殼寡糖對(duì)紅鰭東方鲀血液指標(biāo)和非特異性免疫指標(biāo)的影響

蘇鵬，潘金露，韓雨哲，劉海映，霍圃宇，孫航，姜志強(qiáng)（大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

殼寡糖對(duì)紅鰭東方鲀血液指標(biāo)和非特異性免疫指標(biāo)的影響

蘇鵬，潘金露，韓雨哲，劉海映，霍圃宇，孫航，姜志強(qiáng)
（大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

為研究殼寡糖 （chitosan-oligosaccbarides，COS）對(duì)紅鰭東方鲀Takifugu rubripes血清和血液生化指標(biāo)及非特異性免疫指標(biāo)的影響，選用體質(zhì)量為 （129.2±3.1）g的紅鰭東方鲀600尾，隨機(jī)分為C0、C1、C2、C3 4組，每組設(shè)3個(gè)平行，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、500、1000、2000 mg/kg的殼寡糖，經(jīng)56 d飼養(yǎng)后，測(cè)定其血液指標(biāo)、抗氧化酶活性及其攻毒耐受性。結(jié)果表明：飼料中添加殼寡糖能顯著提高血清中堿性磷酸酶、溶菌酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活力和全血中血小板數(shù)量 （P＜0.05），各項(xiàng)指標(biāo)隨殼寡糖添加量的增加整體呈升高趨勢(shì)；飼料中添加殼寡糖能顯著提高紅鰭東方鲀肝臟組織中過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活力 （P＜0.05），顯著降低丙二醛含量（P＜0.05）；殼寡糖能明顯提高紅鰭東方鲀對(duì)遲緩愛德華氏菌和哈維弧菌的抵抗力。研究表明，在本試驗(yàn)條件下，飼料中添加2000 mg/kg殼寡糖能夠提高紅鰭東方鲀的非特異性免疫功能。

紅鰭東方鲀；殼寡糖；血清生化指標(biāo)；非特異性免疫

殼寡糖 （chitosan-oligosaccbarides，COS）由殼聚糖降解獲得，是由2～10個(gè)氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖，殼寡糖具有比殼聚糖水溶性高、黏度低等物理特性，還表現(xiàn)出比殼聚糖更高的抗菌、抗炎、免疫增強(qiáng)等生理活性［1-2］。目前，關(guān)于殼寡糖在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用研究主要集中在鯉Cyprinus carpio［3］、牙鲆Paralichthys olivaceus［4］、大黃魚Pseudosciaena crocea［5］、吉富羅非魚 Oreochromis niloticus［6-7］、大菱鲆 Scophthalmus maximus［8-9］、錦鯉 Cyprinus carpio koi［10］、虹鱒 oncorhynchus mykiss［11］、斑節(jié)對(duì)蝦 Penaeus mondon［12］等水產(chǎn)動(dòng)物中，研究結(jié)果表明，在飼料中添加適量的殼寡糖能夠發(fā)揮抗菌、抗炎等生物學(xué)功能，提高機(jī)體的免疫力，改善水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能［13］。

紅鰭東方鲀 Takifugu rubripes隸屬于鲀形目Telraodontiformes、鲀科 Teraodontoidae、東方鲀屬Takifugu。紅鰭東方鲀屬于河鲀魚中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的一個(gè)種類，養(yǎng)殖過程中多采用高密度集約化方式，由于養(yǎng)殖密度過大，常導(dǎo)致環(huán)境壓力過大，并由此導(dǎo)致魚體大范圍疾病的暴發(fā)；由于紅鰭東方鲀彼此間相互撕咬，易導(dǎo)致體表損傷，并引發(fā)感染，因此，如何提高其免疫力顯得尤為重要。魚類主要依賴非特異性免疫系統(tǒng)抵御外界病原體或細(xì)菌的侵襲［14］，有關(guān)殼寡糖等飼料添加劑在鲀屬中的應(yīng)用研究較少，Hua等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加殼聚糖可以增強(qiáng)暗紋東方鲀Takifugu obscurus的免疫力，且殼聚糖和益生菌混合后還可以顯著增強(qiáng)魚體的免疫力。但未見殼聚糖和殼寡糖對(duì)紅鰭東方鲀非特異性免疫影響的相關(guān)報(bào)道，紅鰭東方鲀和暗紋東方鲀均屬于鲀屬，推測(cè)添加殼寡糖可能會(huì)增強(qiáng)紅鰭東方鲀的免疫力。

本試驗(yàn)中，以紅鰭東方鲀?yōu)檠芯繉?duì)象，通過在飼料中添加不同水平的殼寡糖，研究殼寡糖對(duì)紅鰭東方鲀血液指標(biāo)和非特異性免疫酶指標(biāo)的影響，并找到適宜的飼料添加量，以期為開發(fā)紅鰭東方鲀免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)魚選用體質(zhì)量為 （129.2±3.1）g的紅鰭東方鲀。

殼寡糖由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供，其聚合度為2～8，脫乙酰度大于95%。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)飼料的制備 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的魚粉、14%的玉米胚芽粕、22.4%的豆粕、3.5%的啤酒酵母、1.4%的預(yù)混料混合均勻，過80目網(wǎng)篩，加入30%的鮮雜魚 （玉筋魚 Ammodytes personatus），混勻，通過飼料機(jī)制成直徑為4 mm的基礎(chǔ)顆粒飼料。經(jīng)測(cè)定，飼料的水分為29.3%，粗蛋白質(zhì)為42.55%，粗脂肪為11.96%，灰分為11.5%。在基礎(chǔ)飼料原料中分別添加含量為0（C0組，對(duì)照）、500 mg/kg（C1組）、1000 mg/kg （C2組）、2000 mg/kg（C3組）的殼寡糖 （COS），采用逐級(jí)混勻，制成的試驗(yàn)飼料于冰箱 （-20℃）中保存?zhèn)溆?。其中預(yù)混料中每千克飼料提供的維生素和微量元素為：維生素D30.25 mg，維生素A 12 mg，維生素K380 mg，維生素E 400 mg，維生素B120.4 mg，維生素B6240 mg，維生素B2200 mg，維生素B1100 mg，高穩(wěn)定 VC 40 mg，肌醇300 mg，泛酸鈣120 mg，葉酸8 mg，煙酸120 mg，鐵100 mg，錳50 mg，鋅30 mg，硒0.6 mg，銅20 mg，生物素1 mg。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理 將600尾試驗(yàn)魚隨機(jī)分為4組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放50尾魚，放養(yǎng)于大連大黑石天正養(yǎng)殖場(chǎng)中試車間的藍(lán)色塑料水槽內(nèi)靜水養(yǎng)殖，水體為2 m3。試驗(yàn)開始前用基礎(chǔ)顆粒飼料馴化3周，使試驗(yàn)魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)入正常攝食飼料狀態(tài)。3周后開始正式試驗(yàn)，投喂量為表觀飽食投喂，每天08：00、14：00各投喂1次，16：00換水1次，換水量為總水體的1/2，在換水期間需進(jìn)行吸底，同時(shí)收集糞便殘餌.試驗(yàn)期間，24 h充氣，水溫為 （17.0±2.0）℃，自然光照，試驗(yàn)時(shí)間為56 d。在此期間及時(shí)撈出死亡個(gè)體并記錄。

1.2.3樣品的制備 試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行血清生化指標(biāo)、全血常規(guī)和肝臟組織非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定。

全血的抽?。簭拿客半S機(jī)取5尾魚，使用一次性注射器 （1 mL）進(jìn)行靜脈抽血，抽血時(shí)針頭使用抗凝劑 （肝素鈉濃度為1600 IU/mL）潤(rùn)洗，并將全血分裝在2 mL的離心管中，于4℃下保存。

血清的制備：取一次性注射器，不使用抗凝劑，取出全血，4℃下靜置5 min，再以4000 r/min離心10 min，取上層血清，一管血清放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)至超低溫冰箱 （-80℃）中冷凍保存，以進(jìn)行酶活力的測(cè)定；另一管血清于冰箱中 （4℃）保存并于24 h內(nèi)完成血清生化指標(biāo)的測(cè)定。

肝臟組織樣品的制備：試驗(yàn)結(jié)束后停止投喂24 h，從各組隨機(jī)取5尾魚，于冰盤上進(jìn)行解剖，將肝臟樣品于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱（-80℃）中保存。從冰箱中取出肝臟樣品，剪碎后使用玻璃勻漿器冰上進(jìn)行研磨，在此過程中，加入4倍樣品重的生理鹽水，在4℃下以 10 000 r/min離心10 min，上清液置于冰箱 （4℃）中保存，并配制成20%的組織勻漿液用于酶活性的測(cè)定，24 h內(nèi)測(cè)定完畢。

1.2.4指標(biāo)的測(cè)定 血清中血糖 （GLU）、白球比（A/G）、總蛋白 （TP）、三酰甘油 （TG）、總膽固醇 （TCH）、低密度脂蛋白膽固醇 （LDL）、高密度脂蛋白膽固醇 （HDL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶 （AST）、堿性磷酸酶（AKP）指標(biāo)均用日立7180分析儀 （日本）測(cè)定，全血中平均血紅蛋白、平均血紅蛋白濃度、平均紅細(xì)胞體積、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞指標(biāo)均用西斯美康XE-2100D（日本）儀直接測(cè)得。

按照試劑盒 （購自南京建成）說明書進(jìn)行血清超氧化物歧化酶 （SOD）、溶菌酶 （LZM）、過氧化氫酶 （CAT）活力和肝臟 CAT、SOD活力、丙二醛 （MDA）含量的測(cè)定。用考馬斯亮蘭蛋白試劑盒進(jìn)行組織勻漿液蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

1.2.5攻毒試驗(yàn) 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)水槽隨機(jī)抽取5尾魚移到200 L藍(lán)色槽子中暫養(yǎng)5 d，待魚體適應(yīng)環(huán)境后，使用一次性注射器通過背部肌肉分別注射濃度為0.5×108cfu/mL的遲緩愛德華氏菌 （遲緩2CDM001，來自大連海洋大學(xué)細(xì)菌庫）和哈維弧菌 （哈維2SYX 002 H06091，來自大連海洋大學(xué)細(xì)菌庫）菌液0.5 mL/尾 （濃度為經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定的半數(shù)致死量），另設(shè)一組未注射任何菌的組為對(duì)照，觀察并記錄魚的狀態(tài)、死亡數(shù)量和死亡時(shí)間，試驗(yàn)期間不投喂，水溫為 （16±1）℃，24 h充氣。

1.3數(shù)據(jù)處理

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007軟件整理后，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （mean±S.D.）表示。用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析 （One-Way ANOVY），用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1各組紅鰭東方鲀血液指標(biāo)

從表1可見：飼料中添加殼寡糖，對(duì)紅鰭東方鲀血清中的血糖、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨基酸轉(zhuǎn)移酶、總蛋白、白蛋白和白球比的影響均未達(dá)到顯著性水平 （P＞0.05）；僅殼寡糖添加量為2000 mg/kg時(shí)，血清中堿性磷酸酶活力顯著升高 （P＜0.05）。

從表2可見：全血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積和平均血紅蛋白濃度各組間均無顯著性差異 （P＞0.05）；飼料中添加殼寡糖能顯著增加紅鰭東方鲀血小板數(shù)量 （P＜0.05）。

表1　飼料中不同殼寡糖水平對(duì)紅鰭東方鲀血清生化指標(biāo)的影響Tab.1 Effects of chitosan-oligosaccharides（COS）on the biochemical indices in serum of redfin puffer Takifugu rubripe

表2　飼料中不同殼寡糖水平對(duì)紅鰭東方鲀血液生化指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of COS on the biochemical parameters in blood of redfin puffer Takifugu rubripes

2.2各組紅鰭東方鲀血清非特異性免疫指標(biāo)

從表3可見：飼料中添加殼寡糖能顯著提高血清LZM、CAT、SOD活力，隨著殼寡糖添加量的增加，各組血清LZM、CAT活力均呈逐漸上升的趨勢(shì)，而SOD活力則呈先降低后升高的趨勢(shì)；殼寡糖添加組血清LZM活力均顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05），僅C3組血清 CAT活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），C1、C2組血清SOD活力顯著低于對(duì)照組 （P＜0.05），而C3組血清SOD活力則顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05）；血清LZM、CAT、SOD活力均在C3組達(dá)到最大值。

2.3各組紅鰭東方鲀肝臟SOD、CAT和MDA活力

從表4可見：飼料中添加殼寡糖能顯著影響肝臟CAT、SOD活力和MDA含量，隨著殼寡糖添加量的增加，各組肝臟CAT、SOD活力均呈逐漸上升的趨勢(shì)，而MDA含量則呈逐漸降低的趨勢(shì)；僅C3組肝臟CAT、SOD活力顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05），各殼寡糖添加組肝臟MDA含量均顯著低于對(duì)照組 （P＜0.05）；肝臟CAT、SOD活力均在C3組達(dá)到最大值，MDA含量在C3組達(dá)到最小值。

表3　飼料中不同殼寡糖水平對(duì)紅鰭東方鲀血清非特異性免疫酶活力的影響Tab.3 Effects of COS on the activities of non-specific immune enzymes in serum of redfin puffer Takifugu rubripes　U/mL

表4　飼料中不同殼寡糖水平對(duì)紅鰭東方鲀肝臟非特異性酶活力的影響Tab.4 Effects of COS on the activities of non-specific immune enzymes in liver of redfin puffer Takifugu rubripes

2.4兩種病原菌對(duì)紅鰭東方鲀的攻毒試驗(yàn)

圖1為注射哈維弧菌后各試驗(yàn)組紅鰭東方鲀累計(jì)死亡率統(tǒng)計(jì)圖，注射哈維弧菌后的前10 d，紅鰭東方鲀均無死亡，從第11天開始逐漸死亡，對(duì)照組 （C0）組在第13天時(shí)全部死亡，其余組魚在第14天時(shí)全部死亡，殼寡糖添加組魚的死亡率明顯低于對(duì)照組。

圖1 注射哈維弧菌對(duì)紅鰭東方鲀累計(jì)死亡率的影響Fig.1 Cumulative mortality of redfin puffer Takifugu rubripes fed diets containing different COS levels and challenged with Vibrio harveyi

圖2為注射遲緩愛德華氏菌后各試驗(yàn)組紅鰭東方鲀累計(jì)死亡率統(tǒng)計(jì)圖，注射遲緩愛德華氏菌的紅鰭東方鲀?cè)谇?0 d均無死亡，對(duì)照組魚在第12天時(shí)全部死亡，其余組魚在第13天時(shí)全部死亡 （C1 和C2組重疊），殼寡糖添加組魚的死亡率明顯低于對(duì)照組。

圖2　注射遲緩愛德華氏菌對(duì)紅鰭東方鲀累計(jì)死亡率的影響Fig.2 Cumulative mortality of redfin puffer Takifugu rubripes fed diets containing different COS levels and challenged with Edwardsiella tarda

3 討論

3.1殼寡糖對(duì)紅鰭東方鲀血清生化指標(biāo)的影響

血脂主要包括甘油三酯和膽固醇，還有少量的類脂、類固醇等，血液中膽固醇過高會(huì)引發(fā)高膽固醇血癥。殼寡糖能夠降低血清中血脂的含量，進(jìn)而改善脂類代謝。Luo等［16］研究表明，殼寡糖能夠降低虹鱒血液中皮質(zhì)醇水平，并顯著增強(qiáng)虹鱒體細(xì)胞的吞噬能力，更好地發(fā)揮出抗菌和抗應(yīng)激作用。孫立威等［6］研究表明，在飼料中添加殼寡糖能使吉富羅非魚幼魚血清TCH和LDL水平顯著下降，有利于魚體健康。血清中轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸代謝以及與蛋白質(zhì)、脂肪和糖三者相互轉(zhuǎn)化的過程中起著極其重要的作用，當(dāng)體內(nèi)肝功能發(fā)生障礙時(shí)，常表現(xiàn)出谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高［11］。血清中血糖含量可直接反映機(jī)體的營養(yǎng)狀況，當(dāng)血清中血糖含量較高時(shí)，魚類積極攝食，故血清生化指標(biāo)的變化可作為評(píng)價(jià)魚體健康狀況的依據(jù)。劉含亮等［11］研究表明，飼料中添加殼寡糖可顯著增強(qiáng)虹鱒血清中白蛋白、總蛋白和球蛋白水平，增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)，以及虹鱒的增重率和蛋白質(zhì)效率，提高魚體的免疫能力。

本研究中探討了不同殼寡糖添加水平對(duì)紅鰭東方鲀血清生化指標(biāo)影響，結(jié)果顯示，殼寡糖添加組紅鰭東方鲀血清中總蛋白、白蛋白含量略有提高，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨基酸轉(zhuǎn)移酶活性略有降低，說明殼寡糖可能提高了飼料蛋白質(zhì)在體內(nèi)的沉積，在一定程度上也反映了紅鰭東方鲀的健康水平。C2和C3組血清中膽固醇較對(duì)照組有降低趨勢(shì)，說明殼寡糖的添加可能加速血脂在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽汁酸，減少了血脂膽固醇量，進(jìn)而降低血脂。

3.2殼寡糖對(duì)紅鰭東方鲀?nèi)褐笜?biāo)的影響

全血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等是血液中重要的免疫細(xì)胞，在細(xì)胞免疫中，血液的白細(xì)胞能夠治愈傷病的損傷，提高抗御病原體入侵的能力，且具有吞噬異物并產(chǎn)生抗體的作用。Lin等［10］研究表明，飼料中添加2 g/kg殼寡糖可顯著增加血清中的總白細(xì)胞數(shù)量。紅細(xì)胞和血紅蛋白負(fù)責(zé)體內(nèi)的氧氣運(yùn)輸，再從各部位運(yùn)送出代謝產(chǎn)物二氧化碳。血小板的主要功能是凝血和止血，修補(bǔ)破損的血管。本研究結(jié)果表明，不同殼寡糖添加水平提高了紅鰭東方鲀?nèi)邪准?xì)胞數(shù)量，且顯著提高了血小板數(shù)量，說明在飼料中添加殼寡糖可提高紅鰭東方鲀的免疫力，發(fā)揮抗菌、抗炎等生物特性。

3.3殼寡糖對(duì)紅鰭東方鲀血清 LZM、SOD、AKP酶活力的影響

魚類作為低等的脊椎動(dòng)物，非特異性免疫防御是抵抗病原最重要的屏障，除皮膚、黏膜外，還主要包括非特異性免疫酶如LZM、SOD等［15］。LZM是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，它可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，使細(xì)菌細(xì)胞壁松弛而失去對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的保護(hù)作用，最終使細(xì)菌破解死亡，LZM也是魚類非特異性免疫的重要組成部分［16］，其活性直接關(guān)系到魚體的免疫狀態(tài)。Cha等［4］用添加1%殼寡糖的飼料喂養(yǎng)牙鲆Palichthy olivaceus，10周后，牙鲆的LZM、髓過氧化物酶等免疫功能與對(duì)照組相比有顯著增強(qiáng)。劉含亮等［11］、Lin等［10］對(duì)虹鱒和鯉的研究結(jié)果相似，在飼料中添加殼寡糖可顯著增強(qiáng)血清的LZM活性。本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果類似，飼料中添加殼寡糖后，紅鰭東方鲀血清中LZM活力顯著高于對(duì)照組，LZM活力最大組相對(duì)于對(duì)照組提高了83.1%，顯著提高了魚體的非特異性免疫能力?？赡苁且?yàn)闅す烟堑幕钚猿煞挚梢源龠M(jìn)有益菌的增值，而有益菌可以激活巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，進(jìn)而促進(jìn)分泌溶菌酶的能力，使其在血清中的濃度增加，提高了機(jī)體的抗體水平［17］。

SOD是一種能夠通過歧化反應(yīng)催化超氧化物，將超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶。SOD是一種重要的抗氧化劑，可保護(hù)暴露于氧氣中的細(xì)胞，在抗衰老、抗炎癥方面起著非常重要的作用，能顯著提高機(jī)體免疫功能［18］。盧明淼等［19］、沈錦玉等［20］在分別對(duì)草魚和中華絨螯蟹的研究中發(fā)現(xiàn)，添加殼寡糖可增強(qiáng)血清中SOD活性，進(jìn)而增加魚體免疫力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加2000 mg/kg殼寡糖組，紅鰭東方鲀血清中SOD活力顯著高于對(duì)照組，較對(duì)照組提高了17%，說明一定量的殼寡糖能提高紅鰭東方鲀血清中SOD活力，增強(qiáng)魚體對(duì)炎癥的抵抗力。

AKP是一種磷酸單酯酶，在生物體內(nèi)可催化磷酸單酯及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，并直接參與磷的代謝，維持體內(nèi)適宜的鈣磷比例，與RNA、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等的代謝有關(guān)［21-22］。AKP對(duì)磷酸鈣的沉積、鈣質(zhì)的吸取和骨骼的形成均發(fā)揮著非常重要的作用，它是集體防御過氧化損傷系統(tǒng)和有機(jī)磷代謝的關(guān)鍵酶，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［23］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加2000 mg/kg殼寡糖組的紅鰭東方鲀血清中AKP活力顯著高于其他組，可能是隨著殼寡糖含量的增加，紅鰭東方鲀免疫機(jī)能得到加強(qiáng)，從而影響了酶的分泌，最終實(shí)現(xiàn)了酶量的增加。

CAT是一種可有效從細(xì)胞中清除高濃度H2O2的酶［24］，存在于細(xì)胞的過氧化物體內(nèi)。本試驗(yàn)中，2000 mg/kg殼寡糖添加組紅鰭東方鲀的CAT活性顯著高于對(duì)照組，說明添加殼寡糖可增強(qiáng)紅鰭東方鲀抗氧化能力。

3.4殼寡糖對(duì)紅鰭東方鲀肝臟SOD、CAT酶活力和MDA含量的影響

肝臟是魚類合成血清蛋白的主要場(chǎng)所，也是能量代謝的中樞器官，在蛋白質(zhì)、脂肪和糖類的分解與合成代謝中起著重要作用。肝臟指標(biāo)的變化是一種對(duì)短期和長(zhǎng)期營養(yǎng)方式的直接反映，故肝臟功能可作為評(píng)價(jià)魚類健康狀況的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，飼料中添加殼寡糖的紅鰭東方鲀，肝臟中SOD、CAT活力和MDA含量與對(duì)照組相比均達(dá)到顯著性差異。SOD活力最大值較對(duì)照組提高了25%，說明飼料中添加殼寡糖能夠加速紅鰭東方鲀肝臟對(duì)代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基的分解和代謝；CAT活力最大值較對(duì)照組提高了79%，說明飼料中添加殼寡糖能顯著提高紅鰭東方鲀肝臟CAT活力。MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，具有很強(qiáng)的生物毒性，MDA含量的高低可作為考察細(xì)胞受脅迫嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一，MDA主要損傷生物膜結(jié)構(gòu)，改變膜的通透性，影響生理生化反應(yīng)，進(jìn)而反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基損傷的程度［25］。本試驗(yàn)中，殼寡糖添加組的MDA含量顯著低于對(duì)照組，說明添加殼寡糖能夠減輕紅鰭東方鲀肝臟中自由基對(duì)機(jī)體的損傷。MDA、SOD、CAT三者有一定的相關(guān)性，SOD、CAT活力的升高直接反映魚體非特異性免疫的增強(qiáng)，MDA含量的降低反映出魚體肝功能受損較小，可保持肝功能高效地運(yùn)作，進(jìn)而反映出魚體非特異性免疫能力的增強(qiáng)。

3.5殼寡糖在紅鰭東方鲀抗細(xì)菌感染中的作用

攻毒試驗(yàn)可以較為直接地觀察魚體對(duì)細(xì)菌感染的抵抗能力，并能間接地反映出魚體的免疫能力。

遲緩愛德華氏菌是愛德華菌屬中的一種，此病流行范圍廣，發(fā)病率及死亡率高，在多種養(yǎng)殖魚類中均有報(bào)道，并引起水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)者的高度重視［26］。本試驗(yàn)中注射的哈維弧菌是從某養(yǎng)殖場(chǎng)體表潰爛的養(yǎng)殖紅鰭東方鲀病灶處分理出的一株優(yōu)勢(shì)菌。哈維弧菌是條件致病菌，當(dāng)水體環(huán)境發(fā)生變化，魚體皮膚損傷、寄生蟲感染等因素造成魚體抵抗力降低時(shí)，極易感染哈氏弧菌。哈維弧菌可引起多種海水養(yǎng)殖魚類的潰瘍?。?7-29］。王斌等［30］給紅鰭東方鲀肌肉注射哈維弧菌，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀內(nèi)臟出現(xiàn)充血，表皮出現(xiàn)潰瘍糜爛。張藝等［9］報(bào)道，在大菱鲆飼料中添加殼寡糖，能明顯提高大菱鲆對(duì)遲鈍愛德華菌感染的抵抗能力。

本研究在攻毒試驗(yàn)的兩周中，注射的兩種菌濃度高、劑量大，但紅鰭東方鲀?cè)趦芍芎蟛湃克劳?，說明紅鰭東方鲀對(duì)這兩種細(xì)菌具有一定的抵抗力，殼寡糖添加組紅鰭東方鲀的死亡率均低于對(duì)照組，原因可能是：（1）飼料中添加殼寡糖增加了全血中白細(xì)胞的含量，吞噬進(jìn)而消滅了外來細(xì)菌，血清中LZM活性的增加可以使大量細(xì)菌裂解死亡，血清和肝臟中SOD和CAT可以產(chǎn)生協(xié)同作用，大量清除細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基［31］，由此產(chǎn)生的一系列反應(yīng)增強(qiáng)了魚體的抵抗力；（2）遲緩愛德華氏菌與哈維弧菌均屬于革蘭氏陰性菌，Wang等［32］研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖可通過擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞核并與DNA結(jié)合，干擾革蘭氏陰性菌特定的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，增強(qiáng)紅鰭東方鲀對(duì)革蘭氏陰性菌的抵抗能力；（3）殼寡糖可以吸附聚集在細(xì)胞表面，形成高分子膜，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，由此起到殺菌作用［33］，增強(qiáng)魚體對(duì)細(xì)菌的抵抗力。

本試驗(yàn)表明，飼料中添加殼寡糖可提高紅鰭東方鲀機(jī)體非特異性免疫功能。建議紅鰭東方鲀飼料中殼寡糖的適宜添加量為2000 mg/kg。

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Effects of dietary chitosan on hematological parameters and non-specific immunity of redfin puffer Takifugu rubripes

SU Peng，PAN Jin-lu，HAN Yu-zhe，LIU Hai-ying，HUO Pu-yu，SUN Hang，JIANG Zhi-qiang
（College of Fisheries and Life Science，Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Juvenile redfin puffer Takifugu rubripes with body weight of（129.2±3.1）g were reared in a plastic 2 m3tank at a density of 50 fish per treatment and fed a basal diet supplemented with chitosan-oligosaccharides at dose of 0（C0），500（C1），1000（C2）and 2000（C3）mg/kg for 56 days at water temperature of（17.0±2.0）℃ with triplication to evaluate the effects of chito-oligosaccharides on serum，blood biochemical parameters and non-specific immunity function of redfin puffer.The results showed that there were significantly higher contents of blood platelet and higher activities of serum alkaline phosphatase，lysozyme，catalase，and superoxide dismutase in the fish fed the diets supplemented with chitosan-oligosaccharides than those in the fish fed the control diet（P＜0.05），increase with elevated dose of chitosan-oligosaccharides.The redfin puffer juveniles fed the diets containing chitosanoligosaccharides had significantly higher activities of hepatic catalase，and superoxide dismutase and significantly lower malondialdehyde content in liver than the fish fed the control diet（P＜0.05）.The redfin puffer juveniles fed the diets containing chitosan-oligosaccharides showed high resistance to Edwardsiella tarda and Vibrio harvey.It can be concluded that dietary supplementation of chito-oligosaccharides can improve the non-specific immunity function of redfin puffer，and that the supplemental level of chitosan-oligosaccharides in diets is suggested to be 2000 mg/kg diet.

Takifugu rubripes；chitosan-oligosaccharide；serum biochemical parameter；non-specific immunity

S965.225

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.007

2095-1388（2016）01-0037-07

2015-05-17

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng) （201405003）；遼寧省科技廳重大項(xiàng)目 （2014203015）

蘇鵬 （1989—），男，碩士研究生。E-mail：468152515@qq.com

姜志強(qiáng) （1960—），男，教授。E-mail：zhqjiang@dlou.edu.cn