可溶性CD40配體對(duì)K562細(xì)胞增殖及生存素mRNA 和IL-8表達(dá)的影響*

封忠昕，吳燕梅，陳　琦，肖建輝，馮　進(jìn)（.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 遵義563003；.荷澤市立醫(yī)院老年科，山東703；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，貴州遵義563003；.貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義563003）

·論著·

可溶性CD40配體對(duì)K562細(xì)胞增殖及生存素mRNA 和IL-8表達(dá)的影響*

封忠昕1，吳燕梅2，陳琦3△，肖建輝4，馮進(jìn)1
（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 遵義563003；2.荷澤市立醫(yī)院老年科，山東274031；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，貴州遵義563003；4.貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義563003）

目的探究可溶性CD40配體（sCD40L）對(duì)人白血病K562細(xì)胞增殖、生存素（survivin）mRNA表達(dá)和白介素8（IL-8）表達(dá)水平的影響。方法采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測sCD40L對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響，通過RT-PCR檢測survivin mRNA表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定IL-8表達(dá)情況。結(jié)果不同濃度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL）對(duì)K562細(xì)胞增殖均有抑制作用，且可降低survivin mRNA及IL-8的表達(dá)水平；sCD40L細(xì)胞組細(xì)胞增殖抑制率高于K562細(xì)胞組，survivin mRNA及IL-8表達(dá)水平均低于K562細(xì)胞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量-時(shí)間依賴性。結(jié)論sCD40L在體外能夠明顯抑制K562細(xì)胞增殖，具有劑量-時(shí)間依賴性，sCD40L抑制K562細(xì)胞增殖可能與survivin mRNA及IL-8表達(dá)水平下調(diào)相關(guān)。

K562細(xì)胞；細(xì)胞增殖；survivin基因；白細(xì)胞介素8；可溶性CD40配體

慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronicmyelocyticleukemia，CML）是一種常見的骨髓異常增殖性血液惡性腫瘤，臨床主要表現(xiàn)為脾大，易見Ph染色體和BCR-ABL融合基因，可分為慢性期、加速期和急變期。伊馬替尼是第一個(gè)治療CML的靶向藥物，但其越來越嚴(yán)重的耐藥性成為臨床和科研需要面對(duì)的極大挑戰(zhàn)［1-3］，因此，對(duì)CML的生物學(xué)研究是較為熱門的課題。

可溶性CD40配體（sCD40L）屬于腫瘤壞死因子（TNF）基因超家族成員之一，其在腫瘤細(xì)胞抗原遞呈等方面發(fā)揮著重要作用。sCD40L可顯著抑制B淋巴細(xì)胞白血病及多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖，使腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)G1期阻滯，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［4-5］。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的sCD40L干預(yù)HL-60細(xì)胞時(shí)，CD95表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)，其原因可能是通過死亡受體途徑和線粒體途徑促進(jìn)凋亡［6］。本研究通過測定生存素（survivin）mRNA及細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中白介素 8（IL-8）的表達(dá)水平，探討不同濃度sCD40L對(duì)人白血病K562細(xì)胞的影響，從而探討其可能的作用機(jī)制，為人重組sCD40L能否應(yīng)用于白血病的治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人白血病K562細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞資源中心），胎牛血清和RPMI1640（美國Gibico公司），sCD40L（以色列ProSpec公司），RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒及survivin引物（TaKaRa生物工程公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組（1）K562細(xì)胞組：不加任何藥物干預(yù)組；（2）sCD40L細(xì)胞組：sCD40L濃度分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL；（3）空白調(diào)零組：僅加入 RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%FBS）。

1.2.3噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞（細(xì)胞活力大于90%）加入96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞1×105（100 μL），總體積為200 μL。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，用完全培養(yǎng)液（RPMI1640培養(yǎng)液加10%FBS）調(diào)整培養(yǎng)體積200 μL，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在終止培養(yǎng)前4h每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，培養(yǎng)終止后棄上清液，每孔用150μL二甲基亞砜（DMSO）溶解甲臢顆粒，輕輕振搖10 min，測定光密度（OD）值，檢測波長570 nm。計(jì)算公式：抑制率=（1-sCD40L細(xì)胞組OD值）/K562細(xì)胞組OD值×100%。

1.2.4survivin mRNA表達(dá)水平測定按照說明書提取各濃度、各時(shí)間段的細(xì)胞RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系：5×Prime ScriptTMBuffer（for Real Time）6.0 μL，Prime Script TMRT Enzyme MixⅠ1.5 μL，Random 6 mers （100 μmol/L）1.5 μL，Oligo Dt Primer（50 μmol/L）1.5 μL，TotalRNA 19.5 μL，總體積30 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件37℃15min，85℃5 s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA放置-20℃冰箱保存。按照說明書進(jìn)行RT-PCR，取1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：SYBR? Premix Ex TaqTM10 μL，引物混合液（上、下游引物）1 μL，0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）8 μL，總體積20 μL。預(yù)變性95℃30 s 1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。survivin（NM_00101 2271.1）：上游引物5′-GTCTGGCGTAAGATGATGGATTTG-3′，下游引物3′-CACAGCAGTGTTTGAAATGACAGG-5′；β-actin（NM_ 001101.3）：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGATGAA-3′，下游引物3′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5′。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△Ct相對(duì)值計(jì)算mRNA表達(dá)情況。

1.2.5IL-8水平測定嚴(yán)格按照IL-8 ELISA試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行操作。酶標(biāo)包被板上分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液、稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品上清液各100 μL，每孔均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在37℃反應(yīng)120min，加入一抗，37℃反應(yīng)60min，洗滌后加入酶標(biāo)抗體工作液，37℃反應(yīng)30 min，洗滌后加入底物工作液，37℃反應(yīng)15 min，最后加入終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測吸光度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1sCD40L對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響不同濃度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL）作用K562細(xì)胞24、48、72 h后，隨著sCD40L濃度的增加及作用時(shí)間的延長，K562細(xì)胞增殖抑制率隨之升高，且與K562細(xì)胞組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　sCD40L不同作用時(shí)間對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制情況（±s，%，n=5）

表1　sCD40L不同作用時(shí)間對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制情況（±s，%，n=5）

注：與K562細(xì)胞組比較，aP＜0.05。

組別2 4 h 　4 8 h 　7 2 h K 5 6 2細(xì)胞組s C D 4 0 L細(xì)胞組（μ g / m L ）0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 0 . 0 0 ± 0 . 0 0 8 . 9 6 ± 0 . 2 3a1 8 . 5 6 ± 0 . 7 2a2 6 . 8 7 ± 0 . 6 5a3 9 . 3 1 ± 0 . 5 8a5 4 . 2 6 ± 0 . 9 6a3 . 1 2 ± 0 . 1 5a9 . 2 5 ± 0 . 5 3a1 4 . 0 3 ± 0 . 2 2a2 2 . 3 3 ± 0 . 2 7a3 2 . 1 7 ± 0 . 3 9a6 . 2 3 ± 0 . 2 7a1 3 . 7 2 ± 0 . 3 4a2 0 . 5 6 ± 0 . 4 3a2 8 . 7 9 ± 0 . 3 2a4 1 . 3 6 ± 0 . 7 6a

2.2sCD40L對(duì)K562細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)水平的影響不同濃度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL）作用K562細(xì)胞24、48、72 h后，隨著sCD40L濃度的增加及作用時(shí)間的延長，survivin mRNA表達(dá)水平隨之降低，與K562細(xì)胞組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　sCD40L不同作用時(shí)間對(duì)K562細(xì)胞survivinmRNA表達(dá)水平的影響（±s，n=5）

表2　sCD40L不同作用時(shí)間對(duì)K562細(xì)胞survivinmRNA表達(dá)水平的影響（±s，n=5）

注：與K562細(xì)胞組比較，aP＜0.05。

組別2 4 h 　4 8 h 　7 2 h K 5 6 2細(xì)胞組s C D 4 0 L細(xì)胞組（μ g / m L ）0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 1 0 3 1 . 5 4 ± 7 7 . 6 3 1 0 6 3 . 6 2 ± 6 5 . 9 1 1 2 9 8 . 2 3 ± 7 7 . 1 0 1 0 4 1 . 7 1 ± 7 1 . 2 5a9 6 8 . 1 7 ± 5 5 . 9 4a8 9 7 . 0 5 ± 5 8 . 2 2a7 3 5 . 9 2 ± 5 0 . 3 8a5 4 6 . 5 3 ± 2 6 . 7 8a9 6 0 . 0 3 ± 6 1 . 7 6a8 6 2 . 6 5 ± 4 7 . 8 5a7 6 9 . 1 2 ± 2 9 . 9 3a6 0 5 . 4 5 ± 3 2 . 0 5a4 6 7 . 3 2 ± 1 4 . 5 9a9 9 3 . 9 7 ± 5 9 . 4 4a9 0 1 . 2 1 ± 6 6 . 3 2a8 4 6 . 3 6 ± 5 6 . 6 1a6 7 3 . 1 6 ± 4 4 . 6 7a4 9 8 . 6 4 ± 5 2 . 1 3a

2.3sCD40L對(duì)K562細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8表達(dá)水平的影響不同濃度的sCD40L（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg/mL）作用K562細(xì)胞24、48、72 h后，隨著sCD40L濃度的增加及作用時(shí)間的延長，IL-8表達(dá)水平隨之降低，與K562細(xì)胞組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3　sCD40L對(duì)K562細(xì)胞IL-8表達(dá)水平的影響（±s，n=5）

表3　sCD40L對(duì)K562細(xì)胞IL-8表達(dá)水平的影響（±s，n=5）

注：與K562細(xì)胞組比較，aP＜0.05。

組別2 4 h 　4 8 h 　7 2 h K 5 6 2細(xì)胞組s C D 4 0 L細(xì)胞組（μ g / m L ）0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 1 0 3 1 . 5 4 ± 7 7 . 6 3 1 0 6 3 . 6 2 ± 6 5 . 9 1 1 2 9 8 . 2 3 ± 7 7 . 1 0 1 0 4 1 . 7 1 ± 7 1 . 2 5a9 6 8 . 1 7 ± 5 5 . 9 4a8 9 7 . 0 5 ± 5 8 . 2 2a7 3 5 . 9 2 ± 5 0 . 3 8a5 4 6 . 5 3 ± 2 6 . 7 8a9 6 0 . 0 3 ± 6 1 . 7 6a8 6 2 . 6 5 ± 4 7 . 8 5a7 6 9 . 1 2 ± 2 9 . 9 3a6 0 5 . 4 5 ± 3 2 . 0 5a4 6 7 . 3 2 ± 1 4 . 5 9a9 9 3 . 9 7 ± 5 9 . 4 4a9 0 1 . 2 1 ± 6 6 . 3 2a8 4 6 . 3 6 ± 5 6 . 6 1a6 7 3 . 1 6 ± 4 4 . 6 7a4 9 8 . 6 4 ± 5 2 . 1 3a

3　討　論

CML是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，也是臨床上常見的血液惡性腫瘤，病情進(jìn)展緩慢，臨床表現(xiàn)主要為脾大、低熱、乏力、盜汗、體質(zhì)量減輕等。CML在各年齡段均可發(fā)病，以中年居多，且男性多于女性，一般中位生存期為3～4年，對(duì)于CML的治療及其分子生物學(xué)研究是較為熱門的方向。

CD40L主要來源于血小板、B細(xì)胞、T細(xì)胞等，可分為sCD40L和膜結(jié)合型CD40配體2種［7］。sCD40L主要來源于血小板和T淋巴細(xì)胞。sCD40L是由膜結(jié)合型CD40配體裂解而成的，相對(duì)分子質(zhì)量為18×103，主要以活化三聚體的形式存在，通常認(rèn)為該配體存在2個(gè)功能區(qū)：一個(gè)是賴氨酸-精氨酸-谷氨酸（KGD）序列，其與血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體相結(jié)合；另一個(gè)是TNF同源結(jié)構(gòu)域，其與CD40相結(jié)合［8］。對(duì)于sCD40L的研究多集中于肺癌、胃癌等實(shí)體瘤。劉珊等［9］將sCD40L聯(lián)合長春瑞濱作用于肺腺癌A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sCD40L可抑制A549細(xì)胞的體外增殖，但不顯著增加長春瑞濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，且對(duì)周期時(shí)相影響不大，推測其可能是通過凋亡及周期抑制以外的其他機(jī)制影響長春瑞濱對(duì)A549細(xì)胞的作用。但也有學(xué)者持不同觀點(diǎn)，王天立等［10］將sCD40L作用于肺腺癌A549細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，sCD40L可引起A549細(xì)胞的生長抑制、細(xì)胞周期和表型改變，并可引起部分凋亡基因表達(dá)的改變。Li等［4］將sCD40L作用于胃癌細(xì)胞株AGS和BGC-823，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控可能成為治療胃癌的新手段。Aldinucci等［12］認(rèn)為，sCD40L為B細(xì)胞惡性腫瘤提供了一種新的靶向治療可能。本研究表明，各濃度的sCD40L作用24、48、72 h后，細(xì)胞增殖抑制率均較K562細(xì)胞組明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以2.5 μg/mL sCD40L作用72 h抑制率最顯著，提示sCD40L能夠抑制K562細(xì)胞增殖，且呈劑量-時(shí)間依賴性，因此可能具有抗白血病效應(yīng)。有研究表明，CD40抗原與其配體CD40L配基化作用，可促進(jìn)慢性B淋巴白血病細(xì)胞的抗凋亡基因survivin mRNA表達(dá)，也有研究發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞在CD40刺激下可分泌趨化因子IL-8、IL-12等［5，11］。

survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）中相對(duì)分子質(zhì)量最小的新成員，在正常的成熟組織中不表達(dá)或低表達(dá)。在病理狀態(tài)下，survivin廣泛表達(dá)于人類各種惡性腫瘤組織中，如胃癌、大腸癌、白血病和淋巴瘤等［12-13］。

本研究表明，不同濃度sCD40L作用于K562細(xì)胞24、48、72 h后，survivin mRNA表達(dá)水平較K562細(xì)胞組均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且以2.5 μg/mL sCD40L作用72 h時(shí)survivin mRNA表達(dá)水平最低，具有劑量-時(shí)間依賴性，說明sCD40L在體外能夠抑制K562細(xì)胞增殖可能與survivin mRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)，這一結(jié)果與小檗堿（黃連素）和甘珀酸能減少K562細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)一致［14-15］。

IL-8最初被命名為粒細(xì)胞激活因子，后被證實(shí)其性質(zhì)為IL，屬于CXC類趨化因子。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-8在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤的血管形成、生長，腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等密切相關(guān)［16-17］。而本研究結(jié)果顯示，sCD40L作用于K562細(xì)胞24、48、72 h后，IL-8的表達(dá)水平較K562細(xì)胞組均有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以2.5 μg/mL sCD40L作用72 h時(shí)IL-8表達(dá)水平降低，且具有劑量-時(shí)間依賴性，推測sCD40L在體外能夠抑制K562細(xì)胞增殖，可能與IL-8表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

總之，不同濃度的sCD40L作用于K562細(xì)胞24、48、72 h后細(xì)胞增殖抑制率均有所上升，survivin mRNA和IL-8表達(dá)水平均有所下調(diào)，均具有劑量-時(shí)間依賴性，提示sCD40L對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制可能與survivin mRNA及IL-8的表達(dá)下調(diào)有關(guān)，推測sCD40L有可能成為CML治療的新思路。然而，本研究僅對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞進(jìn)行研究，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)和細(xì)胞種類有限，具有一定局限性。因此，sCD40L在體內(nèi)抗CML效果如何，是否產(chǎn)生耐藥性等諸多問題需得進(jìn)一步探討。

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Effect of soluble CD40 ligand on proliferation of K562 cells and expression level of survivin mRNA*

Feng Zhongxin1，WuYanmei2，Chen Qi3△，Xiao Jianhui4，F(xiàn)eng Jin1（1.Department of Clinical Laboratory，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Department of Geriatrics，Heze Municipal Hospital，Heze，Shandong 274031，China；3.Department of Hematology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；4.Guizhou Provincial Key Laboratory of Cellular Engineering，Zunyi，Guizhou 563003，China）

ObjectiveTo investigate the effect of soluble CD40 ligand（sCD40L）on the proliferation of human leukemia K562 cells and expression levels of surviving mRNA and IL-8.MethodsThe MTT assay was used to examine the effect of different concentrations of sCD40L on the cellular proliferation，RT-PCR was used to determine the expression level of survivin mRNA；ELISA was used to detect the IL-8 expression.ResultsDifferent concentrations of sCD40L（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μg/mL）all had the inhibiting effect on K562 cell proliferation，moreover could decrease the expression levels of survivin and IL-8；the cellular proliferation inhibiting rate of the sCD40L cell group was higher than that of the K562 cell group，while the expression levels of surviving mRNA and IL-8 were lower than those in the K562 cell group，the difference was statistically significant（P＜0.05），moreover which showed the dose and time dependent manner.ConclusionsCD40L can significantly inhibit the proliferation of K562 cells in vitro with the dose and time dependent manner，sCD40L inhibiting the K562 cell proliferation is correlated with the down-regulation of surviving mRNA and IL-8 expression.

K562 cells；Cell proliferation；Survivin gene；Interleukin-8；Soluble CD40 ligand

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.001

A

1009-5519（2016）04-0481-03

貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合SY字［2014］3025號(hào)）。

封忠昕（1978-），碩士研究生，主要從事惡性血液病的診治工作。

△，E-mail：zyfychenqi@163.com。

（2015-04-21

2015-09-01）