HPLC-DAD法和一測多評法同時測定安息香中4種成分

胡 攀， 夏厚林， 文冰杰， 李瑞煜， 楊孟妮， 張 慧（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川成都611137）

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HPLC-DAD法和一測多評法同時測定安息香中4種成分

胡 攀， 夏厚林*， 文冰杰， 李瑞煜， 楊孟妮， 張 慧
（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川成都611137）

目的 建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法和一測多評（QAMS）法同時測定安息香Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯以及苯甲酸芐酯的含有量。方法 HPLC-DAD法同時測定4種成分含有量，計算苯甲酸松柏酯與其他3種成分的相對校正因子，考察相對保留時間法和線性回歸法對色譜峰定位的影響，并比較這兩種方法的重復(fù)性。結(jié)果 15批樣品中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯、苯甲酸芐酯的含有量分別為0.692%～2.621%、2.944%～15.628%、12.649%～62.589%、0.514%～2.034%，線性回歸法較相對保留時間法更準(zhǔn)確，3個相對校正因子重復(fù)性良好，兩種方法無顯著差異。結(jié)論 一測多評法可用于測定安息香中的總香脂酸類成分。

安息香；香草醛；苯甲酸；苯甲酸松柏酯；苯甲酸芐酯；HPLC-DAD；一測多評

安息香Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.為芳香開竅藥，具有開竅醒神、行氣活血、止痛之功效，用于治療中風(fēng)痰厥、氣郁暴厥、中惡昏迷、心腹疼痛、產(chǎn)后血暈、小兒驚風(fēng)等癥狀［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，其有抗炎解熱［2］、腦缺血缺氧保護、促進血腦屏障通透性［3-5］、抗腫瘤［6］等作用。

安息香為樹脂類藥材，其主要成分為總香脂酸，如香草醛、苯甲酸、苯甲酸芐酯、苯甲酸松柏酯等［7-8］。目前，各國藥典對該藥材的質(zhì)量控制均以總香脂酸為主要指標(biāo)，如 《歐洲藥典》（第7版）、《印度藥典》（2010版）均采用滴定法測定其含有量；《中國藥典》2005版采用重量法測定其含有量，而2010版和2015版均測定水解后苯甲酸含有量。

香草醛又名香蘭素，為安息香中主要的香味成分，亦為傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別的重要氣味辨別物；苯甲酸又名安息香酸，多國藥典均以其為定性鑒別或含有量測定指標(biāo)；苯甲酸松柏酯及苯甲酸芐酯均為安息香中重要的總香脂酸酯類成分，水解后均能產(chǎn)生苯甲酸及其他物質(zhì)，而且含有量相對較高［9］。以上成分除苯甲酸外［10］，目前均未見測定的報道，而且苯甲酸松柏酯和苯甲酸芐酯暫無法定對照品，而采用一測多評法可以減少對照品的使用量，節(jié)約成本。因此，本實驗先以高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法開展以上4種成分含有量測定方法的研究，再以主要活性成分苯甲酸松柏酯［11］為內(nèi)參物，采用一測多評法來同步測定安息香中多個總香脂酸成分含有量，并將兩種方法進行比較。

1　材料與儀器

1.1藥材 安息香由荷花池專業(yè)市場、四川科倫藥業(yè) （批號141201）以及成都中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為安息香科植物白花樹Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.的干燥樹脂。

1.2對照藥材及對照品 安息香對照藥材、苯甲酸、香草醛對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批 號 分 別 為121186-201302、100419-201302、110501-201102）；苯甲酸芐酯對照品 （德國 Dr. Ehrenstorfer公司，批號20102）；苯甲酸松柏酯（自制，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR譜鑒定，含有量大于99%）。

1.3儀器與試劑 Agi1ent 1200高效液相色譜儀，包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Agi1ent Chem Station色譜數(shù)據(jù)工作站 （美國安捷倫公司）；SSI Series 1500高效液相色譜儀 （美國SSI公司）；SK-5200H超聲波清洗器 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；XP205電子分析天平 （梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純 （美國Fisher公司）；磷酸為優(yōu)級純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Waters XBridgeTM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）；體積流量1.0 mL/min，梯度洗脫 （程序見表1）；柱溫30℃；檢測波長230 nm。結(jié)果見圖1。

表1　梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program s

圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.2對照品溶液的制備 分別精密稱取香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯、苯甲酸芐酯對照品適量，加甲醇制成含香草醛0.928 mg/mL、苯甲酸0.969 5 mg/mL、苯甲酸松柏酯3.277 mg/mL、苯甲酸芐酯0.415 5 mg/m L的對照品貯備液，置于冰箱中冷藏保存。再分別吸取適量，乙腈∶水 （50∶50）稀釋，制成含香草醛46.40μg/mL、苯甲酸96.95μg/mL、苯甲酸松柏酯327.70μg/mL、苯甲酸芐酯41.55μg/m L的混合對照品溶液，備用。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取安息香粉末（過3號篩）0.1 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20mL，超聲提取30min，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，少量甲醇多次洗滌，洗液合并，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍考察 精密量取混合對照品溶液20、15、10、8、5、2、1μL，在 “2.1”項色譜條件下進樣分析，每個進樣量進樣3次，記錄峰面積，并取平均值。以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），樣品進樣量為橫坐標(biāo) （X）進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2，表明在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2　4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.2 Standardcurvesoffourconstituents

2.4.2精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10μL，進樣6次，測定峰面積。結(jié)果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸芐酯RSD分別為0.94%、1.11%、1.06%、0.96%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、6、12、24、48h進樣分析。結(jié)果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸芐酯RSD分別為1.81%、2.04%、1.91%、2.79%，表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4重復(fù)性試驗 精密稱取安息香0.1g，共6份，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結(jié)果，香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯和苯甲酸芐酯含有量 RSD分別為1.56%、2.64%、1.75%、2.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率 精密稱取藥材0.05g，共6份，分別精密加入香草醛1.5mL、苯甲酸芐酯1mL。再精密稱取同一批安息香0.01g，共6份，分別精密加入苯甲酸1.5mL、苯甲酸松柏酯0.5mL，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液 （溶劑加入量為原加入量的1/5）進行測定，結(jié)果見表3。

2.5 “一測多評”耐用性和專屬性考察

2.5.1相對校正因子計算 參照文獻 ［12］的方法，以公式fk/s=（Ws×Ak）/（Wk×As）計算相對校正因子，待測成分的量以公式W′k=（Ws× A′k）/（fk/s×As）計算。其中，fk/s為相對校正因子，Ws為內(nèi)標(biāo)物含有量，As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為其他對照組分含有量，Ak為對照組分的峰面積，W′k為待測組分含有量，A′k為待測組分的峰面積。以苯甲酸松柏酯為內(nèi)標(biāo)，分別計算對香草醛、苯甲酸、苯甲酸芐酯的校正因子，結(jié)果見表4。

表3　加樣回收率試驗結(jié)果Tab.3 Resultsofrecoverytests

表4　相對校正因子Tab.4 Relativecorrectionfactors

2.5.2待測色譜峰的定位 以苯甲酸松柏酯為內(nèi)參峰，分別測得香草醛、苯甲酸、苯甲酸芐酯的平均相對保留時間為0.269、0.369、1.202。

線性回歸色譜峰定位法［13-14］以Agi1ent1200儀器使用的Waters柱為標(biāo)準(zhǔn)柱，選擇苯甲酸和苯甲酸松柏酯的保留時間作為橫坐標(biāo) （A），對應(yīng)其他儀器及色譜柱苯甲酸和苯甲酸松柏酯的保留時間為縱坐標(biāo) （B）繪制回歸方程，進行相應(yīng)色譜峰定位。結(jié)果見表5。

表5　色譜峰定位結(jié)果Tab.5 Results of chromatographic peak positioning

2.6HPLC-DAD法與一測多評法比較 吸取對照品及供試品溶液各10μL（個別批次稀釋后測定），注入HPLC色譜儀測定。HPLC-DAD法和一測多評法計算藥材中香草醛、苯甲酸、苯甲酸松柏酯及苯甲酸芐酯含有量，結(jié)果見表6。

表6　測定結(jié)果比較 （%）Tab.6 Com parison of determ ination results（%）

測定結(jié)果用Pearson相關(guān)系數(shù)進行比較，測得香草醛的相對誤差為-0.98%～0%，Pearson相關(guān)系數(shù)值為0.999 982；苯甲酸相對誤差為0.90%～3.49%，Pearson相關(guān)系數(shù)值為0.999 920；苯甲酸芐酯相對誤差為-0.70%～0%，Pearson相關(guān)系數(shù)值為 0.999 946；總量相對誤差為 0.15% ～1.00%，Pearson相關(guān)系數(shù)值為0.999 982，表明兩種方法無顯著差異。

3　討論

苯甲酸松柏酯為安息香中重要的活性成分［9］，據(jù)文獻報道其含有量可達15%以上，經(jīng)初步試驗表明，其顏色在一定條件下由白色逐漸變深，與《中國藥典》2015版記載安息香藥材斷面為白色，放置后逐漸變?yōu)榈S色至紅棕色［1］基本一致，因此，以苯甲酸松柏酯為指標(biāo)來控制安息香藥材質(zhì)量具有重要意義。

本實驗首次采用HPLC-DAD法同時測定了安息香中4個總香脂酸類成分的含有量，發(fā)現(xiàn)香草醛在0.714%～2.62%之間，苯甲酸在2.94%～15.63%之間，苯甲酸松柏酯在12.65%～62.59%之間，苯甲酸芐酯在0.474%～2.03%之間。隨著存放年限的增加，15批樣品中苯甲酸含有量逐漸升高，而苯甲酸松柏酯降低。因此，控制安息香質(zhì)量采用多指標(biāo)時更能反應(yīng)該藥材的真實情況。

在一測多評法研究中，本實驗考察了相對校正因子法和斜率校正法［10-11］，發(fā)現(xiàn)前者計算結(jié)果與HPLC-DAD法基本一致，而后者誤差較大，故采用相對校正因子法進行實驗。

另外，還考察了Agi1ent1200和SSISeries1500兩種HPLC系統(tǒng)，以及4根色譜柱，同時在不同實驗室進行了復(fù)核實驗。結(jié)果，苯甲酸松柏酯對香草醛、苯甲酸和苯甲酸芐酯的平均相對校正因子分別為1.09、1.10和1.05，RSD分別為3.41%、3.63%和2.32%，表明以苯甲酸松柏酯為內(nèi)參物所測定的相對校正因子較為穩(wěn)定，一測多評法具有可行性。

經(jīng)Pearson檢驗，一測多評法與HPLC-DAD法測定結(jié)果無顯著差異，表明一測多評法可用于安息香中總香脂酸的質(zhì)量控制。另外，該方法可降低檢測成本和時間，而且苯甲酸松柏酯作為內(nèi)參物具有專屬性，能夠?qū)崿F(xiàn)一個對照品在同一波長下對多個成分進行同時測定，能夠滿足基層藥檢的需求。在實際應(yīng)用中，可視具體情況選擇HPLC-DAD法或一測多評法。

同時，本實驗研究了保留時間差法、相對保留時間法以及線性回歸色譜峰定位法來對待測色譜峰進行定位。結(jié)果表明，保留時間差法在不同色譜柱重復(fù)性較差；相對保留時間法能夠進行色譜峰定位；線性回歸色譜峰定位法最為準(zhǔn)確，但需使用2種對照品，與一測多評的初衷不符，而且相對保留時間法結(jié)合色譜圖及紫外吸收特征，也能準(zhǔn)確進行色譜峰定位。因此，可優(yōu)先采用相對保留時間法，若該方法不能準(zhǔn)確定位色譜峰，則可進一步考慮線性回歸色譜峰定位法。

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Simultaneous determ ination of four constituents in Styrax tonkinensis by HPLCDAD and QAMS

HU Pan， XIA Hou-1in*， WEN Bing-jie， LIRui-yu， YANGMeng-ni， ZHANG Hui
（Schoolof Pharmacy，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine；Key Laboratory for Standardization ofChineseMateria Medica，Ministry of Education，Chengdu 611137，China）

AIM To estab1ish high performance 1iquid chromatography with diode array detection（HPLCDAD）and quantitative ana1ysisofmu1ti-components by sing1emarker（QAMS）methods for the simu1taneous determination of contents of vani11in，benzoic acid，conifery1benzoate and benzy1benzoate in Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart..METHODS HPLC-DAD was app1ied to simu1taneous1y determining the contents of these four constituents.The re1ative correction factors of conifery1benzoate to another three constituentswere ca1cu1ated.The effects of re1ative retention time and 1inear regression methods on positioning chromatographic peakswere investigated.And the reproducibi1itieswere then compared.RESULTS In fifteen batches of samp1es，the contents of vani11in，benzoic acid，conifery1 benzoate and benzy1 benzoate were 0.692%-2.621%，2.944%-15.628%，12.649%-62.589%and 0.514%-2.034%，respective1y.Linear regression method showed its superioty in accuracy as compared with re1ative retention time method.The reproducibi1ities of three re1ative correction factors were good.And these twomethods demonstrated no significant difference.CONCLUSION QAMS can be used for determining tota1ba1samic acids in S.tonkinensis.

Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart.；vani11in；benzoic acid；conifery1 benzoate；benzy1 benzoate；HPLC-DAD；QAMS

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1274-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.015

2015-10-28

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 （973計劃）項目 （2007CB512606）

胡 攀（1989—），男，碩士，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Te1：18224427340，E-mai1：hupanmai1@foxmai1.com

夏厚林 （1964—），男，教授，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Te1：13568899011，E-mai1：xh164@163.com