豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結(jié)構(gòu)的同源模建*1

楊　琳，趙琴平，楊力權(quán)（.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 43007；2.云南省大理白族自治州血吸蟲病防治研究所，云南 大理 67000；3.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 67003）

豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結(jié)構(gòu)的同源模建*1

楊琳1，2，趙琴平1，楊力權(quán)3*
（1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071；2.云南省大理白族自治州血吸蟲病防治研究所，云南 大理 671000；3.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003）

通過同源模建方法構(gòu)建豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的三維結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，TsCL-1的結(jié)構(gòu)模型具有半胱氨酸蛋白酶CA族典型的α/β折疊模式，結(jié)構(gòu)骨架主要由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成。結(jié)構(gòu)模型具有保守的半胱氨酸催化三聚體 （Cys25-His163-Asn183），催化三聚體位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的表面，結(jié)構(gòu)模型中存在3對(duì)二硫鍵。研究結(jié)果將為進(jìn)一步深入研究TsCL-1的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

半胱氨酸蛋白酶TsCL-1；結(jié)構(gòu)模型；同源模建；結(jié)構(gòu)功能研究

。

豬囊尾蚴病 （Cysticercosis cellulosae）又稱豬囊蟲病。它是由豬帶絳蟲 （Taenia solium）的幼蟲——豬囊尾蚴 （Cysticercus cellulose）寄生于中間宿主體內(nèi)而引起的一種人獸共患寄生蟲?。?，2］。在人體內(nèi)，豬帶絳蟲與兩個(gè)明顯的感染階段有關(guān)，即：腸道感染 （由于成蟲在宿主腸道寄生所致，也稱絳蟲?。┖图∪饣蚪M織感染 （由于囊尾蚴進(jìn)入宿主肌肉或組織內(nèi)所致，也稱囊尾蚴病）［3］。由于豬囊尾蚴幼蟲寄生于人體的位置和數(shù)量不同，可導(dǎo)致不同的臨床癥狀，給人類健康帶來嚴(yán)重危害［4］，尤以腦囊尾蚴病為甚。

近年研究表明，由寄生蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶 （Cysteine Protease，CP）在寄生蟲入侵宿主、寄生蟲免疫逃避機(jī)制及寄生蟲治療中發(fā)揮了重要作用，得到了廣泛的關(guān)注［3，5，6］。半胱氨酸蛋白酶TsCL-1是由豬囊尾蚴分泌的一種半胱氨酸蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶CA蛋白酶中的C1族蛋白酶。研究表明，在酸性環(huán)境中，它是降解宿主IgG的主要酶，而宿主IgG可能是T.solium幼蟲的主要氨基酸來源，因此它被認(rèn)為是入侵宿主的重要因子之一［3，7］。目前，通過基因工程技術(shù)，TsCL-1的氨基酸序列已經(jīng)被測(cè)定，對(duì)其蛋白酶的生物化學(xué)特性和反應(yīng)優(yōu)化條件等也進(jìn)行了一定研究［3］。但由于其晶體結(jié)構(gòu)未被測(cè)定，因此對(duì)其與宿主相互作用機(jī)制還未進(jìn)行廣泛深入的研究。本文通過同源模建技術(shù)構(gòu)建豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的三維結(jié)構(gòu)模型并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為在分子水平上揭示豬囊尾蚴蟲半胱氨酸蛋白酶與宿主的相互作用機(jī)制和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1原理

同源模建［8］是基于序列-結(jié)構(gòu)相似性原則，通過模板蛋白構(gòu)建待測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)序列的一致性大于30%，便可以利用模板蛋白的結(jié)構(gòu)來建立靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)［8］。同源模建的原理基于兩點(diǎn)：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由其氨基酸序列唯一決定；蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中更穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)變化比序列變化要慢得多，因此序列上的相似性導(dǎo)致同源蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，并且進(jìn)化上距離較遠(yuǎn)的相關(guān)序列仍可折疊成相似的結(jié)構(gòu)。

1.2序列比對(duì)和模板蛋白

豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的序列在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中獲得 （序列號(hào)為Q6R3Q1），去掉信號(hào)肽和先導(dǎo)肽殘基，得到包含216個(gè)氨基酸殘基的成熟TsCL-1序列。在Biology Workbench生物平臺(tái)中［9，10］，以成熟TsCL-1序列作為查詢序列，使用PSI-BLAST［10］進(jìn)行序列搜尋和比對(duì)，得到的最接近序列為PDB編號(hào)1CS8的序列。TsCL-1與1CS8的序列比對(duì)結(jié)果顯示 （圖1），序列一致性達(dá)到57% （Identities=127/220（57%），Positives=156/220（70%），Gaps= 6/220（2%））。1CS8是一種來源于人類的半胱氨酸蛋白酶，同樣屬于CA蛋白酶中的C1族蛋白酶。鑒于TsCL-1與1CS8具有較好的序列一致性，選取1CS8的晶體結(jié)構(gòu)作為模板蛋白。

圖1　TsCL-1與1CS8序列比對(duì)結(jié)果

TsCL-1與1CS8序列比對(duì)結(jié)果，Query序列為TsCL-1序列，Sbjct序列為1CS8序列。

1.3同源模建及能量?jī)?yōu)化

本文采用Modeller9.11［11］同源模建軟件包來構(gòu)建半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結(jié)構(gòu)模型。模建時(shí)使用自行編寫的Modeller腳本文件“align2d.py”對(duì)靶序列 （TsCL-1序列）與模板序列 （1CS8序列）進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)后進(jìn)行手工調(diào)整使兩者的保守位置盡量對(duì)齊，以保證模建結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確。隨后用自行編寫的Modeller腳本文件“model-single.py”，生成5個(gè)TsCL-1結(jié)構(gòu)模型，采用模擬退火算法對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，采用分子概率密度函數(shù)molpdf對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。

2.結(jié)果和討論

2.1模建結(jié)構(gòu)模型的評(píng)估

把能量最小化后的TsCL-1分子結(jié)構(gòu)模型用Procheck［12］進(jìn)行模建結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)。得到了相應(yīng)的評(píng)價(jià)結(jié)果和Ramachandran圖 （圖2）。結(jié)果顯示，其中85.6%的氨基酸處于最適區(qū)，12.2%處于較合適區(qū)，1.1%處于可接受區(qū)，1.1%處于不合理區(qū)。由此可見，98.9%的氨基酸殘基分布在Ramachandran圖的二面角合理區(qū)域，也就是說98.9%的氨基酸構(gòu)象是可以接受的，說明模建的結(jié)構(gòu)合理。

圖2　TsCL-1結(jié)構(gòu)模型的Ramachandran圖

此圖通過Procheck得到，區(qū)域1代表最適區(qū)域；區(qū)域2為較合適區(qū)域；區(qū)域3為可接受區(qū)域；區(qū)域4為不合理區(qū)域。

2.2半胱氨酸蛋白酶TsCL-1結(jié)構(gòu)模型分析

半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結(jié)構(gòu)模型主要包含兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域 （圖3），一個(gè)結(jié)構(gòu)域以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)，另一個(gè)以反平行的β片層為主要結(jié)構(gòu)。催化三聚體由Cys25，His163和Asn183組成，催化三聚體位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的表面。在TsCL-1結(jié)構(gòu)模型中存在3對(duì)二硫鍵，分別由Cys22和Cys65、Cys56和Cys97、Cys156和Cys205構(gòu)成。

圖3　半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結(jié)構(gòu)模型

半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結(jié)構(gòu)模型。結(jié)構(gòu)中的R區(qū)域、L區(qū)域、催化三聚體殘基、二硫鍵已在圖上標(biāo)注；催化三聚體殘基用棍狀模型表示。

整體上看，半胱氨酸蛋白酶TsCL-1的結(jié)構(gòu)模型具備半胱氨酸蛋白酶CA族典型的α/β折疊模式，即結(jié)構(gòu)骨架主要由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域所組成，一個(gè)以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)的L區(qū) （L domain），另一個(gè)以反平行β片層為主要結(jié)構(gòu)的R區(qū) （R domain），催化三聚體 （Cys25-His163-Asn183）位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的表面［13，14］。其催化三聚體的催化機(jī)制主要是：Cys25充當(dāng)進(jìn)攻底物的親核基團(tuán)，Cys25在His163的作用下發(fā)生去質(zhì)子化，而Asn183的作用是幫助His163中的咪唑環(huán)定位，使得去質(zhì)子化可以發(fā)生；Cys25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳，形成酰基-酶四面體中間體；接著酶與一個(gè)水分子作用，發(fā)生去?；⑨尫烹逆湹聂驶┒耍?5］。結(jié)構(gòu)模型中包含有3對(duì)二硫鍵，以往研究表明，多種因素共同維系和影響著蛋白酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，如二硫鍵和氫鍵等都在保證其整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性上有著重要作用［16，17］。本文的研究結(jié)果將為進(jìn)一步深入研究TsCL-1的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

［1］Prasad K N，Prasad A，Verma A，et al.Human cysticercosis and Indian scenario：a review ［J］.Journal of Biosciences，2008，33（4）：571—582.

［2］Héctor H G，Armando E G，Carlton AW E，et al.Taenia solium cysticercosis［J］.Lancet，2003，362（1）：547—556.

［3］Li A H，Moon SU，Park Y K，et al.Identification and characterization of a cathepsin L—like cysteine protease from Taenia solium metacestode［J］.Veterinary Parasitology，2006，141（3—4）：251—259.

［4］Willingham A L，Engels D.Control of Taenia solium cysticercosis/taeniosis［J］.Advances in Parasitology，2006，61：509—566.

［5］Berasaín P，Goii F，McGonigle S，et al.Proteinases secreted by Fasciola hepatica degrade extracelullarmatrix and basement membrane components［J］.The Journal of Parasitology，1997，83 （1）：1—5.

［6］Hotez P，Haggerty J，Hawdon J，et al.Metalloproteases of infective Ancylostoma hookworm larvae and their possible functions in tissue invasion and ecdysis［J］.Infection and Immunity，1990，58 （12）：3883—3892.

［7］White A C，Baig S，Chappell C L.Characterization of a cysteine proteinase from Taenia crassiceps cysts［J］.Molecular And Biochemical Parasitology，1997，85（2）：243—253.

［8］Martí-Renom M A，Stuart A C，F(xiàn)iser A，et al.Comparative protein structuremodeling of genes and genomes［J］.Annual Review Of Biophysics And Biomolecular Structure，2000，29（1）：291—325.

［9］Bairoch A，Apweiler R，Wu C H，et al.The universal protein resource（UniProt）［J］.Nucleic Acids Research，2005，33（suppl 1）：154—159.

［10］Subramaniam S.The Biology Workbench—a seam less database and analysis environment for the biologist［J］.Proteins：Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，1998，32（1）：1—2.

［11］Sali A，Blundell T L.Comparative proteinmodelling by satisfaction of spatial restraints［J］. Journal of Molecular Biology，1993，234（3）：779—815.

［12］Laskowski R A，MacArthur M W，Moss D S，et al.PROCHECK：a program to check the stereochemical quality of protein structures［J］.Journal of Applied Crystallography，1993，26（2）：283—291.

［13］Nth J，Jansonius JN，Koekoek R，et al.The structure of papain［J］.Advances in Protein Chemistry，1971，25：79—115.

［14］Light A，Smith E L.Current Status of the Structure of Papain：The Linear Sequence，Active Sulfhydryl Group，and the Disulfide Bridges［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1964，52（5）：1276—1283.

［15］Buller A R，Townsend C A.Intrinsic evolutionary constraints on protease structure，enzyme acylation，and the identity of the catalytic triad［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（8）：653—661.

［16］Wedemeyer W J，Welker E，Narayan M，et al.Disulfide bonds and protein folding［J］.Biochemistry，2000，39（23）：7032.

［17］Hogg P J.Disulfide bonds as switches for protein function［J］.Trends in Biochemical Sciences，2003，28（4）：210—214.

（責(zé)任編輯徐成東）

Structure Homology Modeling of Cysticercus Cellulose Cysteine Protease TsCL-1

YANG Lin1，2，ZHAO Qinping1&YANG Liquan3
（1.School of Basic Medical Sciences，Wuhan University，Wuhan，430071，Hubei Province；2.Dali Institute of Schistosomiasis Prevention and Control，Dali，671000，Yunnan Province；3.College of Agriculture and Biological Science，Dali University，Dali，671003，Yunnan Province）

In this article，structuralmodel of Cysticercus cellulose cysteine protease TsCL-1 is constructed and analyzed.The results show that the structuralmodel of TsCL-1 has the commonα/βscaffold characteristics of the clan CA proteases of Cysteine Protease，which contains twomain structural domains. The catalytic triad residues Cys，His and Asn are completely conserved（Cys25-His163-Asn183）.The structuralmodel has three disulfide bonds.The results of this article will provide a solid basis for further studying the relationship between structure and function of TsCL-1

Cysteine protease TsCL-1；structuralmodel；homologymodeling；structure and function relationship

Q556.9

A

1671-7406（2016）03-0037-04

2016-01-13

楊琳 （1980—），女，碩士研究生，主要從事寄生蟲診治方面的工作和研究。

楊力權(quán) （1980—），男，博士，副教授，主要從事結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的研究。