中藥"蚓黃散"對(duì)大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面形態(tài)及促愈因子的影響

李友山　楊博華　冀凌云

中藥"蚓黃散"對(duì)大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面形態(tài)及促愈因子的影響

李友山楊博華冀凌云

目的 應(yīng)用中藥"蚓黃散"外治糖尿病足潰瘍,觀察其對(duì)創(chuàng)面組織愈合過(guò)程中的促進(jìn)作用,探討大鼠糖尿病潰瘍愈合的作用機(jī)制.方法 建立大鼠糖尿病足潰瘍模型后設(shè)模型組、西藥組、中藥組各10只,另設(shè)空白組10只,空白組及模型組創(chuàng)面不予干預(yù),西藥組予甲硝唑注射液外敷,中藥組予"蚓黃散"外敷,治療10天后檢測(cè)大鼠血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycasylation end products,AGEs)、炎性因子及生長(zhǎng)因子含量;增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、CD34染色分別檢測(cè)創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細(xì)胞數(shù)、新生毛細(xì)血管數(shù);HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化.結(jié)果 與模型組比較,藥物干預(yù)后大鼠血清中AGEs和腫瘤壞死因子-a、白細(xì)胞介素-1、C-反應(yīng)蛋白均可降低,堿性成纖維因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子水平均有所提高,創(chuàng)面肉芽組織中新生毛細(xì)血管數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)均增多(P<0.05),而中藥組均作用顯著(P<0.05).結(jié)論 "蚓黃散"可明顯促進(jìn)大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合,其機(jī)制可能與改善大鼠的炎性狀態(tài),提高大鼠血清中生長(zhǎng)因子含量,降低AGEs水平,促進(jìn)新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞的增殖有關(guān).

蚓黃散; 創(chuàng)面愈合; 炎性因子; 生長(zhǎng)因子; 晚期糖基化終末產(chǎn)物

糖尿病足的發(fā)病是一個(gè)多方面的、復(fù)雜的疾病,發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說(shuō).近年來(lái),糖尿病足的脂毒性和糖毒性成為研究重點(diǎn),其中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycasylation end products,AGEs)在皮膚組織的大量蓄積導(dǎo)致組織細(xì)胞學(xué)行為的改變已經(jīng)成為關(guān)注熱點(diǎn)[1].研究表明,高血糖及AGEs的蓄積不僅造成微血管及外周血管的損傷,還可造成多種血管、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)降低,這可能是糖尿病足潰瘍難以愈合的重要環(huán)節(jié)[2].糖尿病足潰瘍愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)的病理、生理過(guò)程,在修復(fù)過(guò)程中分為炎癥期、肉芽組織形成期、瘢痕重塑期3個(gè)連續(xù)而又相互重疊的階段[3].糖尿病足潰瘍當(dāng)屬中醫(yī)"脫疽""消渴"的范疇,中醫(yī)多認(rèn)為該病的主要病機(jī)為:氣陰虧虛、瘀血阻絡(luò)、外感濕熱[4].筆者認(rèn)為濕熱與毒瘀是糖尿病足潰瘍的主要致病因素,所以中醫(yī)外治重在清熱解毒利濕.中藥"蚓黃散"由黃柏、地龍、血竭共三味傳統(tǒng)中藥組成,以清熱解毒利濕為法,祛腐與生肌并重的治療原則,以達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的目的,一定程度上降低了截肢率[5].

本實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用"蚓黃散"干預(yù)糖尿病足潰瘍后,創(chuàng)面組織愈合過(guò)程中AGEs、炎性因子---腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、超敏C反應(yīng)蛋白(highsensitivity C-reactive protein,hs-CRP)及生長(zhǎng)因子---堿性成纖維因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(endothelial growth factor,EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)的細(xì)胞生物學(xué)活性變化,進(jìn)一步探討糖尿病足潰瘍愈合的相關(guān)機(jī)制與作用環(huán)節(jié).

1　材料與方法

1.1試劑與藥品

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)(購(gòu)自sigmaaldrich,批號(hào):20120728);檸檬酸、檸檬酸鈉(購(gòu)自北京化學(xué)試劑廠,批號(hào):051024);酶聯(lián)免疫試劑盒(購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司,批號(hào):23064D433);免疫組化PCNA檢測(cè)試劑盒(ZM-0213)(購(gòu)自北京中杉金橋生物制品有限公司,批號(hào):13132A10);免疫組化CD34檢測(cè)試劑盒(ZM-0046)(購(gòu)自北京中杉金橋生物制品有限公司,批號(hào):12201110).

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

SD大鼠,體質(zhì)量80～100 g,SPF級(jí),雄性,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所.飼料(高脂高糖)配方:基礎(chǔ)飼料67.5%、蔗糖20%、豬油10%、蛋黃2.5%.

1.3STZ溶液制備

取檸檬酸A溶液和檸檬酸鈉B溶液,按照A:B=1:1.32,配制BX緩沖液,精確稱(chēng)量STZ,按1%濃度溶于BX緩沖液中.(注意:STZ見(jiàn)光自然分解,需避光,并在冰浴中配制,要求15分鐘內(nèi)使用完畢).STZ注射劑量公式:(體重XSTZ預(yù)設(shè)給藥劑量)/1000=STZ用量(mg)

1.4藥物制備

"蚓黃散"由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備,黃柏30 g、地龍20 g、血竭10 g,共三味中藥各粉碎成細(xì)粉(過(guò)六號(hào)篩).對(duì)照藥選用甲硝唑葡萄糖注射液(購(gòu)自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字1102161).

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1糖尿病潰瘍大鼠模型制備 大鼠用高脂高糖飼料喂養(yǎng)一個(gè)月,腹腔注射STZ 40 mg/kg制備糖尿病大鼠模型.成模后用龍膽紫在大鼠背部脫毛區(qū)標(biāo)記造模面積,在無(wú)菌條件下,將造模區(qū)皮膚剪去,深達(dá)筋膜.六層醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面,用醫(yī)用紙膠帶包扎固定.見(jiàn)圖1.

1.5.2給藥方法 將糖尿病潰瘍成模后大鼠隨機(jī)分為3組,模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng):模型組)10只、西藥組10只、中藥組10只;普通SD大鼠10只設(shè)為空白組.空白組、模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面不予處理,西藥組創(chuàng)面外敷甲硝唑葡萄糖注射液小紗布(4 cmX4 cm),予醫(yī)用紙膠帶包扎固定,每天1次;中藥組創(chuàng)面外敷"蚓黃散",六層醫(yī)用小紗布覆蓋創(chuàng)面(4 cmX4 cm),予醫(yī)用紙膠帶包扎固定,每天1次,觀察10天.見(jiàn)圖2.

圖1　糖尿病潰瘍大鼠模型制備

1.5.3血清的采集和檢測(cè) 取大鼠腹主動(dòng)脈血液,采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大鼠血清中TNF-a、IL-1、hs-CRP、EGF、bFGF、VEGF、PDGF、AGEs的含量.

1.5.4肉芽組織的采集及HE染色 創(chuàng)面中心點(diǎn)取肉芽組織(5 g左右),用4%中性多聚甲醛灌注固定,清水沖洗,浸泡,脫水,透明,浸蠟,用石蠟包埋,切片(切片厚5 μm).HE染色后,圍繞皮膚結(jié)構(gòu)和功能的微小單位(再生結(jié)構(gòu)單位),進(jìn)行觀察比較.采用多功能顯熒光顯微鏡(BX60,日本OLYMPUS公司)觀察組織創(chuàng)面和周?chē)M織的病理形態(tài).

1.5.5肉芽組織成纖維細(xì)胞數(shù)、毛細(xì)血管表達(dá)檢測(cè)(PCNA、CD34染色法) 大鼠創(chuàng)面肉芽組織石蠟切片采用PCNA、CD34免疫組織化學(xué)染色SP方法:包括防脫處理、脫蠟、滅活內(nèi)源性酶、熱修復(fù)抗原、滴加PCNA(CD34)單克隆抗體,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察.

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,多組之間的兩兩比較采用LSD法;不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn).以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1炎性因子及生長(zhǎng)因子變化

與空白組比較,模型組大鼠血清中炎性因子顯著升高,生長(zhǎng)因子顯著下降,AGEs顯著升高,差異顯著(P<0.01).與模型組比較,西藥組和中藥組大鼠血清中炎性因子顯著下降,生長(zhǎng)因子顯著升高, AGEs顯著下降,差異顯著(P<0.01).與西藥組比較,中藥組大鼠血清中TNF-a、IL-1下降,差異顯著(P<0.01),生長(zhǎng)因子顯著升高,AGEs顯著下降.見(jiàn)表1.

2.2大鼠肉芽組織石蠟切片HE染色光鏡觀察結(jié)果

空白組可見(jiàn)較少的炎性細(xì)胞,大量成纖維細(xì)胞,細(xì)胞較大,胞漿較多,核仁著色明顯.模型組可見(jiàn)較多的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞,成纖維細(xì)胞數(shù)量很少,少許新生毛細(xì)血管.中藥組可見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞,成纖維細(xì)胞數(shù)量較多,細(xì)胞較大,胞漿較多,核仁著色明顯.西藥組可見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞,但較中藥組較多,成纖維細(xì)胞數(shù)量較中藥組少,細(xì)胞胞體外形較小,胞漿突起不明顯.見(jiàn)圖3.

2.3免疫組化

與空白組比較,模型組大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)密度及成纖維細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05).與模型組比較,西藥組和中藥組的新生毛細(xì)血管數(shù)密度及成纖維細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05).與西藥組比較,中藥組新生毛細(xì)血管數(shù)密度及成纖維細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05).見(jiàn)表2.

圖2　空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面情況

表1　各組大鼠炎性因子及生長(zhǎng)因子檢測(cè)結(jié)果

圖3　各組大鼠肉芽組織石蠟切片HE染色(X40)

表2　各組大鼠毛細(xì)血管數(shù)密度及成纖維細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果

3　討論

3.1炎性因子對(duì)糖尿病潰瘍后創(chuàng)面愈合的影響

hs-CRP是一種非特異性的炎癥標(biāo)志物,由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞衍生的促炎癥細(xì)胞因子(IL-1、TNF-a等)誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生[6].本病為慢性創(chuàng)面,hs-CRP持續(xù)較高水平將成為創(chuàng)面缺血的因素之一,不利于創(chuàng)面愈合.因此,降低hs-CRP的含量,將有效地控制炎癥的發(fā)生,也減少了創(chuàng)面缺血的發(fā)生幾率.TNF-a主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,也可由一些炎性細(xì)胞分泌,具有多種生物效應(yīng),既可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬能力,又抑制腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生,作用于肝臟,使hs-CRP產(chǎn)生增多[7].IL-1參與各種炎癥現(xiàn)象及新陳代謝和細(xì)胞修復(fù).另外,IL-1作為內(nèi)分泌激素,可以激發(fā)全身的炎癥反應(yīng),使機(jī)體表現(xiàn)為應(yīng)激狀態(tài),對(duì)免疫系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用[8],與創(chuàng)傷修復(fù)密切相關(guān).局部炎癥反應(yīng)對(duì)組織造成有一定的損害,降低hs-CRP、IL-1、TNF-a等炎癥介質(zhì)的過(guò)度合成和釋放,有利于控制炎癥反應(yīng)程度,進(jìn)而有利于創(chuàng)面的愈合.

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出經(jīng)藥物干預(yù)后大鼠血清中hs-CRP和TNF-a、IL-1均可降低,而中藥治療組降低TNF-a、IL-1作用顯著,考慮蚓黃散能較好地改善大鼠的炎癥狀態(tài),這可能與促進(jìn)創(chuàng)面的愈合有關(guān).

3.2生長(zhǎng)因子對(duì)糖尿病潰瘍后創(chuàng)面愈合的影響

既往研究表明糖尿病足局部組織bFGF的表達(dá)并不減少,但大量被糖基化,失去了應(yīng)有的生物學(xué)活性,因此在bFGF蛋白被大量糖基化的情況下,加之新生的bFGF不足,可能是糖尿病足潰瘍創(chuàng)面難以愈合的重要原因之一[9-10].EGF是一類(lèi)對(duì)多類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)或抑制作用的多肽.體內(nèi)EGF受體與EGF結(jié)合后,形成受體EGF復(fù)合物,通過(guò)一系列生化反應(yīng)調(diào)控細(xì)胞增殖的一系列重要基因,啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)的過(guò)程,并對(duì)上皮細(xì)胞有強(qiáng)烈的促生長(zhǎng)作用[11].VEGF有利于毛細(xì)血管融合成較大血管,調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移、促進(jìn)新生毛細(xì)血管的形成[12].在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中,VEGF協(xié)同F(xiàn)GF刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)創(chuàng)面血管化的進(jìn)程[13]. PDGF是一種由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等釋放,儲(chǔ)存于血小板a顆粒中的血清生長(zhǎng)因子.PDGF可作用于組織修復(fù)細(xì)胞,加速細(xì)胞增殖,促進(jìn)傷口愈合[14].在創(chuàng)面修復(fù)不同過(guò)程中,各種生長(zhǎng)因子分別起到趨化作用、合成分泌作用、增殖分化作用、誘導(dǎo)凋亡、刺激血管新生等多種生物效應(yīng),從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合.當(dāng)創(chuàng)面內(nèi)源性生長(zhǎng)因子種類(lèi)、含量平衡失調(diào)或其受體活性下降時(shí),可導(dǎo)致創(chuàng)面修復(fù)困難.

本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果可以看出經(jīng)藥物干預(yù)后大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF、PDGF水平均可以提高,而蚓黃散可以顯著地提高大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF、PDGF水平,促進(jìn)糖尿病潰瘍的愈合.

3.3AGEs對(duì)糖尿病潰瘍后創(chuàng)面愈合的影響

AGEs是正常體內(nèi)氨基酸和還原糖生成的阿馬多里(Amadori)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一系列脫水、氧化及化學(xué)重排,產(chǎn)生高度活性的羰基化合物,進(jìn)而與蛋白質(zhì)的自由氨基起反應(yīng)而凝聚成的不可逆的終末產(chǎn)物[16].持續(xù)高糖狀態(tài)下,糖的醛基與蛋白質(zhì)的氨基可生成AGEs,生長(zhǎng)因子糖基化時(shí),其功能活性降低,從而影響修復(fù)細(xì)胞的增殖和遷移;糖基化過(guò)程中,可引起蛋白質(zhì)的斷裂;神經(jīng)鞘磷脂的糖基化可使吞噬細(xì)胞分泌蛋白酶,進(jìn)而引起神經(jīng)脫髓鞘病變[15].因此,AGEs的蓄積及高糖狀態(tài),可以引起微血管、外周血管損傷,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)下降[2].

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出藥物干預(yù)均可以降低大鼠血清中AGEs的含量,而蚓黃散在降低大鼠血清中AGEs水平方面作用顯著.

3.4血管新生與成纖維細(xì)胞

在創(chuàng)面愈合過(guò)程中,肉芽組織的形成至關(guān)重要,其可直接影響創(chuàng)面愈合的過(guò)程及其預(yù)后.肉芽組織的本質(zhì)是豐富的成纖維細(xì)胞和大量的新生毛細(xì)血管.豐富的新生毛細(xì)血管,改善了創(chuàng)面微循環(huán),加速了創(chuàng)面的新陳代謝,為組織的修復(fù)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和必須的氧,促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合[17-18].成纖維細(xì)胞在皮膚損傷后,創(chuàng)緣真皮成纖維細(xì)胞被激活發(fā)生轉(zhuǎn)化,胞質(zhì)出現(xiàn)具有收縮能力的張力纖維,促進(jìn)創(chuàng)面愈合.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,甲硝唑葡萄糖注射液與蚓黃散均有促進(jìn)新生毛細(xì)血管生長(zhǎng)、增殖的作用,其中蚓黃散在改善新生肉芽組織中數(shù)密度效果最顯著.而在成纖維細(xì)胞方面,甲硝唑葡萄糖注射液與蚓黃散均可升高成纖維細(xì)胞數(shù),其中蚓黃散在升高成纖維細(xì)胞數(shù)效果最顯著.筆者推測(cè)蚓黃散可能是有利于成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管的增殖、創(chuàng)面肉芽組織的生長(zhǎng),從而促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合.

實(shí)驗(yàn)表明:在糖尿病足潰瘍愈合過(guò)程中,炎性因子及生長(zhǎng)因子起到了至關(guān)重要的作用,中藥"蚓黃散"外用干預(yù)糖尿病足潰瘍可使炎性因子減少和生長(zhǎng)因子增加,從而加快糖尿病足潰瘍的愈合.

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(本文編輯:韓虹娟)

Effect of Yinhuangsan on morphology of ulcer wound and ulcer healing factors on diabetic rats

LIYou-shan,YANG Bo-hua,JI Ling-yun. Department of peripheral vascular,Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China
Corresponding Author:LI You-shan,E-mail:lys4626@sina.com

Objective To study the role of traditional Chinese medicines(TCM)"Yinhuangsan" in the external treatment of diabetic foot ulcers by observing the process of the wound tissue healing and exploring the mechanism of the rat diabetic ulcer healing.Methods Diabetic foot ulcer model was established and the rats were randomly divided into model group,western medicine group and TCM group,10 rats in each group,rats in all groups were respectively by gavage given oral no drug,metronidazole and Yinhuangsan.Another 10 normal rats were set as control group without drug treatment.After 10 days of treatment,the contents of AGEs,inflammatory factor and growth factor in serum were detected.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)staining and CD34 staining were respectively used to detect the number of fibroblast and number of newly born capillaries in granulation tissue.Hematoxylin and eosin(HE)staining was used to observe morphological changes.Results Compared with the model group,the content of AGEs, tissue necrosis factor-a(TNF-a),interleukin-1(IL-1)and C-reactive protein(CRP)were reduced after drug intervention,basic fibroblast growth factor(bFGF),endothelial growth factor(EGF),vascular endothelial growth factor(VEGF)and platelet derived growth factor(PDGF)were increased after drug intervention,newly born capillaries and fibroblasts were increased in granulation tissue(P<0.05),and the effect of TCM group was more pronounced than western medicine group(P<0.05).Conclusions Yinhuangsan cansignificantly promote the healing of ulcer wound in diabetes rats.The mechanism may be related to reducing inflammatory factor and AGEs in rat serum while improving growth factor,in rat serum,and promoting newly born capillaries and fibroblasts proliferation in the granulation tissue.

Yinhuangsan; Wound healing; Inflammatory factor; Growth factor; Advanced glycasylation end products

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.003

國(guó)家自然科學(xué)基金(81302980)

100700北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院周?chē)芸?/p>

李友山(1979-),博士,副主任醫(yī)師.研究方向:中醫(yī)外科周?chē)懿⊙芯?E-mail:lys4626@ sina.com

2015-03-21)