蘇中地區(qū)豬大腸桿菌的耐藥性與耐藥基因的試驗(yàn)

顏友榮,方向紅,王琳琳(江蘇省農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州225300)

蘇中地區(qū)豬大腸桿菌的耐藥性與耐藥基因的試驗(yàn)

顏友榮,方向紅,王琳琳
(江蘇省農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州225300)

為分析蘇中地區(qū)豬大腸桿菌的血清型、耐藥譜和毒力基因的關(guān)系,從蘇中地區(qū)豬相關(guān)病料中分離出已定型的145株E.coli,其中O9、O45、O107和O139為優(yōu)勢(shì)血清型.采用瓊脂稀釋法測(cè)定其對(duì)14種抗菌藥的敏感性,通過(guò)多重PCR方法檢測(cè)耐藥性最嚴(yán)重的氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)各4種毒力相關(guān)基因.結(jié)果顯示,幾乎所有菌株對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素和四環(huán)素高度耐藥,而對(duì)頭孢曲松高度敏感,其中多重耐藥菌株多數(shù)耐5種以上藥物,常見(jiàn)的多重耐藥表型是氟苯尼考/氯霉素/多西環(huán)素/四環(huán)素/氨芐西林.PCR鑒定結(jié)果表明,含有毒力基因的菌株中38%至少具有兩個(gè)毒力基因,其中EAST1+Stx2e和hlyF+Stx2e比較常見(jiàn).比較常見(jiàn)的毒力基因?yàn)镾tx2e和EAST1,STb基因僅在一株菌中檢測(cè)到.

大腸桿菌;耐藥性;毒力基因;耐藥圖譜

大腸桿菌病是一種重要的人畜共患病,該菌通常緊密粘附于腸上皮細(xì)胞的表面或嵌入腸上皮細(xì)胞表面的凹陷中,使黏膜呈特征性損傷,局部微絨毛萎縮,腸黏膜壞死,進(jìn)而形成潰瘍[1].根據(jù)毒力特征和所致疾病癥狀的不同,至少可分為3種類(lèi)型,產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)、志賀毒素大腸桿菌(STEC)和粘附與脫落性大腸埃希菌(AEEC).ETEC主要通過(guò)其表面的粘附素,如K88、K99、987P和F41等粘附于小腸上皮細(xì)胞,隨后分泌熱敏腸毒素(LT)或耐熱腸毒素.

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源145株試驗(yàn)大腸桿菌來(lái)自于蘇中地區(qū)獸醫(yī)站、養(yǎng)殖場(chǎng)、動(dòng)物醫(yī)院疑似大腸桿菌感染的病死豬,無(wú)菌采集其有明顯病變的肝、心、脾、肺等病料.經(jīng)分離培養(yǎng)和鑒定,實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆?

1.2試驗(yàn)材料試驗(yàn)藥物:阿莫西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、壯觀霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、甲氧芐氨嘧啶、安普霉素.

1.3藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI 2010版)的指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn).

1.4判定標(biāo)準(zhǔn)以CLSI文件為指導(dǎo)原則,以敏感、中介、耐藥3種形式對(duì)MIC值做出判定.同時(shí)檢測(cè)其多重耐藥性.

1.5毒力基因與耐藥性的關(guān)系根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果調(diào)查蘇中地區(qū)豬大腸桿菌中針對(duì)耐藥性較普遍抗生素的耐藥基因情況,找出其規(guī)律并研究毒力基因與耐藥性的關(guān)系.由于本試驗(yàn)中蘇中地區(qū)豬大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)藥物的耐藥率較高,因此,采用多重PCR方法檢測(cè)4種氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aad A1、aa C2、aac4、aph A3[1]和3種四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tet A、tet C以及tet M的流行情況.

2　結(jié)果

2.1145株豬源致病性大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果大腸桿菌是引起仔豬的腹瀉性死亡的最常見(jiàn)的因素,而臨床上對(duì)豬大腸桿菌病的治療通常采用的方法是用抗生素.因此,本試驗(yàn)對(duì)14種常見(jiàn)藥物的耐藥性進(jìn)行了檢測(cè)(見(jiàn)表1和表2),結(jié)果表明,絕大部分的菌株對(duì)頭孢唑啉和頭孢噻肟敏感.而耐藥性最高的是四環(huán)素類(lèi)和氨基糖苷類(lèi).耐藥性均達(dá)到了70%以上.

表1　145株豬大腸桿菌對(duì)14種抗菌藥物的MIC值范圍及MIC50和MIC90

表2　145株豬大腸桿菌的多重耐藥率

表3　8種耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

2.2多重耐藥性檢測(cè)結(jié)果從表3可以看出,大腸桿菌的所有分離株中都表現(xiàn)不同程度的多重耐藥性,至少有3耐,最多的14耐.在這些菌中10耐、11耐、12耐菌株居多,分別為15.86%、19.31%、22.07%, 8耐和9耐菌株占分離株的11.03%、9.66%.

2.3豬源大腸桿菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果所有定型血清型中,O9、O45、O107和O139為優(yōu)勢(shì)血清型,所有優(yōu)勢(shì)血清型對(duì)氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)藥物耐藥,其中O9血清型菌株的耐藥性呈6-13耐,且87%以上對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和氯霉素耐藥;而73%以上的菌株對(duì)安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感.PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,所有O9血清型菌株均含有aad A1、tet M基因,60%的菌株擁有Stx2e和53%的菌株擁有eae A和sta基因, 40%的含有F4基因.O45血清型菌株呈4-13耐,其中所有菌株對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素和四環(huán)素耐藥,但對(duì)頭孢唑啉和頭孢噻肟敏感.攜帶的毒力基因主要有:ast A(82%)、Stx2(e82%)、eae A(45%)和sta(45%).

經(jīng)PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析,aad A 1 26.7%、aa C 2 10.0%、aa C 4 0.0%、aph A 3 0.0%、aa?d A 1/aa C 4 6.7%、aad A 1/aph A 3 0.0%、aa C 2/aa C 4 3.3%、aad A 1/aa C 2 33.3%、aad A 1/aa C 2/aph 3 0.0%、aad A 1/aa C 4/aph 3 3.3%、aad A 1/aa C 2/aa C 4 3.3%、aad A 1/aaC 2/aa C 4/aph 3 3.3%;tet A 10.0%、tet C 20.0%、tet M 6.7%、te A/tet C 3.3%、tet A/ tet M 10.0%、tet C/tet M 10.0%、te A/tet C/tet M 6.7%.

3　討論

甲氧芐氨嘧啶較敏感是由于他在蘇中地區(qū)的獸醫(yī)臨床上使用的時(shí)間較短的緣故.而敏感菌株大多數(shù)來(lái)自于管理模式較為落后的養(yǎng)殖場(chǎng).

氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥機(jī)制有3種,分別是降低藥物吸收或降低藥物在細(xì)胞膜的通透性;改變核糖體的結(jié)合位點(diǎn);產(chǎn)生藥物功能集團(tuán)滅活酶.第3種是氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥的普遍機(jī)制,細(xì)菌能產(chǎn)生50多種分別編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶、腺苷轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因[2].

除了四環(huán)素的廣泛應(yīng)用之外,位于接合質(zhì)粒或接合轉(zhuǎn)座子上四環(huán)素耐藥基因的轉(zhuǎn)移也是耐藥性產(chǎn)生的主要原因之一[3].通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn),本研究中的大腸桿菌中有96.7%的四環(huán)素耐藥菌株攜帶tet A基因,這與國(guó)外的某些報(bào)道一致,Kim等擴(kuò)增了2000-2005年間從韓國(guó)分離到的致病性大腸桿菌中的tet (A)和tet(B)基因,結(jié)果分別有78.4%和13.7%的菌株這兩種耐藥基因的克隆結(jié)果為陽(yáng)性[4].此外,Bryan等對(duì)從美國(guó)的人和各種動(dòng)物體內(nèi)分離的大腸桿菌進(jìn)行了四環(huán)素耐藥基因攜帶情況的調(diào)查,結(jié)果也表明,tet(A)和tet(B)為最主要的四環(huán)素耐藥基因(攜帶率分別為35%和63%)[5].

tet(M)基因在對(duì)四環(huán)素耐藥的革蘭陽(yáng)性菌中多見(jiàn),而在革蘭陰性菌尤其是大腸桿菌中的研究資料則相對(duì)較少.2004年Bryan等首次報(bào)道從雞和豬體內(nèi)分離的大腸桿菌中克隆到了tet(M)基因[5],2006年Jones等首次證實(shí)了人臨床大腸桿菌分離株中tet (M)基因的存在[6],但在國(guó)內(nèi)目前尚未見(jiàn)大腸桿菌攜帶tet(M)基因的文獻(xiàn)報(bào)道.在本試驗(yàn)中,28%的大腸桿菌耐藥菌株攜帶有tet(M)基因,并且這些菌株還同時(shí)攜帶有tet(A)基因,其原因可能與tet(M)位于結(jié)合轉(zhuǎn)座子上,而結(jié)合轉(zhuǎn)座子可以轉(zhuǎn)座多個(gè)四環(huán)素耐藥基因有關(guān)[6].另外,在本試驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)到單個(gè)的只攜帶tet(M)基因的耐藥菌株,因此tet(M)基因在大腸桿菌對(duì)四環(huán)素耐藥機(jī)制方面的作用需進(jìn)一步深入的研究.

[1]張安云,王紅寧,周萬(wàn)蓉,等.用四重PCR方法檢測(cè)野生動(dòng)物分離細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥基因[C].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第12次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.井岡山:中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì),2007:1087-1090.

[2]George A M.Multidrug resistance in enteric and other Granr nega?tive bacteria[J].FEMS Microbiology Letters,1996,139(1):1-10.

[3]Roberts M C.Update on acquired tetracycline resistance genes[J]. FEMS Microbiology Letters,2005,245(2):195-203.

[4]Kim T E,Jeong Y W,Cho S H,et al.Chronological study of anti?biotic resistances and their relevant genes in Korean avian patho?genic Escherichia coli isolates[J].Journal of Clinical Microbiolo?gy,2007,45(10):3309-3315.

[5]Bryan A,Shapir N,Sadowsky M J.Frequency and distribution of tetracycline resistance genes in genetically diverse,nonselected, and nonclinical Escherichia coil strains isolated from diverse hu?man and animal sources[J].App lied and Environmental Microbiol?ogy,2004,70(4):2503-2507.

[6]Jones C H,Tuckman M,Murphy E,et al.Identification and se?quence of a tet(M)tetracycline resistance determinant homologue inclinical isolates of Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology. 2006,188(20):7151-7164.

S852.61

B

0529-6005(2016)02-0090-02

2014-04-29

顏友榮(1978-),男,副教授,碩士,從事豬大腸桿菌的研究,E-mail:38539187@qq.com