馬鈴薯品種‘隴薯11號’再生體系的構(gòu)建

陳曉艷，孟亞雄，賈小霞，張　武，劉　石，郭玉美，齊恩芳*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

遺傳育種

馬鈴薯品種‘隴薯11號’再生體系的構(gòu)建

陳曉艷1，孟亞雄1，賈小霞2，張武2，劉石2，郭玉美3，齊恩芳2*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

采用L16（45）正交試驗設(shè)計，以馬鈴薯品種‘隴薯11號’為試驗材料，分別選用4種植物激素（誘導(dǎo)愈傷的GA3、6-BA、NAA、2,4-D和誘導(dǎo)分化的GA3、NAA、IAA、KT）的4個水平對其莖段的離體再生進(jìn)行了研究，篩選適合‘隴薯11號’的愈傷和芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。結(jié)果表明，適合‘隴薯11號’的莖段愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+GA3（7.5 mg/L）+6-BA（2.5 mg/L）+2,4-D（0.5 mg/L），誘導(dǎo)率達(dá)98.72%，生長狀態(tài)最好；誘導(dǎo)芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA（0.25 mg/L）+IAA（0.1 mg/L）+KT（3.0 mg/L），不定芽誘導(dǎo)率為95.83%，分化苗健壯。

隴薯11號；外植體；愈傷誘導(dǎo)；芽分化；植物激素；正交試驗

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是茄科茄屬作物，具有分布范圍廣、適應(yīng)性強、產(chǎn)量高、營養(yǎng)全面和用途廣泛等特點，是中國繼水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物[1]。近年來，因其在生產(chǎn)上的重要性及病蟲害的影響，馬鈴薯的改良已受到廣泛的重視，利用基因工程技術(shù)對馬鈴薯進(jìn)行改良具有廣闊的前景。馬鈴薯組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立，是遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在馬鈴薯改良中應(yīng)用的關(guān)鍵。馬鈴薯不同品種間誘導(dǎo)再生的條件差異較大，因此，對馬鈴薯特定基因型進(jìn)行再生體系的篩選，確定有針對性的最佳培養(yǎng)基具有重要意義及應(yīng)用價值。目前已有研究人員成功建立了‘大西洋’[2]、‘中薯2號’[3]、‘克新1號’[4]、‘隴薯10號’[5]、‘隴薯5號’[6]、‘隴薯3號’和‘隴薯6號’[7]不同馬鈴薯品種的再生體系。本試驗以馬鈴薯品種‘隴薯11號’為試驗材料，進(jìn)行最佳再生體系的篩選，旨在為通過生物技術(shù)途徑進(jìn)行馬鈴薯品種改良奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試材料為馬鈴薯品種‘隴薯11號’，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所提供。

1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

MS為基本培養(yǎng)基，含蔗糖3%，瓊脂3.5g/L，pH值為5.8。培養(yǎng)條件：溫度（22±1）℃，光照14 h/d，光照強度3000lx。

1.3試驗方法

1.3.1正交試驗設(shè)計

采用L16（45）正交設(shè)計[8]，共16個處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)，考察不同植物激素對‘隴薯11號’愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化的影響，各因素水平見表1與表2。

1.3.2外植體制備

在超凈工作臺上，取帶有4~6個莖節(jié)的脫毒馬鈴薯試管苗，切成帶1個腋芽的單節(jié)莖段，轉(zhuǎn)接到盛有40 mL經(jīng)過高壓滅菌（121℃，30 min）的固體MS培養(yǎng)基、容積為150 mL的三角瓶中。將三角瓶放于培養(yǎng)室中，在溫度（22±1）℃、光照強度3 000 lx、光照時間14 h/d條件下培養(yǎng)，待試管苗長至4~5個莖節(jié)時，在相同條件下進(jìn)行擴繁。

表1　誘導(dǎo)愈傷正交試驗因素編碼Table 1Code for callus induction in L16(45)orthogonal experiment

表2　誘導(dǎo)芽分化正交試驗因素編碼Table 2Code for bud differentiation in L16(45)orthogonal experiment

1.3.3愈傷組織誘導(dǎo)與芽分化

以生長健壯的試管苗莖段為外植體材料，在無菌條件下將其切成長度約0.5 cm的莖段（不帶腋芽），將切段以平鋪的方式均勻接種到不同激素配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每處理接3皿，每皿22個莖段，在溫度（22±1）℃、光照強度3 000 lx，光照時間14 h/d條件下培養(yǎng)28 d，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，篩選出最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將最佳培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到16個誘導(dǎo)芽分化的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每處理接3皿，每皿8個愈傷，進(jìn)行芽分化誘導(dǎo)，觀察其不定芽分化情況并統(tǒng)計芽分化率，確定最佳芽分化培養(yǎng)基。在同樣的條件下培養(yǎng)芽長至1~2 cm時，將生長粗壯的小苗切下轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。

愈傷率（%）=愈傷化外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100

分化率（%）=分化芽數(shù)/總外植體數(shù)×100

1.3.4數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行基本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，用DPS v6.55版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行差異顯著性分析，處理平均數(shù)的多重比較采用LSD法。

2　結(jié)果與分析

2.1愈傷組織誘導(dǎo)

‘隴薯11號’莖段在16個正交設(shè)計組合中接種10 d后，部分處理上開始形成愈傷組織。有些兩端膨大明顯，呈啞鈴狀，顏色鮮綠色或淡黃色，表面光滑，質(zhì)地較致密；有些兩端膨大不明顯，結(jié)構(gòu)疏松，整體形狀不良；有些表面形成瘤狀突起、質(zhì)地較疏松；有些則生成長短不一的根（圖1）。

圖1　‘隴薯11號’莖段誘導(dǎo)愈傷組織Figure 1Callus induced from stem segments of'Longshu 11'

表3　‘隴薯11號’愈傷組織誘導(dǎo)的L16（45）正交試驗結(jié)果Table 3Results of callus induction in L16(45)orthogonal experiment of'Longshu 11'

不同濃度激素組合對‘隴薯11號’愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表3。直觀分析結(jié)果表明，4種激素誘導(dǎo)愈傷組織形成的能力由強到弱依次為：GA3> 6-BA>2,4-D>NAA，即GA3對愈傷組織的形成影響最大，可顯著促進(jìn)愈傷組織的形成，6-BA和2,4-D的影響次之，NAA的影響最弱。為尋求最佳質(zhì)量濃度的激素組合，進(jìn)行了方差分析，結(jié)果表明，處理11極顯著地高于其他處理，誘導(dǎo)率達(dá)98.72%，形成的愈傷呈深綠色、表面光滑、啞鈴狀、質(zhì)地致密；其他處理間比較，處理4和6之間無極顯著差異，但差異達(dá)到顯著性水平；而處理6和8，2和3，14、13、7、9和12之間既未達(dá)到極顯著水平，也無顯著差異；7、9、12、15、5和16，15、5、16和1之間無極顯著差異，處理7、9、12之間，15、5、16之間以及16和1之間無顯著差異，而處理7、9、12顯著大于15、5、16，處理15、5顯著大于1，處理10極顯著高于其他處理，誘導(dǎo)率為84.94%，但處理11的誘導(dǎo)率極顯著高于處理10，而且形成的愈傷顏色深，質(zhì)地更為致密。綜合考慮各方面的因素，GA3的濃度取A3， 6-BA的濃度取B3，2,4-D的濃度取D2，NAA的濃度取C1。最后根據(jù)正交試驗的原則可得出4種植物激素的最佳配比為A3B3C1D2，即MS+GA3（7.5 mg/ L）+6-BA（2.5 mg/L）+2,4-D（0.5 mg/L），誘導(dǎo)率為98.72%。

2.2芽分化

用激素組合A3B3C1D2誘導(dǎo)‘隴薯11號’的莖段，待愈傷組織長出后，轉(zhuǎn)接到16種不同處理的誘導(dǎo)芽分化的培養(yǎng)基上，部分組合可誘導(dǎo)出不定芽（圖2）。

對‘隴薯11號’分化率誘導(dǎo)的正交試驗結(jié)果見表4。直觀分析結(jié)果表明，4種激素對‘隴薯11號’誘導(dǎo)分化的能力由強到弱依次為：IAA>GA3> NAA>KT，可看出，IAA的存在對不定芽的形成影響最大，GA3的影響次之，NAA和KT的影響最弱。為尋求最佳濃度的激素組合，進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，處理6、8、16之間無極顯著差異，其中處理6與8無顯著差異，8與16無顯著差異，但6與16差異顯著；處理8、16、9和14之間，16、9、14和1之間，9、14、1和10之間，10、13和4之間，13、4、15和5之間，4、15、5、2和12之間均無極顯著差異，而處理2、12和7之間以及7、11、3之間既無極顯著差異也無顯著差異。綜上說明處理6和8均是促進(jìn)不定芽形成的最優(yōu)組合，但考慮到培養(yǎng)基中植物激素添加的種類越少越好的原則，選擇處理6為最佳組合，其4種植物激素的最佳配比為C2E2F1G4，即MS+NAA（0.25 mg/L）+IAA（0.1 mg/ L）+KT（3.0 mg/L），誘導(dǎo)率為95.83%。

圖2　‘隴薯11號’愈傷誘導(dǎo)芽分化Figure 2Bud induction from callus of'Longshu 11'

2.3生根培養(yǎng)

分化出來的健壯小苗在不含任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，14 d左右即可觀察到根的發(fā)生，誘導(dǎo)不定芽生根率為100%（圖3）。

表4　‘隴薯11號’不定芽誘導(dǎo)的L1（645）正交試驗結(jié)果Table 4Results of bud differentiation in L16(45) orthogonal experiment of'Longshu 11'

圖3　‘隴薯11號’誘導(dǎo)生根Figure 3Rooting from shoot of'Longshu 11'

3　討論

通常馬鈴薯的3種器官均有再生能力，分別為愈傷組織再生途徑、不定芽再生途徑和體細(xì)胞胚胎再生途徑。馬鈴薯再生體系中以愈傷組織再生途徑運用最多，采用的外植體主要有葉片、莖段、原生質(zhì)體等。楊瓊芬等[9]以8個馬鈴薯品種（系）為試驗材料，進(jìn)行了葉片離體再生研究，誘導(dǎo)出了愈傷組織并獲得了再生植株。崔海辰等[4]以‘東農(nóng)303’脫毒試管薯為外植體，接種在添加了ZT和IAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出了愈傷組織并再生植株。在成功培養(yǎng)出馬鈴薯再生植株的報道中，基本培養(yǎng)基MS是被普遍應(yīng)用的。但在培養(yǎng)過程的不同時期，研究者們對激素種類和濃度進(jìn)行了優(yōu)化，得到了適合不同馬鈴薯的最優(yōu)組合。胡霞[10]用MS＋6-BA（2.5 mg/L）＋NAA（0.5 mg/L）＋GA3（3 mg/L）＋2,4-D（0.5 mg/L）培養(yǎng)基從馬鈴薯品種‘LK99’試管苗莖段上誘導(dǎo)出了胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率高達(dá)91.58%，生長狀態(tài)良好。王憲[11]以適應(yīng)長日照的原始二倍體栽培種‘富利亞’和‘窄刀薯’雜種無性系試管苗為材料，分別以葉片、莖段為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果表明適合‘富利亞’和‘窄刀薯’雜種葉片愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA（1.0 mg/ L）+IAA（0.1 mg/L）+GA3（2.5 mg/L），適合其莖段愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA（5.0 mg/L）+ IAA（0.1 mg/L）+GA3（5.0 mg/L），同時表明莖段愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化比葉片愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化容易。本試驗用‘隴薯11號’莖段作為外植體，篩選出了適合‘隴薯11號’的最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合MS+ GA3（7.5 mg/L）+6-BA（2.5 mg/L）+2,4-D（0.5 mg/ L），將生長狀態(tài)優(yōu)良的愈傷組織接種至MS+NAA（0.25 mg/L）+IAA（0.1 mg/L）+KT（3.0 mg/L）培養(yǎng)基上時，分化率最高且分化出的小苗顏色鮮嫩，生長健壯，是適合‘隴薯11號’不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

本研究應(yīng)用正交試驗設(shè)計，確定了馬鈴薯品種‘隴薯11號’用莖段誘導(dǎo)愈傷組織和芽分化的最佳激素配比，結(jié)果表明馬鈴薯莖段在愈傷誘導(dǎo)和芽分化這2個階段所需的生長激素種類和質(zhì)量濃度有很大差異，在互作效應(yīng)的影響下，最佳激素水平的組合并不是每種單因素最佳水平的組合。這為以后利用馬鈴薯莖段進(jìn)行離體快繁提供了理論依據(jù)，而且可以作為馬鈴薯基因轉(zhuǎn)化的載體。

[1]高志民.我國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略啟動[N].人民政協(xié)報, 2015-01-08(7).

[2]柳蓉.馬鈴薯的再生及其再生植株遺傳穩(wěn)定性研究[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[3]秦敏,郜剛.馬鈴薯再生體系的建立及其遺傳分析[J].中國馬鈴薯,2005,19(5):18-21.

[4]崔海辰,董磊,陶龍鑫,等.馬鈴薯再生體系的建立[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2012,33(4):131-135.

[5]賈小霞,文國宏,齊恩芳,等.馬鈴薯新品種隴薯10號再生體系的建立[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,2013(11):5-7.

[6]鮑紅春,李小雷,王建平,等.馬鈴薯品種隴薯5號莖段再生體系的建立[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2014(2):31-32.

[7]齊恩芳.馬鈴薯再生體系建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)AcInv反義基因轉(zhuǎn)化[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[8]張燕.正交試驗簡介[J].上海農(nóng)業(yè)科技,1977(19):5-8.

[9]楊瓊芬,盧麗麗,潘哲超,等.馬鈴薯葉片愈傷組織再生體系的建立[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012,25(3):1001-1004.

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[11]王憲.二倍體馬鈴薯再生體系建立及耐鹽愈傷組織的篩選[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

Construction of Regeneration System for Potato Variety'Longshu 11'

CHEN Xiaoyan1,MENG Yaxiong1,JIA Xiaoxia2,ZHANG Wu2,LIU Shi2,GUO Yumei3,QI Enfang2*
(1.College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.Potato Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China;3.Gansu Agriculture Technology College,Lanzhou,Gansu 730070,China)

ract:L16(45)orthogonal design was adopted to select the optimal plant hormone combination for regeneration of'Longshu 11'potato stem.Four plant hormones(callus induction with GA3,6-BA,NAA and 2,4-D,and bud differentiation with GA3,NAA,IAA and KT)were applied at four different levels to study their influences on the growth and differentiation of potato stem calli.The results indicated that the optimal medium for callus induction from stem was MS+GA3(7.5 mg/L)+6-BA(2.5 mg/L)+2,4-D(0.5 mg/L),with 98.72%induction percentage and the best growth status;the optimal medium for inducing bud differentiation from stem calli were found to be MS+NAA(0.25 mg/L)+IAA (0.1 mg/L)+KT(3.0 mg/L),with 95.83%induction percentage of adventitious buds and strong seedling.

rds:Longshu 11;explant;callus induction;bud differentiation;plant hormone;orthogonal experiment

S532

B

1672－3635（2016）02-0065-05

2015-07-22

國家自然科學(xué)基金（31360353）；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目（GNSW-2014-13）。

陳曉艷（1989-），女，碩士研究生，研究方向為抗病毒馬鈴薯的研究。

（Corresponding author）：齊恩芳，副研究員，主要從事馬鈴薯組培脫毒及品種資源研究，E-mail:qefang@126.com。