榅桲總黃酮對過氧化氫誘導人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用研究

古再努爾·買買提， 阿爾孜古麗·吐爾遜， 阿迪力·阿不都熱合曼， 周文婷，鄔利婭·伊明， 艾尼瓦爾·吾買爾

(新疆醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院藥理教研室， 烏魯木齊　830011； 2第一附屬醫(yī)院科研中心, 烏魯木齊　830054)

?

·基礎醫(yī)學研究·

榅桲總黃酮對過氧化氫誘導人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用研究

古再努爾·買買提1， 阿爾孜古麗·吐爾遜2， 阿迪力·阿不都熱合曼1， 周文婷1，鄔利婭·伊明1， 艾尼瓦爾·吾買爾1

(新疆醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院藥理教研室， 烏魯木齊830011；2第一附屬醫(yī)院科研中心, 烏魯木齊830054)

目的研究榅桲總黃酮 (TFCOM) 對過氧化氫(H2O2) 誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC) 氧化損傷和凋亡的保護作用及機制。方法體外培養(yǎng)HUVEC，分為正常對照組、H2O2模型組(10 μmol/L)和TFCOM低濃度 (10 μg/mL)、中濃度 (20 μg/mL)、高濃度 (40 μg/mL)干預組。在建立H2O2氧化損傷模型的基礎上，采用MTT法檢測HUVEC活力，流式細胞儀和Hochest33258熒光染色法檢測細胞凋亡率，觀察HUVEC的周期變化。結果榅桲總黃酮干預組細胞形態(tài)介于正常對照組與H2O2模型組，并隨著藥物濃度的增高，細胞形態(tài)改善更加明顯，與H2O2模型組比較,細胞間隙縮小，細胞間連接增加，邊界較清楚。TFCOM能對抗H2O2誘導引起的細胞凋亡，能促進HUVEC增殖分化，TFCOM低濃度組變化與H2O2模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，但中、高濃度組細胞存活率逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。榅桲總黃酮低、中、高濃度能夠促進細胞DNA合成，與H2O2模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。正常對照組細胞的早期凋亡率為3.4%，H2O2模型組細胞的早期凋亡率為19.2%，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TFCOM低、中、高濃度組的早期凋亡率為16.7%、12.6%、6.1%， 與H2O2模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論TFCOM可抑制H2O2誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，減輕H2O2對內(nèi)皮細胞的損傷作用，可明顯降低H2O2對血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷。

榅桲總黃酮； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； 過氧化氫； 氧化損傷

維藥比葉(Biye)，在新疆又名別木梨，英文名Quince，統(tǒng)稱為“榅桲”[1]。榅桲(Cydonia Oblanga Mill，COM)是薔薇科(Rsaceae)楹槨屬(Cydonia)的果樹，榅桲是新疆維吾爾醫(yī)藥領域中具有獨特療效、濃郁的地方民族傳統(tǒng)藥材。榅桲總黃酮 (TFCOM) 為榅桲果實的提取物，榅桲果實中含有豐富的黃酮類化合物和人體必需的微量元素，總黃酮含量>60%[2]。以往研究結果證實，榅桲提取物具有補腦益心、降壓、降脂、降糖、抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫、止瀉、利尿等藥理作用，但對其防止心血管系統(tǒng)疾病的機制研究尚未闡明[3-8]。處于功能障礙狀態(tài)下的內(nèi)皮細胞能直接或間接地反映某種程度上的氧化，同時內(nèi)皮細胞損傷和功能障礙加快了動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展，成為動脈粥樣硬化(As)形成的開始[9]。本實驗采用體外培養(yǎng)細胞的方法，人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC) 直接被H2O2損傷并建立模型，初步探究TFCOM對HUVEC氧化損傷的保護作用及抗凋亡功能的機制，為榅桲的進一步開發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。

1　試劑與儀器

1.1主要試劑HUVEC 由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院科研中心細胞室提供，過氧化氫(H2O2，批號：BCBN6035V)、二甲基亞砜 (DMSO，批號：Q2259)、四甲基偶氮唑鹽 (MTT，批號：M5178)、胰蛋白酶(批號：J150031)均購于美國Sigma公司，M199培養(yǎng)基(批號：NAC1355)、胎牛血清(批號：41G5741K)均為美國Gibco公司產(chǎn)品，PBS(批號：NAH1444)、雙抗(批號：J150023)均為美國HyClone公司產(chǎn)品，Annexin V-FITC/-AAD試劑盒(批號：4293719，為美國BD公司產(chǎn)品)，檢測周期的試劑盒(批號：4220918,南京凱基生物科技有限公司)，Hoechst33258熒光染色試劑盒(批號：20151218)，4%多聚甲醛(批號：20151103，為博世德生物科技有限公司產(chǎn)品)。

1.2儀器酶標儀Benchmark PLUS(美國BIO-RAD公司)，CO2培養(yǎng)箱371型(美國Thermo公司)，超凈臺SW-CJ-2F(上海智域分析儀器公司)，倒置顯微鏡IX71-12FL/PH (日本Olympus公司)，離心機 BR4i型(美國Beckman公司)，微量進樣器(德國Eppendorf公司)，超純水儀MILLI-Q BIOCEL(美國Millipore公司)，電子天平TP114(北京Scotsman公司)，恒溫水浴鍋DK8D(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，流式細胞儀FACSAriaII(美國Beckman公司)，全自動細胞計數(shù)儀及計數(shù)板2C08351P (Korea)。

2　方法與結果

2.1榅桲總黃酮的制備榅桲葉采摘自新疆喀什地區(qū)葉城縣，榅桲總黃酮由新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理教研室制備。制備方法：榅桲葉用水洗凈，55℃鼓風干燥48 h，冷卻后粉碎過篩，采用索式提取器石油醚脫脂2 h，藥渣揮干溶劑，真空干燥。干燥藥渣以30倍量60%乙醇超聲提取3次，每次40 min，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥得榅桲葉總黃酮粗品?？傸S酮粗粉加水溶解，過濾，濾液先經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂分離、乙醇洗脫、收集洗脫液、減壓蒸餾得濃縮液。濃縮液再經(jīng)聚酰胺樹脂分離、乙醇洗脫、收集洗脫液、減壓蒸餾得濃縮液、冷凍干燥后得到榅桲葉總黃酮的精制品，備用。采用分光光度法測定其含量，榅桲總黃酮純度>60%。

2.2H2O2濃度的測定采用30%H2O2細胞培養(yǎng)時，先用超純水配成1 mmol/L的H2O2，用M199培養(yǎng)液稀釋使用。

2.3HUVEC的培養(yǎng)從-80℃冰箱中取出HUVEC，放進37℃水浴鍋里快速振搖，在1～2 min內(nèi)解凍并離心。離心后將細胞懸液移到25 mL培養(yǎng)瓶中并加入5 mL含10%FBS的M199培養(yǎng)液，輕輕搖勻后放入37℃、 95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察細胞的生長情況，過夜后換1次培養(yǎng)液。細胞生長至可傳代培養(yǎng)細胞時，經(jīng)酶消化法加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，并按1∶2或1∶3傳代。

2.4生長曲線取對數(shù)生長期細胞以5×104/mL細胞/孔接種于96孔板中，隔日換液，連續(xù)10 d觀察細胞的生長情況。

2.5實驗方法和計量分組待細胞生長至80%～90%融合成單層時進行實驗，實驗設5組：正常對照組、H2O2模型組(10 μmol/L)及TFCOM低濃度(10 μg/mL)、中濃度(20 μg/mL)、高濃度(40 μg/mL)干預組，先加TFCOM干預24 h后再加入終濃度為10 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后進行有關指標的測定。

2.6MTT法檢測細胞按1×105/mL密度接種于96孔板中，每孔加入含10%FBS的M199培養(yǎng)液100 μL，每組設 6個復孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。正常對照組和H2O2模型組僅加M199培養(yǎng)液，藥物干預組分別加入不同濃度的榅桲總黃酮干預24 h后，藥物干預組和H2O2模型組同時每孔加入現(xiàn)配制的終濃度為10 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液100 μL，輕輕搖蕩，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h；鏡下觀察后每孔細胞加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去各孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的 DMSO溶液，充分振蕩10 min，使MTT溶液反應的藍紫色結晶甲瓚完全溶解，用全自動酶標儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度(OD值)。實驗結果以OD值或抑制率表示。 抑制率(%)=(對照組OD-實驗組OD)/對照組OD×100%。

2.7細胞周期檢測將細胞按5×105/mL密度接種于小皿(分組與處理同上)。用0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加PBS洗滌細胞2次，加預冷的70%乙醇并均勻吹打，制備細胞懸液，在4℃冰箱避光過夜，固定后再次離心并PBS清洗2次，徹底除盡乙醇。加1 mL碘化丙啶染液(propidine iodide，PI)使細胞懸浮于染液中，室溫避光30 min，染色后用300目篩網(wǎng)過濾，檢測細胞周期的變化。

2.8凋亡率檢測將細胞按1×106/mL密度接種于小皿(分組與處理同上)。藥物處理后的細胞棄去培養(yǎng)基，加PBS洗1次，收集細胞，加0.25%胰蛋白酶1 mL消化，制成細胞懸液后以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加PBS洗滌細胞2次，再次以同樣的條件離心。加入5 μL Annexin V-FITC試劑和5 μL 7-AAD，輕輕震搖混勻，每管加入500 μL的1×binding buffer，室溫(25℃)避光15 min，染色后用300目篩網(wǎng)過濾，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

2.9Hochest 33258熒光染色將細胞按5×105/mL密度接種于6孔板中(每孔2 mL，每組設3個復孔)，細胞分組與處理同前。藥物處理后的細胞棄去培養(yǎng)基，加PBS洗2次，用4%多聚甲醛 (4℃，15～20 min) 固定，棄除固定液，加PBS洗2次，每孔加入1 mL Hochest 33258(濃度為20 μg/mL)染色液，室溫避光染色10 min后，熒光顯微鏡200倍下隨機取3個視野(激發(fā)波長350 nm左右，發(fā)射波長460 nm左右)，觀察各組呈藍色細胞核的細胞、熒光情況并進行拍照。

2.10生長曲線細胞接種后的前2 d生長較慢，但從第3天開始生長加快，細胞數(shù)量顯著增多，第3～4天細胞進入對數(shù)生長期，第6～7天進入平臺期。故選用第3天為最佳加藥時間，見圖1。

2.11TFCOM對H2O2氧化損傷HUVEC形態(tài)學改變的影響(1)正常對照組：細胞生長快，大小相等，細胞質飽滿透亮，呈多角形緊密連接狀；貼壁堅固，胞核完好，邊界清楚，呈單層 “鋪路石” 狀排列，沒有重疊生長現(xiàn)象。(2)H2O2模型組：經(jīng)10 μmol/L H2O2作用細胞后，數(shù)量明顯減少，多數(shù)損傷的細胞出現(xiàn)核收縮，胞體變圓變小，間隙增寬，邊界不清，胞膜不完整，甚至損傷破裂，貼壁能力降低，導致成片狀細胞脫落區(qū)，培養(yǎng)板底部可以見到細胞碎片。(3)TFCOM干預組：細胞形態(tài)介于對照組與H2O2模型組，并隨著藥物濃度的增高，細胞形態(tài)改善更加明顯，與H2O2模型組比較細胞間隙縮小，細胞間連接增加，邊界較清楚，TFCOM低、中、高濃度均可減輕H2O2氧化損傷后的細胞形態(tài)和排列及增殖能力，見圖2。

正常對照組(×10倍)

正H2O2模型組(×10倍)

TFCOM高濃度組(×10倍)

圖2TFCOM對H2O2氧化損傷HUVEC細胞形態(tài)學的影響

2.12MTT法對HUVEC細胞的影響用不同濃度的H2O2刺激HUVEC，隨著H2O2濃度的升高細胞存活率急劇下降，當H2O2濃度達到10 μmol/L時，H2O2對HUVEC細胞造成適宜的損傷且細胞存活率為50% 左右，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。因此選用濃度為10 μmol/L的H2O2進行后續(xù)實驗。用TFCOM低、中、高3個不同濃度給藥時，TFCOM能對抗H2O2誘導引起的細胞凋亡，能促進HUVEC增殖分化，TFCOM低濃度組變化與H2O2模型組相比差異無統(tǒng)計學意義，但TFCOM中、高濃度組細胞存活率逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，結果見表1。

組別劑量/(μmol/L)ODIR/%正常對照組-0.184±0.009-H2O2模型組100.121±0.005##38.8TFCOM低濃度組100.128±0.00830.5TFCOM中濃度組200.134±0.001*24.1TFCOM高濃度組400.140±0.003**19.1

注：與H2O2模型組比較，*P<0.05，**P<0.01； 與正常對照組比較，##P<0.01

2.13細胞周期比較結果從細胞周期分析看，10 μmol/L的H2O2可引起G0/G1期細胞比值增高，S期細胞比值下降，即細胞DNA合成的量減少。加入低、中、高3個不同濃度的TFCOM干預后G0/G1期細胞比值有所下降，S期細胞和G2/M期細胞比值有不同程度的增加，TFCOM低、中、高濃度組與H2O2模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，結果見表2、圖3。

2.14凋亡率檢測正常對照組細胞的早期凋亡率為3.4%，經(jīng)10 μmol/L H2O2作用后模型組細胞的早期凋亡率為19.2%，與正常對照組相比內(nèi)皮細胞的早期凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TFCOM作用后HUVEC均能逆轉H2O2引起的細胞凋亡，TFCOM低、中、高濃度組HUVEC的早期凋亡率分別為16.7%、12.6%、6.1%，與H2O2模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著藥物的濃度增高，凋亡率降低，且呈一定的濃度依賴性，見圖4。

表2　各組HUVEC細胞周期比較(%, ±s, n=6)

注：與H2O2損傷組比較，*P<0.05，**P<0.01； 與正常對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.15Hochest33258熒光染色Hoechst33258是一種與DNA特異結合并能穿透細胞膜的藍色熒光染料，對凋亡細胞發(fā)生染色，而對正常細胞的染色較慢。熒光染色顯示，正常細胞核呈彌散均勻熒光，凋亡細胞因發(fā)生染色質凝聚而被濃染，可見濃染致密的顆粒狀熒光強度很高的藍色亮點。細胞熒光染色結果：(1)正常對照組：細胞核完整而呈橢圓形， 出現(xiàn)的熒光強度很弱，幾乎無凋亡的細胞；(2)H2O2模型組：加入10 μmol/L H2O2處理后，HUVEC細胞變圓，細胞核發(fā)生變化，呈核體積變小、大小不等、染色不均勻等明顯的凋亡特征，呈濃縮致密的顆粒狀或塊狀強度高的藍色熒光，大部分細胞發(fā)生凋亡；(3)TFCOM干預組：經(jīng)低、中、高3個不同濃度的TFCOM干預后熒光強度發(fā)生改變，隨著藥物濃度的增高，高濃度組熒光強度明顯減弱，出現(xiàn)的藍色亮點數(shù)目變少，藥物干預組凋亡細胞明顯少于H2O2模型組。榅桲總黃酮對H2O2導致的凋亡具有一定的拮抗作用，見圖5。

正常對照組

H2O2模型組

TFCOM低濃度組

TFCOM中濃度組TFCOM高濃度組

圖3TFCOM對氧化損傷HUVEC細胞周期變化的影響

正常對照組

H2O2模型組

TFCOM低濃度組

TFCOM中濃度組TFCOM高濃度組

圖4TFCOM對氧化損傷HUVEC細胞凋亡率的影響

3　討論

內(nèi)皮細胞是血管壁的主要組成部分，是細胞和血液物質交換的第一屏障。內(nèi)皮細胞通過合成、分泌血管活性物質而調節(jié)血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，如保持血液循環(huán)通暢、血管收縮和舒張平衡、防止血小板聚集而形成血栓。血管內(nèi)皮是心血管疾病危險因子的關鍵靶點，血管內(nèi)皮細胞受損是導致動脈粥樣硬化的起始點，血管內(nèi)皮細胞損傷的影響因素很多，其中氧化應激引起的血管內(nèi)皮細胞氧化損傷是血管內(nèi)皮功能障礙的重要因素之一，其導致的內(nèi)皮細胞結構破壞和功能障礙是造成許多心血管疾病的病理基礎[14]。前期研究表明，TFCOM對缺血再灌注造成的血管內(nèi)皮細胞的損傷具有保護和對抗作用，且此作用與抗炎作用和抗氧化作用有關[15]，但對于TFCOM能否防止血管內(nèi)皮細胞受損的機制尚無報道。

正常對照組(×200)

H2O2模型組(×200)

TFCOM低濃度組(×200)

圖5Hochest33258熒光染色

MTT法可用于研究血管內(nèi)皮細胞活性與活細胞的數(shù)目，且兩者呈正比關系，而血管內(nèi)皮細胞活性的高低可以反映細胞的能量代謝與增殖情況[16]。本研究顯示，10 μmol/L H2O2作用4 h誘導損傷，使細胞存活率降低，生長緩慢，出現(xiàn)凋亡，凋亡率隨著過氧化氫的濃度增高而增加，而用TFCOM干預后可以減少H2O2誘導的細胞氧化損傷，提高了細胞活力，說明榅桲總黃酮對H2O2引起的氧化損傷具有抑制作用，能使細胞凋亡率明顯下降；血管內(nèi)皮細胞損傷的原因有很多，其中氧化應激是導致血管內(nèi)皮細胞損傷的主要原因，H2O2是一種常見的活性氧，如果生物體內(nèi)沒有及時清除過氧化氫，H2O2會輕易透過細胞膜作用于血管內(nèi)皮細胞，使細胞膜破裂、DNA斷裂、細胞器受損、并直接或間接地激活細胞內(nèi)的多條信號傳導通路來調節(jié)基因的表達，造成細胞結構和功能受損，最終引起細胞凋亡，同時使羥自由基的產(chǎn)生增加，導致細胞膜脂質過氧化，使細胞損傷而死亡[17]。在細胞周期中，10 μmol/L的H2O2可引起G0/G1期細胞比值增加，S期細胞比值下降，得知細胞DNA合成減少，進入程序性死亡期或靜息期的細胞數(shù)量增多。加入不同劑量的TFCOM干預后可抑制H2O2引起的變化。與此相反，G0/G1期的細胞比例有所下降，S期細胞比例有不同程度的增加，凋亡率顯著降低，由此可見TFCOM可以促進受損的內(nèi)皮細胞DNA合成，對改善細胞分裂增殖有益。Hochest 33258熒光染色結果顯示：H2O2誘導的細胞凋亡經(jīng)TFCOM處理后核固縮和核碎片細胞數(shù)量顯著減少，多數(shù)細胞核形態(tài)接近正常，從形態(tài)學方面證實了TFCOM對H2O2誘導的HUVEC細胞凋亡具有保護作用。

已有研究證實，氧化應激成為內(nèi)皮細胞損傷和凋亡的直接原因，是促發(fā)動脈粥樣硬化、血管順應性改變、對縮血管性因素和擴血管性因素反應改變的最重要因素[18-19]。超氧化物因陰離子和過氧化物對動脈粥樣硬化進展起了很大的促進作用，而細胞的氧化還原狀態(tài)取決于ROS的氧化和抗氧化保護作用，尋找具有抗氧化應激作用的藥物可以達到保護血管內(nèi)皮細胞的完整性而防止動脈粥樣硬化的目的，對于動脈粥樣硬化的預防和治療有很重要的臨床意義，也是醫(yī)藥工作者目前必須解決的問題的之一。具有抗氧化作用的藥物可以降低或消除內(nèi)皮細胞氧化損傷，保護血管內(nèi)皮細胞，并防治或預防心血管疾病。本實驗以血管內(nèi)皮細胞為基礎，過氧化氫作為氧化應激誘導劑建立體外損傷模型，用榅桲總黃酮預處理并對內(nèi)皮細胞的保護作用及其機制進行了初步探究，為榅桲總黃酮的抗氧化提供了進一步的實驗依據(jù)和理論基礎，也可以為臨床的開發(fā)應用提供更可靠的科學依據(jù)。

[1]艾尼瓦爾·吾買爾, 孫曉偉, 周文婷. 榅桲葉提取物對高脂血癥模型大鼠血脂和肝功能的影響[J].中成藥,2013,35(10):2249-2252.

[2]俞德俊. 中國植物志(36卷)[M]. 北京:科技出版社, 1986:344-345.

[3]熱木·伊力, 袁琳.可在北方干旱地區(qū)開發(fā)利用的稀有果樹-榅桲[J].北方果樹,2003, (1):38.

[4]馬木提·庫爾班,長馬力別克·吾買爾. 榅桲中總黃酮的測定[J].新疆師范大學學報:自然科學版,2004,23(4):68-69.

[5]烏蘭巴依爾,楊永新,王雪飛,等.榅桲提取物對抗血栓作用的實驗觀察[J].中成藥,2011,33(8):135-137.

[6]Wojdylo A, Teleszko M, Oszmian′ski J. Antioxidant property and storage stability of quince juice phenolic compounds [J]. Food Chem,2014,(152):261-270.

[7]Wojdylo A, Oszmian′ski J, Beilicki P. Polyphenolic composition，antioxidant activity, and polyphenol oxidase (PPO) activity of quince (Cydonia oblonga Mill.) varieties[J]. J Agric Food Chem,2013,61(11):2762-2772.

[8]Essafi-Benkhadir K, Refai I, et al. Quince (Cydonia oblonga Mill.) peel polyphenols modulate LPS-induced inflummation in human THP-1-derived macrophages through NF-kB, p38MAPK and Akt inhibition[J]. Biochem Biophys Res Commun,2012,418(1):180-185.

[9]Kawahara T, Iinzuka T. Inhibitory effect of hot-water extract of quince (Cydonia oblonga) on immunoglobulin E-dependent late-phase immuse reactions of mast cells[J]. Cytotechnology,2011,3(2):143-152.

[10]Carvalho M，Silva BM, Silva R,et al. First report on Cydonia oblonga Miller anticaner potential:differential antiproliferative effect against human kidney and colon cancer cells[J]. J Agric Food Chem,2010,58(6):3366-3370.

[11]美合日阿依·伊薩克, 艾尼瓦爾·吾買爾.榅桲葉多糖含量測定和純化工藝研究[J].新疆醫(yī)科大學學報,2015,38(6):715-717.

[12]張義軍,張永軍,李連疆,等.白刺總黃酮對血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(3):562-564.

[13]Duygu O, David B, Paolo C, et al. Human vascular endothelial cells:a model system for studying vascular inflammation in diabetes and atherosclerosis [J].Curr Diab Rep,2011,11(3):193-202.

[14]齊曼古麗·阿吉,周文婷,艾尼瓦爾·吾買爾,等．榅桲總黃酮對血栓形成和血小板聚集作用的影響[J]．中成藥,2015,37(7):1589-1592.

[15]劉永剛,王曉東,張小兵.白藜蘆醇對腦缺血/再灌注損傷炎癥反應的影響[J]．中國中藥雜志,2007,32(17):1792-1795．

[16]劉永剛,李芳君,謝少玲.白藜蘆醇對腦缺血再灌注損傷的抗氧化活性及線粒體保護作用的研究[J]．中成藥,2007,29(9):1274-1277.

[17]劉永剛,羅景慧.白藜蘆醇對過氧化氫誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[J].中成藥,2011,33(7):1126-1130.

[18]邱雅慧. 血管內(nèi)皮細胞的功能以及損傷修復與動脈粥樣硬化[J].中國組織功能研究與臨床康復,2007,10(3):1927-1933.

[19]Harrington L, Sainson R, Williams C, et al. Regulation of multiple angiogenic pathways by Dll4 and notch in human umbilical vein endothelial cells [J].Microvascul Res,2008,75(2):144-154.

(本文編輯周芳)

Protective effect of Total Flavonoids in Cydonia oblanga Mill. on human umbilical vein endothelial cell oxidative damage induced by hydrogen peroxide

Guzainuer Maimaiti1, Aerziguli Tuerxun2, Adili Abudureheman1, ZHOU Wenting1, Wuliya Yiming1, Anwar Umar1

(1DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedical,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2TheScienceResearchCenter,theFirstHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects and mechanisms of Total Flavonoids in Cydonia oblanga Mill. (TFCOM) on the oxidative injury and apoptosis of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) induced by hydrogen peroxide (H2O2). MethodsHUVEC were cultured in vitro and divided into five groups， including normal control group, H2O2injured group (10 μmol/L), low-dosage of TFCOM group (10 μg/mL), mid-dosage of TFCOM group (20 μg/mL) and high-dosage of TFCOM group (40 μg/mL). On the basis of establishing the oxidative damage model of H2O2, observe the periodic change of HUVEC, by detecting HUVEC vigor using by MTT method ，flow cytometry instrument and Hochest33258 fluorescent staining method were used to detect apoptosis rate. ResultsCell morphology of TFCOM group was between normal control group and H2O2model group, and cell morphology improvement was more obvious with the increasing of drug concentration. Compared with H2O2model group, the cell gap was narrowed and the intercellular junctions were increased and the border was clear in TFCOM group. TFCOM can against cell apoptosis induced by H2O2and promote the proliferation and differentiation of HUVEC. The difference between the low-dose TFCOM group and H2O2model group had no significant difference, while cell survival rate of medium and high concentration group was gradually increased, and had significant difference (P<0.01). Low, medium, high concentration of TFCOM can promote the synthesis of cell DNA, and compared with H2O2model group, had significant difference (P<0.01). The early stage apoptosis rate of the normal control group was 3.4%, the early stage apoptosis rate of H2O2model group was 19.2%, compared with normal control group, and the difference was statistical (P<0.05). The early apoptosis rate of TFCOM in low, medium and high concentration groups were 16.7%, 12.6%, 6.1%, compared with H2O2model group, the differences were statistically significant (P<0.05). ConclusionTFCOM can inhibit endothelial cell apoptosis, and reduce the effect of H2O2on endothelial cells, can significantly reduce the oxidative damage of H2O2on vascular endothelial cells.

TFCOM; endothelial cell; H2O2; oxidative stress injury

國家自然科學基金 (81260490)； 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金 (2015211C033)； 新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計劃項目(XJEDU2014S028)

古再努爾·買買提(1989-)，女(維吾爾族)，在讀碩士，研究方向：動脈粥樣硬化。

艾尼瓦爾·吾買爾，男(維吾爾族)，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，E-mail: anwar.umar@126.com。

R29

A

1009-5551(2016)06-0696-07

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.008

2016-03-08]