中藥黃芪內生菌的分離鑒定及方法分析

胡青,諸葛增玉,任超(天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院,天津西青300384)

中藥黃芪內生菌的分離鑒定及方法分析

胡青,諸葛增玉,任超
(天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院,天津西青300384)

為探索中藥內生菌在動物免疫中作用機理和避免抗生素的耐藥性提供新的途徑,本研究分析了黃芪內生菌的種類,對其進行分離鑒定和活性篩選.以黃芪健康植株上的塊根為材料,經(jīng)過組織篩選、表面消毒、對照處理、培養(yǎng)基選擇、分離菌的培養(yǎng),形態(tài)學和革蘭染色鑒定等研究方法,獲得真菌17株,分列7個菌屬中;細菌34株,革蘭陽性菌19株、革蘭陰性菌15株,以單胞桿菌和芽孢桿菌屬為主.牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上生長情況最好,為28株.LB固體培養(yǎng)基上次之,為20株.高氏I號培養(yǎng)基上得到3株.

黃芪;內生菌;生物多樣性;生物活性;分類鑒定

中藥內生菌(Plant Endophyte)是存活于健康植物組織或器官內部、不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的一類微生物[1].目前內生菌被認為是篩選新型抗生素的重要資源.

中藥內生菌的研究主要采用植物組織培養(yǎng)法分離,再進行種類鑒別.結合本研究的條件和目的,我們選用培養(yǎng)條件的異同、形態(tài)學觀察、革蘭染色的方法.

黃芪可以提高免疫功能,臨床上廣泛用于治療神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內分泌和免疫系統(tǒng)等疾病[2].研究黃芪內生菌的生物多樣性,為解決野生黃芪生長緩慢,資源緊缺,使用抗生素的耐藥性和采挖的過程中破壞生態(tài)環(huán)境等諸多問題提供了新的方法.

1　材料與方法

1.1植物材料甘肅多枝黃芪的健康植株.

1.2試劑牛肉膏、蛋白胨、NaCl、酵母提取物、胰蛋白胨(北京奧博星生物技術有限責任公司)、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、可溶性淀粉(天津市化學試劑一廠)、瓊脂(JAPAN Storage RT)、乙醇、次氯酸鈉、pH值試紙等.

1.3方法與步驟

1.3.1培養(yǎng)基的制作3種培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、高氏Ⅰ號固體培養(yǎng)基. 1.3.2材料的處理黃芪根塊沖洗干凈,晾至表面無水珠,取主根切成約3 cm左右的小段.用75%乙醇溶液漂洗3 min,無菌水沖洗3次.再用10%次氯酸鈉溶液浸泡7 min,無菌水沖洗3次.

1.3.3組織培養(yǎng)將上述處理過的根段在無菌條件下切去兩端,剩余部分分割成小片,隨機將小片分別種植于3種培養(yǎng)基平板上,每種培養(yǎng)基設置3個平行皿,每個皿放4片,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d.

1.3.4對照組分別設置接組織塊對照、接洗滌水對照、直接印記對照、接未做任何處理的組織塊對照、接無菌水對照、空白對照.

1.3.5內生菌的分離純化觀察試驗培養(yǎng)皿及對照皿的情況,隨時觀察出菌情況及組織片變化,待根組織邊緣長出菌后,挑取菌絲或菌體,經(jīng)平板劃線法反復分離、純化,培養(yǎng)觀察菌落形態(tài),比較3種培養(yǎng)基對黃芪內生菌的分離情況,并對菌落的生長及特性做相應的記錄.

1.3.6鏡檢鑒定挑取待檢菌體制片,于顯微鏡下鏡檢.革蘭染色,油鏡觀察.

2　結果與分析

2.1表面消毒效果3種培養(yǎng)基的組織片培養(yǎng)均有內生菌生長.對照組中,除組織塊的培養(yǎng)得到內生菌外,其余均未觀察到內生菌.

2.2培養(yǎng)結果黃芪內得到內生菌51株.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上得到內生菌28株,LB固體培養(yǎng)基上得到內生菌20株,高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上得到內生菌3株.

2.3內生菌的鑒定

2.3.1形態(tài)學鑒定真菌共分離出17株內生真菌,根據(jù)培養(yǎng)條件、菌落形態(tài)及形態(tài)觀察,初步合并為11株形態(tài)型,觀察并記錄菌落形態(tài)(表1)和主要顯微結構(見中插彩版圖1).參照《真菌鑒定手冊》[3],顯微鏡鏡檢分類確定為在17株黃芪內生菌中,鐮孢菌屬4株、瓶霉菌屬3株、絲核菌屬3株、赤殼屬2株、枝頂孢屬2株、曲霉屬2株、青霉屬1株.

表1　黃芪內生真菌培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)特征

2.3.2革蘭染色鑒定細菌根據(jù)培養(yǎng)條件、菌落形態(tài)、革蘭染色及形態(tài)觀察,初步合并為10株形態(tài)型,菌落形態(tài)(表2)和主要顯微結構(見中插彩版圖1)參照《伯杰細菌鑒定手冊》[4]對目標菌進行分類:在獲得的34株菌中,革蘭陽性菌共19株、革蘭陰性菌共15株.以芽孢桿菌屬、單胞桿菌、短小芽孢桿菌和假單孢菌為主,分別為12株、10株、7株、5株.

表2　黃芪內生細菌的菌落特征和革蘭染色

3　討論

本研究中鐮孢菌屬為黃芪內生真菌的優(yōu)勢菌屬,占23.53%.其次是瓶霉菌屬,占17.64%,其發(fā)酵濃縮液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和腸炎沙門菌等均有一定抑菌活性.其他還有枝頂孢屬11.76%,其菌絲體具有免疫調節(jié)的作用[5].真菌也是黃芪的常見內生菌.細菌中革蘭陽性菌占多數(shù)為55.88%;革蘭陰性菌占44.12%.其中芽孢桿菌屬35.29%,是黃芪內的優(yōu)勢菌屬,有較強的抑菌效果[6].因實驗室無法真實還原黃芪生長環(huán)境,所以對內生菌種屬的精確鑒定,還需要在傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定基礎上結合分子生物學方法一起鑒定.

研究黃芪內生菌,在生物防治、醫(yī)療衛(wèi)生等領域有著廣闊的應用前景.黃芪內生菌的價值在今后的研究中要深入挖掘,并向多元化發(fā)展.

[1]吳元華,田秀玲.植物內生菌研究進展及其存在的問題[J].生態(tài)學雜志,2004,23(2):86-91.

[2]賀學禮,盧彥琪.黃芪化學成分及藥理作用綜述[J].保定師范專科學校學報,2004,17(4):40-42.

[3]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上?？茖W技術出版社, 1979:73-135.

[4]布坎南R E B.伯杰細菌鑒定手冊[M].中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組,譯.北京:科學出版杜, 1984:169-233.

[5]Poulev A,O Neal J M,Logendra S.Elicitation,a new window into p lant chemodiversity and phytochemical drug discovery[J].JMed Chem,2003,5(12):2542-2547.

[6]劉建玲、陳寶寶、劉永紅,等.半夏內生菌的分離與初步鑒定[J].中國中藥雜志,2009,6(18):2305-2307.

Biodiversity of Endophytes from Astragalus M embranaceu

HU Qing,ZHU GE Zeng-yu,REN Chao
(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultueal College,Tianjin 300384,China)

The aim of this study was to isolate the endophytes of Astragalus polycladus and screen their antimicrobial activi?ties.The experiment was conducted to isolate endophytes from healthy root of Astragalus polycladus under different conditions by means of organization screening,surface disinfection,control treatment,selection of culture medium,morphological identification, and so on.The morphological identification of the fungi and bacterium was studied.And then,morphological identification and Gram staining was performed.Results showed that there were 17 fungus and 34 bacteria isolated from Astragalus polycladus.Identi?fication of morphological characteristics under the microscope showed that endophytic fungi were classified to seven species.Identi?fied by Gram staining,there were 19 Gram-positive bacteria and 15 Gram-negative bacteria.P seudomonas sp.and Bacillus sp.are the main composition.The results showed that the dominant medium was beef extract peptone solid medium,witch supported 28 strains of microbes.The next was LB(Luria-Bertani)with 20,and Gao medium I with only three.

Astragalus polycladus;endophytes;biodiversity;bioactivity;isolation and identification Corresponding author:ZHU GE Zeng-yu

S895.4

A

0529-6005(2016)02-0059-02

2014-12-02

天津市教委科研計劃項目(20120621)

胡青(1990-),女,本科,研究方向為動物醫(yī)學, E-mail:805099964@qq.com

諸葛增玉,E-mail:zhugezy@163.com