干酪乳桿菌對斷奶仔豬回腸黏膜結(jié)構(gòu)及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

王齊桓,王安如,周寧聰,張魏偉,蘇華荔,湯林杰,馬云飛,滕可導(dǎo)(.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京海淀009;.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京海淀009;.內(nèi)蒙古烏蘭察布市畜牧科學(xué)研究所,內(nèi)蒙古烏蘭察布0000)

干酪乳桿菌對斷奶仔豬回腸黏膜結(jié)構(gòu)及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

王齊桓1,王安如2,周寧聰3,張魏偉1,蘇華荔2,湯林杰1,馬云飛1,滕可導(dǎo)1
(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193;2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京海淀100192;3.內(nèi)蒙古烏蘭察布市畜牧科學(xué)研究所,內(nèi)蒙古烏蘭察布012000)

為了探究干酪乳桿菌對斷奶仔豬回腸黏膜組織發(fā)育及免疫功能的影響,將96頭14日齡斷奶仔豬隨機(jī)分為空白對照組、乳桿菌對照組、K88攻毒組、預(yù)防組,每組4個重復(fù),采用組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)方法觀察回腸黏膜組織結(jié)構(gòu)及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化.結(jié)果顯示,飼用干酪乳桿菌進(jìn)行預(yù)防能夠顯著提高斷奶仔豬回腸絨毛高度、V/C值,增加PCNA含量,提高腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量.表明干酪乳桿菌能保護(hù)腸道組織,提高腸道免疫力,降低大腸桿菌對腸道的損害.

斷奶仔豬;乳桿菌;絨毛;淋巴細(xì)胞

Corresponding authors:TENG Ke-dao;MA Yun-fei

早期斷奶仔豬常出現(xiàn)"早期斷奶綜合征",導(dǎo)致其腸道功能紊亂,腹瀉率增加[1],極大影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益.益生菌作為一種活的微生物,對腸道黏膜有保護(hù)作用,可以治療各種腸道疾病,有研究[2-3]表明,益生菌在腸道結(jié)構(gòu)及黏膜免疫作用中發(fā)揮重要功效,我們研究的益生菌是干酪乳桿菌(Lactobacillus casei Zhang,Lc Zhang),其功能主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)消化吸收,產(chǎn)生抗體免疫等作用[4-5].回腸是小腸的末段,在腸道免疫中起重要作用,腸上皮細(xì)胞是仔豬抵抗飼料毒素及外來致病菌的重要防線,其包含具有一定免疫功能的淋巴細(xì)胞,腸絨毛的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)數(shù)量一定程度反映腸道對抗外來刺激能力[6].本試驗(yàn)采用組織學(xué)及免疫組織化學(xué)方法,探究經(jīng)口飼喂干酪乳桿菌對回腸黏膜結(jié)構(gòu)及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響,旨在為干酪乳桿菌作為仔豬生產(chǎn)中一種新型飼料添加劑的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集干酪乳桿菌Lactobacil?lus casei Zhang(Lc Zhang)和大腸桿菌K88(O149∶K91,K88ac均由大北農(nóng)飼用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,分別作為益生菌和致病菌模式菌株,選取14日齡斷奶仔豬96頭(杜、長、大三元雜交豬,由廣東瑞昌食品進(jìn)出口有限公司致富豬場提供),隨機(jī)分成4組,每組4個重復(fù),每個重復(fù)6頭豬.分組如下:(1)空白對照組:14日齡斷奶仔豬,基礎(chǔ)日糧正常飼養(yǎng)4周;(2)乳桿菌對照組:在日糧中添加干酪乳桿菌(劑量為107CFU/g),持續(xù)飼喂Lc Zhang 4周;(3)攻毒組:正常飼喂2周后(即28日齡),大腸桿菌K88配制成懸液進(jìn)行灌胃攻毒(劑量為1010CFU/頭),然后正常飼養(yǎng)2周; (4)預(yù)防組:飼喂Lc Zhang 2周后,攻毒并停喂Lc Zhang 2周,劑量同上.仔豬飼養(yǎng)至42日齡,每組隨機(jī)選取4頭仔豬,腋下動脈放血致死,剖開腹腔,取回腸組織置于多聚甲醛固定.

1.2石蠟切片的制作及H.E.染色將固定好的組織塊進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋,制備4 μm厚的連續(xù)切片.切片常規(guī)脫蠟,蘇木精染色15 min,1%鹽酸-酒精溶液分色后,自來水藍(lán)化15 min;梯度酒精逐級脫水;浸入伊紅染液1.5 min;常規(guī)脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片. Nikon Ni-U顯微鏡觀察.

1.3PCNA免疫組織化學(xué)染色切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水,3%H2O2室溫孵育10 min,抗原修復(fù)10 min,滴加1∶200小鼠抗PCNA單克隆抗體(BM 0104,武漢博士德生物工程有限公司)4℃過夜;滴加生物素化的山羊抗小鼠的IgG(SP 9002,北京市中杉金橋生物技術(shù)有限公司),室溫孵育30 min;滴加HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素復(fù)合物(SP 9002,北京市中杉金橋生物技術(shù)有限公司),室溫孵育30 min;DAB顯色5 min;蘇木精復(fù)染30 s,常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片.各步驟之間均用PBS(pH值7.3)沖洗3次,每次5 min.

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析利用IPP 6.0軟件統(tǒng)計(jì)腸絨毛高度、腸隱窩深度、每100個柱狀上皮細(xì)胞間的淋巴細(xì)胞數(shù)量及腸腺中PCNA陽性物質(zhì)的平均光密度值.采用SPSS 17.0軟件One-Way ANOVA模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用"平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差"表示.P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著.

2　結(jié)果與分析

2.1干酪乳桿菌對斷奶仔豬回腸絨毛高度、腸隱窩深度及V/C比值的影響與A組的絨毛高度、V/C比值相比,B組分別提高6.38%、5.40%,差異均顯著(P<0.05);C組分別降低19.66%、14.13%,差異均極顯著(P<0.01).與C組相比,D組的絨毛高度、V/C比值分別提高15.95%、9.81%,差異均極顯著(P<0.01).回腸中各組間的隱窩深度沒有顯著差異(P>0.05).見圖1.

圖1　干酪乳桿菌對斷奶仔豬回腸絨毛高度、腸隱窩深度、V/C比值的影響

2.2干酪乳桿菌對斷奶仔豬回腸PCNA表達(dá)的影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與A組的PCNA表達(dá)量相比,B組增加了18.21%,差異顯著(P< 0.05);C組降低了39.27%,差異極顯著(P<0.01).與C組相比,D組PCNA的表達(dá)量增加了72.87%,差異極顯著(P<0.01).見中插彩版圖2、3(a).

2.3干酪乳桿菌對斷奶仔豬回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響與A組的IEL數(shù)量相比,B組增加了16.24%,差異顯著(P<0.01);C組降低了8.10%,差異極顯著(P<0.05).與C組相比,D組的IEL數(shù)量增加了34.86%,差異顯著(P<0.01).見圖3 (b).

3　討論

3.1干酪乳桿菌對仔豬回腸組織發(fā)育的影響小腸絨毛是吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要部位,成熟的絨毛細(xì)胞具有吸收養(yǎng)分的功能,絨毛高度增加表明吸收養(yǎng)分的表面積增加[7].絨毛隱窩被認(rèn)為是絨毛工廠,腸上皮細(xì)胞起源于隱窩,沿著絨毛表面向上遷移至絨毛尖端并伸入腸腔[8].營養(yǎng)生理學(xué)的研究表明,絨毛高度與隱窩深度的比值(絨腺比)能表示小腸上皮細(xì)胞更新代謝程度[9].郭元晟等[10]研究表明,飼喂發(fā)酵乳桿菌能夠顯著提高雞小腸各段絨毛高度、V/C比值,改善小腸的黏膜結(jié)構(gòu).鄧軍等[11]研究發(fā)現(xiàn),飼喂枯草芽孢桿菌、豬源乳酸桿菌可以顯著提高仔豬回腸的絨毛高度和V/C的比值,降低回腸隱窩的深度.我們的試驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對照組相比,乳桿菌對照組的回腸絨毛高度顯著增加.預(yù)防組的仔豬回腸絨毛高度也顯著高于K88攻毒組,說明干酪乳桿菌能有效的抵御大腸桿菌對腸道黏膜組織結(jié)構(gòu)的破壞,保護(hù)絨毛的完整性,對仔豬的生長發(fā)育起到一定保護(hù)作用.飼用干酪乳桿菌對回腸的腸隱窩深度沒有顯著的影響.與空白對照組相比,乳桿菌對照組的回腸V/C值顯著增加.預(yù)防組的仔豬回腸V/C值顯著高于K88攻毒組,說明飼用干酪乳桿菌能有效的保護(hù)腸道黏膜組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能.

圖3　干酪乳桿菌對斷奶仔豬回腸PCNA表達(dá)及上皮細(xì)胞內(nèi)淋巴細(xì)胞的影響

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)記物,通常使用免疫組化來評估細(xì)胞增殖[12].我們的試驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對照組相比,乳桿菌對照組的回腸PCNA的表達(dá)量顯著增加.預(yù)防組的仔豬回腸PCNA的表達(dá)量顯著高于K88攻毒組.說明干酪乳桿菌能有效地保護(hù)腸道黏膜不受致病菌的侵襲,維持腸道的穩(wěn)態(tài).

3.2干酪乳桿菌對仔豬腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的影響小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞作為腸道黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞的重要組成部分,在抗感染、調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的完整性和外來抗原的免疫應(yīng)答方面起重要作用,其數(shù)量的變化在一定程度上反映消化道的局部免疫狀況[13].Kim等[14]報道,在小鼠口服大腸桿菌后,CD8αα+IEL明顯減少,腸上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子分泌減少和受體表達(dá)下降,導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞凋亡增多,加重黏膜的破壞.我們的試驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對照組相比,乳桿菌對照組的IEL數(shù)量顯著提高.預(yù)防組IEL數(shù)量顯著高于K88攻毒組.說明飼用干酪乳桿菌能顯著提高腸道免疫力,抵抗病原菌入侵,保護(hù)機(jī)體健康.

綜上所述,飼喂干酪乳桿菌能夠有效地提高兩周齡斷奶仔豬回腸的絨毛高度、V/C比值,說明干酪乳桿菌能保護(hù)腸道結(jié)構(gòu),降低大腸桿菌對腸道的損害.飼喂干酪乳桿菌能夠在一定程度上提高斷奶仔豬腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量,增強(qiáng)腸道免疫力與抗病原體侵襲的能力.本研究將為益生菌廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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Effect of Lactobacillus casei on mucosal structure and number of intraepithelial lym phocyte of ileum in weaned piglets

WANG Qi-huan1,WANG An-ru2,ZHOU Ning-cong3,ZHANG Wei-wei1, SU Hua-li2,TANG Lin-jie1,MA Yun-fei1,TENG Ke-dao1
(1.College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193,China;2.State Key Laboratory of Direct-Fed Microbial Engineering,Beijing DaBeiNong Science and Technology Group Co.,Ltd.(DBN),Beijing 100192,China;3.Ulanqab City Institute of Animal Husbandry Sciences,Inner Mongolia,Ulanqab 012000,China)

To explore the effect of lactobacillus casei on the development and immune function of ileum in weaned piglets, ninety-six 14-day-old weaned piglets were divided into four groups,and the ileum mucosal structure and the number of intraepi?thelial lymphocyte were examined by histochemistry and immunohistochemistry.The results showed that the lactobacillus casei group compared with the other groups appeared complete structural morphology,and aligned epithelial cell.Feeding Lactobacillus casei for prevention significantly improved the height of intestinal villus and the ratio of V/C,significantly increased PCNA content, and promote the quantity of lymphocyte between intestinal villus in weaned pig.These results suggest that,Lactobacillus casei in food could obviously protect intestinal tissue,improve intestinal immunity,and reduce the damage of intestinal E.coli.

Weaned piglets;lactobacillus casei;villus;lymphocyte

S858.28

A

0529-6005(2016)02-0034-03

2015-04-28

北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(201205410511191);國家973計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB723702)

王齊桓(1990-),男,碩士生,研究方向?yàn)榛A(chǔ)獸醫(yī)學(xué),E-mail:wqihuan@cau.edu.cn

滕可導(dǎo),E-mail:kedao@cau.edu.cn;馬云飛,E-mail: yunfeima@cau.edu.cn