鱗頭犬牙南極魚atp6v0c基因在HeLa細胞中抗寒功能的研究

劉明麗，王金鳳，張東，陳良標

（上海海洋大學水產與生命學院，省部共建水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海201306）

鱗頭犬牙南極魚atp6v0c基因在HeLa細胞中抗寒功能的研究

劉明麗，王金鳳，張東，陳良標

（上海海洋大學水產與生命學院，省部共建水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海201306）

為探求南極魚ATP酶類在低溫適應下的作用，從鱗頭犬牙南極魚Dissostichus mawsoni的cDNA文庫中克隆atp6v0c基因 （dmatp6v0c），并轉染到HeLa細胞中，通過流式細胞儀檢測細胞在低溫脅迫下 （10℃）的死亡率，獲得了dmatp6v0c基因的全部編碼序列，其長度為462 bp，并將其插入到真核表達載體pcDNA3.1（-）上用于體外表達。結果表明，與對照組相比，在低溫脅迫下，過表達dmatp6v0c基因的HeLa細胞死亡率從 （19.23±1.87）%顯著降低到（8.13±0.04）%（P＜0.05）。研究表明，在低溫脅迫下dmatp6v0c基因過表達能顯著降低HeLa細胞的死亡率，試驗結果可為dmatp6v0c基因作為魚類耐寒育種的候選基因提供理論依據。

鱗頭犬牙南極魚；低溫脅迫；dmatp6v0c基因；Hela細胞；細胞死亡率

水體溫度直接影響魚類的生存，冬季的低溫會對熱帶魚類的養(yǎng)殖造成巨大的經濟損失［1-2］。研究發(fā)現，尋找關鍵基因用于改善熱帶魚類的耐寒性能成為解決這一問題的有效手段，而作為生長在極端低溫環(huán)境下的南極魚類，可為挖掘與寒冷相關的候選基因提供寶貴的研究材料［3］。

ATP6V0C（ATPase-H+transporting lysosomal vacuolar proton）是微囊 ATP酶 （V-ATPase）V0結構域的c亞基［4-5］。V-ATPase是一種與細胞膜相關的多亞基蛋白復合體，也是受ATP驅動的質子泵，可通過水解ATP獲得能量來跨膜轉運質子［6-7］。V-ATPase包括V0和V1兩個結構域，V0結構域由a、c、c′、c″、d和e 6個亞基組成，而V1結構域由A、B、C、D、E、F、G和H 8個亞基組成［8］。V1結構域的作用是水解ATP，而完整V0結構域的作用是質子的跨膜運輸，利用V1結構域水解ATP釋放的能量來驅動質子的跨膜運輸［9］。V-ATPase位于許多真核細胞的多種細胞膜上，如溶酶體、核小體、高爾基體延伸出來的微囊和分泌泡［6］。在哺乳動物中，V-ATPase的各亞基除了作為質子泵的組成部分外，還有其他功能：V0結構域的a亞基控制V-ATPase在細胞中的不同定位［9］，c亞基參與細胞間的交流［10］，e亞基在細胞融合過程中起作用［11］；V1結構域的B和C亞基調控V-ATPase和 actin細胞骨架的功能，E亞基調控細胞生長過程中Racl信號通路［12］。

研究表明，V-ATPase的功能主要是囊泡酸性環(huán)境的維持、囊泡和微囊的融合［13-14］、能量轉運和細胞pH的變化［15］等。而編碼V-ATPase V0結構域c亞基的atp6v0c基因在魚類中扮演了不同的角色。Chung等［16］研究發(fā)現，斑馬魚atp6v0c的一種亞型atp6v0c2在神經元中特異表達，參與神經元中神經遞質的儲存和分泌，并調節(jié)斑馬魚的神經興奮。Chen等［3］通過對南極魚和熱帶魚類的轉錄組比較分析，表明與斑馬魚相比，鱗頭犬牙南極魚Dissostichus mawsoni的atp6v0c基因表達量顯著上升，暗示atp6v0c基因在極地魚類低溫適應方面發(fā)揮了重要作用。本研究中，為探索南極魚dmatp6v0c基因在低溫適應下的作用，從鱗頭犬牙南極魚Dissostichus mawsoni的cDNA文庫［3］中克隆了dmatp6v0c基因，并將其插入到真核表達載體中，用于在HeLa細胞中瞬時的高效表達，在低溫脅迫下，檢測過表達dmatp6v0c基因對HeLa細胞死亡率的影響，以此來評估dmatp6v0c基因的抗寒功能，旨在為體外快速選育與抗寒相關的候選基因提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1材料

試驗用 Taq酶、DNA連接酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、反轉錄試劑盒等均購自TaKaRa公司；限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ購自NEB公司；pcDNA3.1（-）載體購自Invitrogen公司；膠回收和質粒小提試劑盒均購自OMEGA Bio-Tek公司；高溫細胞培養(yǎng)箱 （Galaxy 170S）、低溫細胞培養(yǎng)箱 （Galaxy170R）均購自Eppendrof公司；培養(yǎng)基 DMEM ［含有青霉素（10 000 IU）和鏈霉素 （10 000 μg/mL）的混合液］、胰蛋白酶均購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；TurboFect購自Thermo公司；其他常規(guī)試劑由省部共建水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室提供。

1.2方法

1.2.1dmatp6v0c基因的克隆及真核表達重組質粒的構建 根據本實驗室之前對Dissostichus mawsoni cDNA文庫的測序結果［3］，通過同源比對篩選得到dmatp6v0c編碼區(qū)基因序列。將dmatp6v0c編碼區(qū)基因序列和pcDNA3.1（-）上多個可用的酶切位點進行序列比對后，選取pcDNA3.1（-）上的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點進行基因插入。結合保護堿基和酶切位點，利用Primer 5軟件設計引物序列為

Forward：5′CTGACTCGAGATGTCGGCCGAAAGTCCC 3′；

Reverse：5′CGTCGGATCCTTATTTCGTGGAGAGGATCAGG 3′（劃線部分為酶切位點）。

本研究中，從Dissostichus mawsoni cDNA文庫中PCR擴增出該基因。將pcDNA3.1（-）載體和dmatp6v0c基因片段同時用XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，對酶切產物分別進行切膠回收，將膠回收后的基因片段用T4連接酶于16℃下連接過夜，將連接產物轉化至大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞中，涂布于平板 （含100 μg/mL氨芐青霉素）上篩選。選取部分菌斑接種到含100 μg/mL氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床中以250 r/min培養(yǎng)13 h。用T7和BGH reverse通用引物對單克隆菌液進行菌液PCR鑒定。反應體系 （共20 μL）：菌液1 μL，T7 primer 1 μL，BGH reverse primer 1 μL，dNTP 2 μL，10×reaction buffer 2 μL，Taq enzyme 0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。反應條件為：98℃下預變性5 min；98℃下變性10 s，55℃下退火5 s，72℃下延伸1 min，共進行35個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。將PCR產物用15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，并對條帶進行分析。陽性菌液送生工生物工程 （上海）股份有限公司進行測序驗證，并將送測的菌液保留備份。對測序成功的備份菌液進行擴大培養(yǎng)，然后嚴格按照質粒小提試劑盒說明書方法進行質粒提取，提取的質粒保存于冰箱（-20℃）中，用于轉染試驗。

菌液PCR引物序列為

T7 promoter primer：5′TAATACGACTCACTATAGGG 3′；

BGH reverse primer：5′TAGAAGGCACAGTCGAGGCT 3′。

試驗所用引物均由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成，并且進行PAGE純化。

1.2.2重組質粒酶切驗證 將pcDNA3.1（-）空載體和pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c重組質粒分別進行雙酶切。酶切體系 （共50 μL）：DNA 1 μg，Xho Ⅰ1 μL，BamHⅠ1 μL，10×cut smart buffer 5 μL，用ddH2O補至50 μL。37℃下酶切2 h，對酶切產物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，驗證其條帶大小。

1.2.3HeLa細胞的培養(yǎng) 將凍存的HeLa細胞從液氮中取出，于37℃水浴中解凍，然后以1000 r/min離心5 min，去凍存液，迅速向凍存管中加入1 mL 37℃完全培養(yǎng)基 （90 mL DMEM高糖培養(yǎng)基加上10 mL FBS，使用前再加入1 mL雙抗），用移液器輕輕吹散細胞，將吹散的細胞連同培養(yǎng)基一起轉移到直徑為100 mm的細胞培養(yǎng)皿中，并向平板中加入9 mL完全培養(yǎng)基，然后將平板置于37℃、5%CO2的高溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4轉染試驗及低溫處理策略 轉染前將4× 105cells HeLa細胞接種于直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24～48 h，待細胞匯合度達到70% ～80%后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋15 μg質粒至970 μL，混勻后加入30 μL TurboFect，于室溫中靜置20 min，然后分別加入到細胞密度適中的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動使轉染混合液均勻分布，然后置于高溫培養(yǎng)箱 （37℃）中培養(yǎng)2 d。轉染了pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c重組質粒的細胞作為試驗組細胞，轉染了pcDNA3.1（-）空載體的細胞作為對照組細胞，然后將試驗組細胞及對照組細胞分別在低溫培養(yǎng)箱 （10℃）中培養(yǎng)3 d。

1.2.5轉染HeLa細胞后基因轉錄的表達鑒定清洗在10℃下培養(yǎng)3 d的試驗組細胞以及對照組細胞，提取RNA，利用無RNase的DNase消化細胞RNA，然后嚴格按照反轉錄試劑盒說明書方法進行反轉錄。利用反轉錄后的cDNA作為模板，進行PCR擴增。反應體系 （共20 μL）：模板1 μL，Forward引物1 μL，Reverse引物1 μL，dNTP 2 μL，10×reaction buffer 2 μL，Taq enzyme 0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。反應條件為：95℃下預變性5 min；95℃下變性10 s，58℃下退火5 s，72℃下延伸1 min，共進行34個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。將PCR產物用15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳分析以及測序驗證。

1.2.6細胞死亡率的檢測 熒光染料碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種可對細胞核染色的試劑，但不能透過活細胞膜，當細胞死亡時會導致細胞膜破損，這樣會讓PI穿過破損的細胞膜而對核染色［17］。收集10℃下低溫處理3 d后的HeLa細胞，用預冷的體積分數為75%的乙醇對其進行固定，4℃下過夜。用含5 μg/mL RNAase和20 μg/mL PI的PBS，在避光的室溫條件下處理細胞30 min，然后用流式細胞儀分別對染色后的細胞進行細胞死亡率檢測，每個樣品重復檢測3次。

1.3數據處理

試驗結果以平均值±標準差 （mean±S.D.）表示，采用SPSS軟件進行統計學處理，用t檢驗進行差異顯著性檢驗，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1dmatp6v0c基因的克隆

本研究中，對Dissostichus mawsoni cDNA文庫進行測序，然后與已知的NCBI數據庫進行同源比對，獲得dmatp6v0c基因的編碼區(qū)序列，按此序列設計引物Forward/Reverse，并使用PCR方法擴增出dmatp6v0c基因片段，經測序表明，該基因的編碼區(qū)片段全長為462 bp，其核苷酸序列和氨基酸序列如圖1所示。

圖1　dmatp6v0c基因編碼區(qū)序列和氨基酸序列Fig.1 Encoding sequence and amino acid sequence of dmatp6v0c gene

2.2dmatp6v0c基因真核表達重組質粒酶切驗證

圖2　pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c示意圖Fig.2 Structure of pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c

為了使dmatp6v0c基因能夠在HeLa細胞中表達，將其插入到真核表達載體pcDNA3.1（-）上，插入位置如圖2所示。為了驗證dmatp6v0c基因編碼區(qū)462 bp核苷酸序列是否成功插入到pcDNA3.1 （-）載體上，分別對pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c重組質粒和pcDNA3.1（-）空載體用XhoⅠ和BamHⅠ限制性內切酶進行雙酶切。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見質粒變成線性條帶，重組質粒被切開成2個條帶，一條大小為462 bp，另一條大小為5371 bp；而空載體只有一條可見帶，大小為5371 bp（圖3）。此結果表明，dmatp6v0c基因片段成功插入到pcDNA 3.1（-）載體上，形成重組質粒，可進行下一步的轉染試驗。

注：M為 DL5000 DNA Marker；A為雙酶切后的 pcDNA3.1 （-）-dmatp6v0c質粒；P為雙酶切后的pcDNA3.1（-）空載體Note：M，DL5000 DNA Marker；A，pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c cut by double enzyme；P，pcDNA3.1（-）plasmid cut by double enzyme

2.3轉染HeLa細胞后基因轉錄表達的鑒定

為了驗證重組質粒在HeLa細胞中的轉錄表達，本研究中分別對試驗組和對照組HeLa細胞的RNA進行了反轉錄PCR。轉染了pcDNA3.1（-）-dmatp6v0c重組質粒的HeLa細胞作為試驗組細胞，轉染了pcDNA3.1（-）空載體的HeLa細胞作為對照組細胞。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，試驗組的PCR產物大小為462 bp，而對照組未出現條帶 （圖4）。這表明dmatp6v0c基因在Hela細胞中成功地進行了轉錄，可進行細胞死亡率檢測試驗。

圖4　HeLa細胞中過表達dmatp6v0c基因轉錄結果Fig.4 Gene transcription of overexpression of dmatp-6v0c gene in HeLa cell line

2.4HeLa細胞的死亡率

為了檢測低溫下HeLa細胞的死亡率，本研究中對經低溫 （10℃）處理后的細胞進行PI染色，然后使用流式細胞儀進行檢測，結果如圖5所示。散點圖5-A中用橢圓形標記的細胞群為PI陽性細胞群，即為死亡細胞群；用長方形標記的細胞群為PI陰性細胞群，即為活細胞。通過統計PI陽性細胞比率計算細胞的死亡率。從圖5-A可知，與對照組相比，試驗組死亡細胞群中的細胞較少。試驗組和對照組中的細胞死亡率如圖5-B所示，試驗組HeLa細胞的死亡率為 （8.13±0.04）%，對照組為 （19.23±1.87）%，試驗組顯著低于對照組（P＜0.05）。由此可見，過表達dmatp6v0c基因可以減少低溫下HeLa細胞的死亡率。

圖5　過表達dmatp6v0c基因后HeLa細胞的死亡率Fig.5　Mortality of Hela cells in overexpression of dmatp6v0c gene

3 討論

魚類在低溫適應過程中會通過增強氧化磷酸化，以提供足夠的能量維持身體的各項機能［18-19］。Coppe等［20］通過對生活在-1.86℃的南極冰魚Channichthyidae轉錄組進行分析，發(fā)現其轉錄組中124個候選的重復基因中有34個在線粒體中表達，其中ATP5S（ATP synthase，H+transporting，mitochondrial F0 complex，subunits）就是一種ATPase。ATP5S是一種ATP合成酶，它通過增強魚類線粒體中氧化磷酸化效率來增加ATP產生［21］。Belogru-dov［22］在動物細胞中過表達atp5s基因后，發(fā)現細胞中線粒體內膜的嵴增多增厚，而這種變化可以增加ATP合成體基片的交換速率；另外，過表達atp5s基因的細胞中細胞呼吸速率是普通細胞的2倍。以上結果表明，過表達atp5s基因能通過增強細胞有氧呼吸來增加 ATP。除此之外，Gracey等［23］通過對低溫壓力下鯉轉錄組進行分析，結果也表明，低溫下通過氧化磷酸化途徑產生的ATP有增加的趨勢。與ATP合成酶相同，ATP6V0C也參與到氧化磷酸化的過程中，本試驗中，HeLa細胞低溫下過表達dmatp6v0c基因能降低細胞的死亡率，這說明在低溫下代償性的加強生物體氧化磷酸化的過程，能更多地提供ATP來維持機體的生理活動。

低溫脅迫下，生物體中不僅ATP合成酶類表達量增加，而且其他ATP酶類的活性也會增強。例如P-ATPase，通過水解ATP產生的能量來運輸各種離子?？紫闀龋?4］通過測定鋸緣青蟹鰓中的P-ATPase活性，發(fā)現與在常溫下生活的鋸緣青蟹相比，低溫馴化后的鋸緣青蟹鰓中的P-ATPase （Na+，K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase）活性均隨著馴化溫度的降低而升高。另外，對南極魚和羅非魚的相關研究結果也支持這一結論［25-26］。低溫下生物體鰓的P-ATPase活性增強的作用是以水解ATP產生的能量來維持鰓的呼吸，以及運輸離子來維持鰓的滲透壓平衡，從而保證體內氧的供應和基礎代謝的正常進行［24］。ATP6V0C作為V-ATPase的V0結構域的c亞基，它能通過水解ATP釋放能量驅動溶酶體膜上的質子泵將H+泵入溶酶體內，從而形成并維持溶酶體的酸性環(huán)境。因為只有在酸性環(huán)境條件下溶酶體才會與其他膜結構融合，借此達到清除無用的生物大分子以及損傷和死亡細胞的目的［27-28］。低溫誘導的氧化應激產生的死亡細胞，可以通過這種方式予以清除［29］。筆者推測，低溫下dmatp6v0c基因的過表達能夠加速清理由于低溫脅迫而產生的死亡細胞，清理出這些對細胞生長有害的物質，能更好地維持細胞穩(wěn)態(tài)，其具體機制還有待進一步研究。

本研究中首次通過在 HeLa細胞中過表達dmatp6v0c基因，發(fā)現該基因可以減少低溫脅迫下HeLa細胞的死亡率，表明在 HeLa細胞中dmatp6v0c基因具有抗寒的功能，本研究結果為dmatp6v0c基因成為提高生物體耐寒能力的功能基因提供了理論依據，同時提供了一種體外快速評估候選基因抗寒能力的方法。

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Cloning of atp6v0c gene from Antarctic notothenioid fish Dissostichus mawsoni and identification of its cold tolerance in HeLa cell

LIU Ming-li，WANG Jin-feng，ZHANG Dong，CHEN Liang-biao

（College of Fisheries and Life，Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The atp6v0c gene of Antaratic notothenioid fish Dissostichus mawsoni was cloned from Antarctic notothenioid fish cDNA library，and then transfected the dmatp6v0c gene obtained into the HeLa cell to detect cell viability under cold stress（10℃）by flow cytometry to investigate the ATPase responsive for the cold adaptation in Antarctic notothenioid fish.The complete coding sequence with 462 bp of dmatp6v0c gene was cloned and sequenced，and the dmatp6v0c coding sequence was inserted into the pcDNA3.1（-）vector by XhoI and BamHI restriction sites for gene expression in HeLa cell.The results showed that over-expression of dmatp6v0c gene in HeLa cell was found to reduce the cell mortality from 19.23%±1.87%to 8.13%±0.04% （P＜0.05）under cold stress compared with the control group.The findings indicated that the expression level of dmatp6v0c was heavily involved in cell viability under cold stress and that dmatp6v0c could be considered as a candidate for breeding cold resistant fish.

Dissostichus mawsoni；cold stress；dmatp6v0c gene；HeLa cell；cell mortality

Q291

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.002

2095-1388（2016）01-0007-06

2015-04-05

國家 “973”重點基礎研究發(fā)展計劃項目 （2010CB126304）；國家基金委重點項目 （31130049）；上海市一流學科水產基礎生物學項目

劉明麗 （1988—），女，碩士研究生。E-mail：mingli_2009@sina.com

陳良標 （1966—），男，博士，教授。E-mail：lbchen@shou.edu.cn