數(shù)Table 1 Equation parameters and correlation coefficients of ESR signal intensity and absorbed doses fitting curves

由圖4還可見，吸收劑量在較小范圍內，劑量與ESR信號強度有良好的線性關系，隨著吸收劑量的增大，信號強度的增大趨勢逐漸變緩，偏離線性范圍。這可能是因為高劑量的輻照誘導產(chǎn)生的短壽命自由基比例相對較高，這個結果與Sem ra等［22］、Polat等［24］和Ukai等［25］的研究結果一致。因此，在一定吸收劑量范圍內，可以通過 ESR 信號強度初步估算出吸收劑量，但在實際應用中 ESR的信號強度會隨著貯藏時間而逐漸下降，而且還會受到諸如環(huán)境濕度、溫度等影響。因此，為得到更準確的劑量-ESR信號效應關系，還需要對ESR 信號強度隨貯藏時間的變化規(guī)律進行進一步研究。

2.3茶葉ESR信號強度與貯藏時間相關性

食品輻照處理后產(chǎn)生的部分自由基會通過相互反應（耦合）而消失，因此，貯藏時間是影響ESR信號強度變化的重要因素，需要研究輻照產(chǎn)生的自由基隨時間衰減的變化規(guī)律［26］。根據(jù)胡芳芳等［27］對奶粉、面粉、干辣椒和大米等輻照食品的自由基研究可知，γ射線輻照產(chǎn)生的自由基在受照后隨時間的衰變規(guī)律符合乘冪公式。本研究對輻照茶葉自由基信號強度與貯藏時間之間的關系進行了乘冪曲線擬合，得到吸收劑量3 kGy綠茶ESR信號與貯藏時間的擬合方程為y=31 135x-0.296，相關系數(shù)R2為 0.969；吸收劑量為 5 kGy綠茶的擬合方程為y=38501x-0.297，相關系數(shù)R2=0.993；吸收劑量3 kGy紅茶的擬合方程為y = 33 894x-0.333，相關系數(shù)R2為0.978；吸收劑量 5 kGy紅茶的擬合方程為y=45263x-0.360，相關系數(shù)R2為0.995。以上擬合曲線的相關系數(shù)均在0.96以上，說明輻照茶葉的ESR信號強度隨貯藏時間的變化趨勢與乘冪函數(shù)的曲線類似。

圖5是以茶葉樣品的ESR檢測譜圖的信號強度為縱坐標，貯藏時間為橫坐標，根據(jù)乘冪函數(shù)方程擬合得到的曲線。在貯存時間的前20 d，兩種吸收劑量的紅茶和綠茶的自由基含量都急劇下降，吸收劑量3 kGy的綠茶與紅茶中的自由基含量分別降低了44.3%和46.1%；吸收劑量5 kGy的綠茶與紅茶中的自由基含量分別降低了 46.8%和54.5%。70 d后，吸收劑量3 kGy和5 kGy的綠茶與紅茶中的自由基含量減少均超過了70%，但所有輻照茶葉的自由基信號強度均顯著高于未輻照茶葉的信號強度（p＜0.01）。這與Polat等［24］利用 ESR技術對紅茶和Rooibos茶的研究以及Ukai等［25］對輻照胡椒粉中自由基含量的衰減變化是類似的。通過研究輻照茶葉信號強度與貯藏時間的關系，可以對已建立起的信號強度與吸收劑量的擬合曲線進行修正，從而對吸收劑量的追溯鑒定有著重要的意義。

3 結論

通過 ESR檢測可知輻照前后的茶葉自由基信號有顯著差異（p＜0.01）；輻照茶葉中自由基的信號強度隨吸收劑量成多項式關系增長；輻照茶葉的自由基信號與貯藏時間成乘冪函數(shù)關系，隨著貯藏時間延長而降低至信號穩(wěn)定，但依然顯著高于未受照樣品的自由基信號強度（p＜0.01）。本研究表明，可以使用ESR法鑒別茶葉是否經(jīng)過輻照處理。ESR法輻照茶葉的初始吸收劑量的推斷、輻照茶葉中是否存在纖維素自由基以及是否可以通過纖維素自由基的特征峰定性定量的鑒別檢測輻照茶葉則需要進一步的實驗研究。

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Identification of irradiated tea by ESR spectroscopy

FEI Chen1YE Xinjin1ZHANG Haiwei1LIANG Jin1ZHENG Wenjia2
1(School of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Heifei 230036, China)2(Guizhou Tea Science Research Laboratory, Guiyang 550000, China)

In order to explore the possibility to identify the irradiated tea by electron spin resonance （ESR），green tea （Huangshan Maofeng Tea） and black tea （Keemun Black Tea） were detected by ESR after irradiation with Co-60 γ-rays. The relations between ESR intensity of the tea samples and absorbed doses as well as storage time were analyzed. It turned out that there was a significant increase of free radicals intensity in all tea samples at low absorbed doses （p＜0.01）. The relations between the tea ESR intensity and absorbed doses fitted the multinomial grow th while the relations between the tea ESR intensity and storage time fitted the power correlation decrease. After storage at room temperature for 70 d， the ESR intensity in irradiated tea decreased to the steady state which was still significantly higher than that in unirradiated tea samples （p＜0.01）. Therefore， it is possible to use ESR to identify whether the green or black tea was irradiated or not.

Electron spin resonance （ESR）， Irradiation， Free radicals， Tea， Detection

CLC TS205， TL99

FEI Chen （female） was born in September 1989 and graduated from Anhui Agricultural University with bachelor degree in 2012. Now she is a master candidate in agricultural product processing and storage of irradiation. E-mail: vyvyanni@163.com

24 November 2015； accepted 17 December 2015

Ph.D. ZHANG Haiwei， lecturer， E-mail: zhanghaiwei@ahau.edu.cn

TS205，TL99

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.030401

安徽省教育廳科研項目［高校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目（2013SQRL017ZD）和貴州省茶葉加工科技創(chuàng)新人才

團隊項目（黔科合人才團隊［2014］4025號）資助

費晨，女，1989年9月出生，2012年畢業(yè)于安徽農業(yè)大學，目前為該校在讀碩士研究生，農產(chǎn)品輻照加工貯藏方向，E-mail: vyvyanni@163.com

張海偉，博士，講師，E-mail: zhanghaiwei@ahau.edu.cn

2015-11-24；修回2015-12-17

Supported by Scientific Research Project of Anhui Province Department of Education （the Provincial Level of Key Projects Fund

with the Outstanding Young Talents in Universities and Colleges， 2013SQRL017ZD） and Project of Guizhou Province Tea

Processing Technology Innovation Talents Team （Guizhou Branch Talent Team No. ［2014］4025）